Summary
हम एक विधि का वर्णन करने के लिए एफसी के सक्रियकरण को मापने के लिए एंटीबॉडी कि लक्ष्य इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin द्वारा मध्यस्थ कार्य । यह परख भी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या polyclonal अंय वायरल सतह नच लक्ष्यीकरण के लिए एफसी मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रेरित की क्षमता का आकलन अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
एंटीबॉडी अपने प्रतिजन बाध्यकारी डोमेन और एफसी-क्षेत्रों के माध्यम से वायरल रोगजनकों के खिलाफ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं युग्मन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां, हम वर्णन कैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा एफसी प्रभाव के कार्यों के सक्रियकरण को मापने के लिए एक आनुवंशिक इंजीनियर Jurkat सेल लाइन एक सक्रिय प्रकार व्यक्त 1 एफसी-FcγR के उपयोग के साथ इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin लक्ष्यीकरण । इस विधि का प्रयोग करते हुए विशिष्ट एफसी-FcγR इम्युनोग्लोबुलिन द्वारा प्रदत्त बातचीत का योगदान एक इन विट्रो परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।
Introduction
प्रतिरक्षा मौसमी इंफ्लूएंजा वैक्सीन द्वारा प्रदान की परंपरागत रूप से hemagglutination निषेध (हाय) परख1है, जो एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि hemagglutinin के रिसेप्टर बाइंडिंग साइट लक्ष्य द्वारा मूल्यांकन किया गया है । ये उच्च सक्रिय एंटीबॉडी प्रतिरक्षा नसबंदी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन आम तौर पर सुरक्षा के अपने चौड़ाई में संकीर्ण कर रहे हैं, केवल एक का चयन कुछ उपभेदों के लिए प्रतिरक्षा प्रदान इंफ्लूएंजा वायरस । अलगाव और मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन है कि hemagglutinin पहचान (हा) एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा वैक्सीन के विकास का सुझाव है पहुंच के भीतर2,3,4, 5 , ६ , 7 , 8. एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा वैक्सीन के प्रमुख उद्देश्य से एक को इंफ्लूएंजा वायरस9,10,11,12 के संरक्षित क्षेत्रों की ओर एक मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्रेरित है , 13 , 14 , 15 , 16. मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी कि इन संरक्षित epitopes पहचान, दोनों बेअसर और गैर बेअसर एंटीबॉडी17,18, के लिए एफसी-FcγR बातचीत की आवश्यकता के लिए इष्टतम दिखाया गया है vivo में संरक्षण और एफसी के योगदान को उजागर प्रतिरक्षा19,20वायरस को समग्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए प्रतिरोधक क्षमता ।
संरक्षण के संबद्ध संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा का आकलन करने में महत्वपूर्ण हैं । इन मैट्रिक्स वैज्ञानिकों और चिकित्सकों टीकों की प्रभावकारिता का अनुमान है, डेटा का महत्व है, और उपचार के पाठ्यक्रम की अनुमति देते हैं । केवल स्थापित इंफ्लूएंजा वायरस संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के सहसंबंधी hemagglutination अवरोध परख है । 1:40 की एक titer बीमारी के जोखिम में एक ५०% की कमी के साथ जुड़ा हुआ है1,21 -और एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि रिसेप्टर बंधन हा के गोलाकार सिर पर स्थित साइट को लक्षित करने से समूहन को बाधित दर्शाता है. हालांकि, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि टी सेल प्रतिक्रियाओं एक बेहतर बुजुर्गों में इंफ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के सहसंबंधी हो सकता है । दिलचस्प है, हाल की एक रिपोर्ट से पता चलता है कि neuraminidase अवरोध गतिविधि प्रतिरक्षा का एक बेहतर कारक हो सकता है22इंफ्लूएंजा के लिए । सौभाग्य से, इस तरह के बेअसर या neuraminidase अवरोध परख के रूप में इन विट्रो परख में विशिष्ट उपाय कर सकते है हा डंठल या neuraminidase-विशिष्ट एंटीबॉडी । इन विट्रो परख में पारंपरिक के अधिकांश, तथापि, केवल खाते में एंटीबॉडी के प्रतिजन बंधन क्षेत्र के समारोह में ले और एफसी क्षेत्र की भूमिका उपाय नहीं है । इसके अतिरिक्त, गैर के योगदान को बेअसर एंटीबॉडी कि vivo में एफसी रिसेप्टर सगाई के माध्यम से रक्षा17,18का पता नहीं कर रहे हैं. आदेश में एंटीबॉडी कि एफसी मध्यस्थता उन्मुक्ति प्रेरित जैसे एंटीबॉडी निर्भर कोशिका मध्यस्थता cytotoxicity (ADCC), एक मजबूत इन विट्रो परख की जरूरत है द्वारा afforded सुरक्षा को मापने के लिए ।
नीचे वर्णित विधि murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से संशोधित Jurkat सेल लाइन एक सक्रिय murine प्रकार व्यक्त 1 FcR, FcγRIV के उपयोग के माध्यम से एफसी मध्यस्थता कार्यों प्रेरित । एंटीबॉडी सगाई FcγR transduces intracellular संकेत है कि सक्रिय टी कोशिकाओं के परमाणु कारक-मध्यस्थता luciferase गतिविधि से चलाता है । परख पारंपरिक तकनीक है कि अलगाव और प्राथमिक प्रभाव कोशिकाओं और प्रवाह cytometry के उपयोग की संस्कृति की आवश्यकता पर कई लाभ है एफसी के सक्रियकरण-मध्यस्थता प्रभाव का पता लगाने के लिए कार्य करता है19,23,24 ,25,26. सबसे पहले, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन वायरल लक्ष्य, FcγRs, और विभिंन प्रजातियों (मानव और murine) से एंटीबॉडी शामिल अनुकूलित किया जा सकता है । दूसरा, एक संशोधित Jurkat सेल लाइन का उपयोग सक्रिय टी के एक परमाणु कारक के तहत एक luciferase रिपोर्टर जीन के साथ एक FcγR व्यक्त-सेल (NFAT) एक बड़े प्रारूप परख कि आसानी से एक प्लेट luminescence मापने पाठक का उपयोग कर सकते है विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । यहां, प्राथमिक प्रभाव कोशिकाओं के पारंपरिक सक्रियकरण Jurkat सेल की सतह पर एक FcγR के एंटीबॉडी सगाई पर NFAT-luciferase की प्रेरण के साथ बदल दिया है । यह ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप परख triplicates में सात कमजोर पड़ने के साथ चार विभिंन नमूनों के माप के लिए अनुमति देता है-नमूनों की संख्या है कि पारंपरिक तकनीकों का उपयोग कर बोझिल हो सकता है । वहां अतिरिक्त अंक के लिए इस परख कि प्रयोगों के डिजाइन और डेटा की व्याख्या को प्रभावित कर सकते है के साथ विचार कर रहे हैं । वायरल लक्ष्य एंटीबॉडी मांयता के लिए आदेश में सेल सतह पर व्यक्त किया जाना चाहिए । इस को कम करने के लिए, लक्ष्य प्रतिजन (जैसे एक आंतरिक वायरल प्रोटीन) सीधे एक थाली की सतह पर लेपित किया जा सकता है. हालांकि, इस पर अभी तक कड़ाई से जांच नहीं की गई है. साथ ही, संशोधित Jurkat सेल लाइन FcγR को सक्रिय करने का केवल एक प्रकार व्यक्त करता है और किसी भी निरोधात्मक FcγRs व्यक्त नहीं, जबकि प्राथमिक सेल लाइनों एक शारीरिक संदर्भ में सभी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं ।
हम पहले इस परख का इस्तेमाल किया है प्रदर्शित करने के लिए कि एक polyclonal संदर्भ में epitope विशिष्टता एफसी मध्यस्थ प्रभाव कार्यों को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कि इष्टतम सक्रियण एंटीबॉडी-निर्भर सेल की मध्यस्थता प्रतिक्रिया के दो बिंदुओं की आवश्यकता है 27,28से संपर्क करें । यहां, हम एक तरीका है कि डंठल विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन संलग्न करने के लिए और FcγRIV सक्रिय murine सक्रिय का वर्णन । हालांकि वहां अपवाद है29,30, मोटे तौर पर प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या लक्ष्य antigenically hemagglutinin के डंठल क्षेत्र संरक्षित और इस तरह एक सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा टीका.
