Summary
Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.
Abstract
Antikörper spielen eine entscheidende Rolle bei der Kopplung der angeborenen und der adaptiven Immunantwort gegen virale Erreger durch Antigen-bindenden Domänen und Fc-Regionen. Wir beschreiben hier, wie die Aktivierung gemessen Effektor-Funktionen durch monoklonale Antikörper gezielt die Influenza Virus Hämagglutinin mit dem Einsatz einer gentechnisch Jurkat-Zelllinie, die mit dem Ausdruck einer Aktivierung Art von Fc 1. Fc-FcγR. mit dieser Methode, die Beitrag der spezifischen Fc-FcγR-Wechselwirkungen durch Immunglobuline übertragenen kann durch ein in-vitro- Test bestimmt werden.
Introduction
Immunität von der saisonalen Grippe-Impfstoff zur Verfügung gestellt wurde traditionell durch Hämagglutination Inhibition (HI) Assay1bewertet, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf die Rezeptor-Bindungsstelle des das Hämagglutinin misst. Diese HI-aktive Antikörper sterilisieren Immunität verleihen können, aber sind in der Regel eng in ihrer Breite von Schutz, bietet Immunität gegen nur eine ausgewählte einige Stämme des Influenza-Virus. Die Isolierung und Charakterisierung von weitgehend reaktiven monoklonalen Antikörpern, die das Hämagglutinin (HA) erkennen schlagen vor, dass die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs in Reichweite2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. ist eines der Hauptziele des universellen Grippeimpfstoffs induzieren eine starke Antikörperantwort auf die konservierten Bereiche des Influenza-Virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. im großen und ganzen Antikörper, die diese konservierten Epitope, bestehend aus neutralisierende und nicht neutralisierende Antikörper17,18erkannt haben gezeigt, dass Fc-FcγR Interaktionen für erfordern optimale Schutz in Vivo und Highlight des Beitrags der Fc-vermittelten Immunität gegen die allgemeine Immunantwort auf Influenza Virus19,20.
Korrelate des Schutzes sind entscheidend bei der Beurteilung der Immunität gegen Infektionen. Diese Metriken ermöglichen Wissenschaftlern und Klinikern, die Wirksamkeit von Impfstoffen, die Bedeutung der Daten und der Verlauf der Behandlung zu schätzen. Das einzige etablierte Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion ist die Hämagglutination Inhibition Assay. Ein Titer von 01:40 ist mit einer 50 % Reduktion des Risikos von Krankheit1,21 – und spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern, die Agglutination zu hemmen, indem Sie auf den Rezeptor verbindlich vor Ort auf den kugelförmigen Kopf des HA. Allerdings sei auch darauf hingewiesen, dass T-Zell-Reaktionen möglicherweise eine bessere Korrelat der Schutz gegen Influenza-Virus-Infektion bei älteren Menschen. Ein kürzlich veröffentlichten Bericht zufolge Interessanterweise Neuraminidase Hemmung Tätigkeit ein besserer Prädiktor der Immunität gegen Grippe22sein kann. Glücklicherweise Tests typische in-vitro- , wie z. B. Neutralisation oder Neuraminidase Hemmung Assays HA Stiel oder Neuraminidase-spezifische Antikörper messen können. Die meisten dieser konventionellen in-vitro- Tests jedoch nur berücksichtigen sowohl die Funktion des Antigen-Bindung-Region des Antikörpers und Messen nicht die Rolle der Fc-Region. Darüber hinaus sind der Beitrag der nicht neutralisierende Antikörper, die über Fc-Rezeptor Engagement in Vivo zu schützen nicht erkannten17,18. Um Schutz durch Antikörper, die Fc-vermittelten Immunität wie Antikörper abhängige Zelle vermittelten Zytotoxizität (ADCC) induzieren zu messen, braucht man ein robuste in-vitro- Assay.
Die unten beschriebene Methode beurteilt die Fähigkeit von murinen monoklonalen Antikörpern, Fc-vermittelten Funktionen durch den Einsatz von gentechnisch veränderten Jurkat Zell-Linie mit dem Ausdruck einer Aktivierung induzieren Murine Typ 1 FcR, FcγRIV. Antikörper-Engagement von der FcγR transduces intrazellulären signalisieren, dass Trigger nuklearen Faktor der aktivierten T-Zellen vermittelten Luciferase-Aktivität. Der Test hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken, die Isolierung und Kultur der primären Effektorzellen und die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Aktivierung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen19,23,24 Erkennung erfordern ,25,26. Erstens kann das Protokoll hier beschriebenen leicht verschiedene virale Ziele, FcγRs und Antikörper verschiedener Arten (menschliche und murine) integrieren angepasst werden. Zweitens die Verwendung einer modifizierten Jurkat-Zelle Zeile zum Ausdruck zu bringen, die eine FcγR mit einer Luciferase Reporter-gen unter einem nuklearen Faktor von aktivierten T-Zellen (NFAT) für einen Großformat-Assay ermöglicht, die mit einer Platte Reader Messung der Lumineszenz leicht analysiert werden können. Hier wird die traditionelle Aktivierung des primären Effektorzellen mit der Induktion von NFAT-Luciferase auf Antikörper Engagement von einer FcγR auf der Oberfläche der Zelle Jurkat ersetzt. 96-Well-Platte Format Assays kann für die Messung von bis zu vier verschiedene Proben in Triplicates mit sieben Verdünnungen – eine Reihe von Proben, die umständlich mit traditionellen Techniken werden könnte. Gibt es weitere Punkte, die mit dieser Assay, die das Design von Experimenten und die Interpretation der Daten beeinträchtigen können. Das virale Ziel muss auf der Zelloberfläche in Reihenfolge für die Antikörper Anerkennung ausgesprochen werden. Um dies zu mindern, kann das Ziel-Antigen (z.B. eine interne virale Proteine) direkt auf die Oberfläche der Platte beschichtet werden. Allerdings hat dies noch nicht rigoros getestet. Darüber hinaus die modifizierte Zellinie Jurkat drückt nur eine Art der Aktivierung FcγR und drückt keine hemmenden FcγRs während Primärzelle Linien alle Rezeptoren in einem physiologischen Kontext auszudrücken.
Wir haben zuvor dieser Assay verwendet, um zu zeigen, dass Epitop-Spezifität in einem polyklonalen Kontext eine entscheidende Rolle spielt bei der Regulierung der Fc-vermittelten Effektor-Funktionen und optimale Aktivierung des Antikörper-abhängige zellvermittelte Reaktion zwei Punkte erfordert wenden Sie sich an27,28. Hier beschreiben wir eine Methode, die bewertet die Fähigkeit von Stiel-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu engagieren und aktivieren die Murine FcγRIV aktivieren. Zwar gibt es Ausnahmen29,30, eine große Anzahl von weitgehend Antikörper Ziel antigenetisch erhaltenen Stiel und Umgebung das Hämagglutinin und somit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer universellen Grippe Impfstoff.
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Protocol
Die Experimente in diesem Manuskript vorgeformt wurden folgende Icahn School of Medicine der institutionellen Code von Ethik und Vorschriften durchgeführt.
1. Ausdruck des Influenza-Virus Hämagglutinin über Transfektion oder Infektion
Transfektion:
- Platte menschlichen embryonalen Niere (HEK 293T) Zellen bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte und lassen Sie es für 4 h in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO2).
- Transfizieren Zellen mit 100 ng der DNA Kodierung für virale Hämagglutinin und 0,2 μl Transfection Reagens pro Bohrloch in einem Gesamtvolumen von 50 μL.
Hinweis: Beide Plasmid und Transfectant Reagenz 1 x Opti-Minimum wesentlichen Medien (MEM) reduziert Serum Medium verdünnt werden. - Entfernen Sie nach Platten in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2 für 18 h Inkubation, Transfektion Medium.
(2) Infektion
- Platte A549 oder Madin Darby canine Nieren-Zellen bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Brunnen in einer weißen Gewebekultur wachsen mindestens 18 Stunden in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO2und 96-Well-Platte behandelt.
- Verdünnten Virus in 1 x MEM und infizieren Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 3, 1 oder 0,33 für 1 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2. Gesamtvolumen sollte 100 μL entsprechen.
Hinweis: 10 X MEM wird verdünnt mit Wasser zu einer 1 x MEM arbeiten Lager für die oben genannten Virus-Verdünnung. - Nach der Infektion, entfernen das Inokulum und 100 μl 1 x MEM in die Platte in der Abwesenheit von Trypsin.
- Wachsen Sie infizierte Zellen für 18 bis 24 h in einem Inkubator 37 °C mit 5 % CO2.
3. Beurteilung der FcRg/NFAT-vermittelte Aktivierungs der Luciferase-Aktivität durch monoklonale Antikörper oder Sera
- Zunächst ersetzen Sie Wachstumsmedien transfizierte oder infizierten Zellen mit 25 µL Assays Medien (1 X RPMI 1640 ergänzt mit 4 % (Vol/Vol) niedrige IgG fetalen bovine Sera).
- Durchführen Sie in eine separate 96-Well-Platte vierfach Verdünnungen der Antikörper des Interesses ab 30 μg/mL mit Hilfe der Assay-Medien. Verdünnungen in Triplicates durchführen und eine Beispiel-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, ein Steuerelement, das Antikörper (keine Antikörper-Kontrolle) ausschließt sowie ein Hintergrund-Steuerelement (Testpuffer allein).
Hinweis: für beide der "keine Antikörper" und Hintergrund-Kontrollen, fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Antikörper. - Übertragen Sie 25 μL der seriell verdünnten Antikörper von Schritt 3.2 in entsprechenden Vertiefungen auf Platte transfizierten Zellen oder infizierten Zellen.
- Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 °C (mit 5 % CO2) für 15 min.
- Fügen Sie 25 μL der entsprechenden veränderten Effektor Jurkat Zelle murinen FcgRIV oder menschliche FcgRIIIa (75.000 von Zellen/weit) zum Ausdruck bringen. Gesamtvolumen für jede sollte gut 75 µL und der Start Endkonzentration des Antikörpers ist bei 10 µg/mL (Abbildung 1 b).
Hinweis: Für das Hintergrund-Steuerelement fügen Sie 25 µL Testpuffer statt Effektorzellen hinzu. Um Antikörper-abhängige zellvermittelte Phagozytose zu untersuchen, kann eine modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der menschlichen FcgRIIa verwendet werden. - Inkubieren Sie Platte in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 6 h.
- Tauwetter und warmen Luciferase Substratpuffer in einem 37 °C Wasser für ca. 1 h vor dem Gebrauch.
Hinweis: Um die Luciferase Substratpuffer machen, bereiten Sie lyophilisierter Luciferase Assay Substrat in Testpuffer zur Verfügung gestellt. Die rekonstituierte Substratpuffer kann bis zu sechs Wochen bei-30 °C bis-10 °C aufbewahrt werden. - Alle Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrolle 75 μl/Well der Luciferase Substratpuffer hinzufügen.
- Lesen Sie auf einem Luminometer.
- Falten-Induktion mit folgender Gleichung berechnen: Falten Induktion (induzierte Wert-Background-Wert) = / (keine mAb-Wert-Background-Wert).
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Representative Results
Wir konnten zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, aber nicht Kopf-spezifischen Kopf-spezifische mAb, PY102, konnte durch heraufregulierende CD107a und Interferon-γ-19primäre natürliche Killerzellen aktivieren. Um die Fähigkeit einer Stiel-spezifischen Antikörper, primären menschlichen NK-Zellen aktivieren zu modellieren, wir zeigen, dass ein Stiel-spezifische mAb, 6F12, robust aktivieren kann, die modifizierte Jurkat-Zelle mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV von ~ 14-fold. Auf der anderen Seite machen die Kopf-spezifische mAb, PY102 und die Kontrolle IgG nicht (Abbildung 2)28.
Um zu untersuchen, wenn die Multiplizität der Infektion (MOI) die Induktion von Jurkat-Zellen mit dem Ausdruck der murinen FcγRIV beeinflussen kann, infizierten wir MDCK Zellen mit X31 (ein Reassortant Influenza A Virus Ausdruck der Hämagglutinin und Neuraminidase von A/Hong Kong/1/68 (H3N2) Virus mit den internen Segmenten des A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)) mit einer MOI von 3, 1 oder 0,33. Vierundzwanzig Stunden später wurden Jurkat Zellen murinen FcγRIV und mAb auszudrücken 9H 10 hinzugefügt die infizierten MDCK-Zellen. In Abbildung 3zeigen wir, dass Zellen mit einer MOI von 3 infiziert die Lumineszenz ca. 3-fach höhere als MDCK-Zellen infiziert mit einer MOI von 0,33 hervorrufen können.
Abbildung 1 : Eine schematische Darstellung des eine Beispielanlage Platte und Zusammensetzung der experimentellen Gruppen. (A) die Start Konzentration für jede Probe Antikörper ist bei 10 µg/mL und seriell über die Platte (Spalte 1, Spalte 12) 4-fach verdünnt. Jede Probe erfolgt in Triplicates. Reihe G ist reserviert, für die keine mAb-Kontrolle und Zeile H Hintergrund. (B) Endvolumen für jede Versuchsgruppe vor Zugabe der Luciferase Substratpuffer ist 75 µL. Beachten ist haben die Probe und "keine mAb-Gruppen" 25 µL der Effektorzellen hinzugefügt, während der Hintergrund Kontrollgruppen 75 µL Assays Medien haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Induktion von modifizierten Jurkat Zellen mit dem Ausdruck FcgR durch einen Stiel Monoclonal Antikörper. A549 Zellen infiziert wurden mit A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) mit einer MOI von 3. Bei 24 Stunden post-Infektion, murine FcγRIV exprimierenden Jurkat Zellen in Kombination mit PY102, 6F12 oder ein IgG-Steuerelement hinzugefügt wurden. Induktion von Jurkat-Zellen wurden bewertet, durch Lumineszenz-Signal von Firefly Luciferase unter NFAT-Response-Element erzeugt. Fehlerbalken = Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Die Multiplizität der Infektion betrifft Induktion von einem Stiel-spezifischen Antikörper. MDCK-Zellen wurden mit X31 (H3N2) mit einer MOI von 3, 1 oder 0,33 infiziert. Bei 24 h post Infektion, FcgR exprimierenden Jurkat Zellen in Kombination mit 9H 10 (ab Verdünnung von 10 µg/mL) hinzugefügt. Induktion von Jurkat-Zellen wurden bewertet, durch Lumineszenz-Signal von Firefly Luciferase unter NFAT-Response-Element erzeugt. Fehlerbalken = Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht dem Benutzer die Fähigkeit eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers, der murinen FcγRIV zu messen. Das Ziel-Antigen, Influenza Virus Hämagglutinin, drückt sich auf der Oberfläche der Zellen nach der Infektion durch Viren oder Transfektion von Plasmid DNA. Der Test ist ein weiterer mit verschiedene Oberfläche ausgedrückt virale Proteine in Kombination mit anderen FcγRs (Menschen oder Murine) zugänglich. Darüber hinaus wir haben verwendet Sera Proben um zu beurteilen, die Fähigkeit von Antikörpern in einem polyklonalen Kontext, Fc-Effektor-Funktionen (Daten nicht gezeigt), induzieren die relevanteren Informationen bieten können, beim Studieren der adaptiven Immunantwort durch Infektion induziert oder Impfung. Wir spekulieren darüber, dass der Test geändert werden kann, um die Induktion von Antikörpern zu messen, die interne virale Proteine erkennen durch die Beschichtung direkt der Platten mit löslichen Proteinen. Jedoch wurde diese Methodik nicht rigoros getestet.
Induktion von Antikörper-abhängige Effektor-Funktionen kann betroffen von mehreren Faktoren ab, einschließlich aber nicht beschränkt auf der Effektor, Zielquote (Anzahl der Effektoren Zellen hinzugefügt pro Well), die Konzentration der Antikörper verwendet, die Länge der Ausbrütung zwischen Effektor und Ziel-Zellen und die Konzentration der niedrige IgG Serum in der Assay-Puffer verwendet.
Historisch, umfasst der standard Test zur Messung der zellulären Zytotoxizität Antikörper-abhängige Aktivität von Antikörpern oder polyklonalen Seren primäre natürlichen killer (NK) Zellen von Spendern geerntet. Engagement der FcγR und Aktivierung des intrazellulären Signalwegs richtet sich in der Regel durch den Ausdruck der Aktivierungsmarker CD107a und/oder IFN-γ19,23,24,31. Obwohl die klassischen Assay relevantere Effektorzellen verwendet wie sie nicht gentechnisch verändert worden sind, kann Spender Variante aufgrund allelic Unterschiede in den FcγR beeinflussen NK-Zell-Aktivierung und Variation von Charge zu Charge führen. Alternative Assays verwendet als Surrogate für ADCC Aktivität gehören eine FcγR Dimer-basierte ELISA oder ein Chrom-Release Assay25zu töten. Obwohl der Einsatz von einem FcγR Dimer-basierte ELISA Hochdurchsatz ist, der Test physiologisch relevanten möglicherweise nicht wie dieser Assay Effektor Zellen32nicht nutzt. Während Chrom-Release-Assay Maßnahmen töten direkt, es ist kein hoher Durchsatz und primäre NK-Zellen, die wiederum Spender angewiesen33erfordert. Eine neue Methode beschreiben die Verwendung von murinen T-Zell-Hybridomen stabil chimärer FcγR-CD3ζ Kette Moleküle und Maßnahmen-Aktivierung durch die Sekretion von IL-2 zum Ausdruck zu bringen. Der Test beschrieben ist vergleichbar mit der beschriebenen Methode hier, was nutzt eine modifizierte T-Zelle als Surrogat für eine Effektor-Zelle mit dem Ausdruck einer singulären Aktivierung FcγR34. Alternativ kann eine Zell-Linie (NK92.05-CD16) mit dem Ausdruck der FcγRIIIa als Effektor Zellen und Hochregulation des Antigens Degranulation verwendeten CD107a als eine Aktivierung Marker verwendet werden. Jedoch sollte die Verwendung von Virionen und virale Peptide auf ELISA-Platten auf die letztgenannten Protokolls hingewiesen, da Proteine auf hydrophoben Oberflächen beschichtet nicht immer die physiologische Struktur der Antigene35rekapitulieren können.
Die hier beschriebene Methode ist eine 96-Well-Format-Assay, macht physiologisch relevanten nutzen und nativ virale Ziele ausgedrückt und können für murine oder menschliche Antikörper modifiziert werden. Die gentechnisch veränderten Jurkat-Zellen in Kultur beibehalten werden können und36kryokonserviert. Obwohl derzeit die Effektorzellen nur eine aktivierende FcγR zum Ausdruck bringen, sollten die vielen Vorteile der Verwendung dieses Protokolls, die in dieser Studie beschriebenen berücksichtigt werden bei der Messung von Antikörper-abhängige zellvermittelte Effektor-Funktion.
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Disclosures
Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde teilweise mit Bundesmitteln aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases finanziert, National Institutes of Health, Department of Health And Human Services, unter CEIRS Vertrag P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
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