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Protocol
इस पांडुलिपि में बताए गए प्रयोगों का पालन Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन की संस्थागत आचार संहिता और विनियमों के तहत किया गया.
1. अभिकर्मक या संक्रमण के माध्यम से इंफ्लूएंजा वायरस Hemagglutinin की अभिव्यक्ति
अभिकर्मक:
- प्लेट मानव भ्रूण गुर्दे (HEK 293T) कोशिकाओं के एक घनत्व पर 2 x 104 कोशिकाओं का इलाज एक सफेद ऊतक संस्कृति में ९६-अच्छी तरह से थाली और यह 4 के लिए बैठते हैं एक ३७ डिग्रीसी मशीन में एच (5% CO2के साथ).
- वायरल hemagglutinin के लिए डीएनए कोडिंग के १०० एनजी के साथ Transfect कोशिकाओं और ५० μL की कुल मात्रा में प्रति अच्छी तरह से अभिकर्मक रिएजेंट के ०.२ μL ।
नोट: दोनों प्लाज्मिड और transfectant एजेंट 1x Opti-ंयूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) कम सीरम मध्यम में पतला कर रहे हैं । - 18 घंटे के लिए 5% सह2 के साथ एक ३७ डिग्रीसी मशीन में प्लेटें मशीन के बाद, अभिकर्मक मीडिया को हटा दें ।
2. संक्रमण
- प्लेट A549 या मडि़हान डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं के घनत्व पर 2 x 104 कोशिकाओं में एक सफेद ऊतक संस्कृति का इलाज ९६-अच्छी तरह से प्लेट और 5% CO2के साथ एक ३७ डिग्रीसी मशीन में कम से 18 ज के लिए हो जाना ।
- 5% कं2के साथ एक ३७ डिग्रीसी मशीन में 1 ज के लिए 3, 1, या ०.३३ के संक्रमण की बहुलता में 1x मेम और संक्रमित कोशिकाओं में वायरस पतला । कुल मात्रा १०० μL के बराबर होनी चाहिए ।
नोट: 10x मेम पानी के साथ पतला करने के लिए एक 1x मेम वायरस के ऊपर उल्लेख कमजोर पड़ने के लिए शेयर काम कर रहा है । - संक्रमण के बाद इनोक्युलम को निकालें और trypsin के अभाव में 1x मेम के १०० μL को प्लेट में डालें ।
- 5% कं2के साथ एक ३७ डिग्रीसी मशीन में 18 से 24 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं को विकसित करना ।
3. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या सीरा द्वारा Luciferase गतिविधि के FcRg/NFAT-मध्यस्थता सक्रियण का आकलन
- सबसे पहले, transfected या संक्रमित कोशिकाओं के 25 µ परख मीडिया के एल के साथ विकास मीडिया की जगह (1x RPMI १६४० 4% (vol/कम आईजीजी भ्रूण गोजातीय सीरा) के साथ पूरक ।
- एक अलग ९६ में अच्छी तरह से प्लेट, प्रदर्शन 30 μg/एमएल परख मीडिया का उपयोग कर ब्याज की एंटीबॉडी के चार गुना कमजोर पड़ने । triplicates में कमजोर पड़ने का प्रदर्शन और एक उदाहरण प्लेट लेआउट चित्र 1aमें सचित्र है । बनाने के लिए एक नियंत्रण शामिल है कि एंटीबॉडी (कोई एंटीबॉडी नियंत्रण) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पृष्ठभूमि नियंत्रण (परख अकेले बफर) सुनिश्चित करें ।
नोट: दोनों के लिए ' नहीं एंटीबॉडी ' और पृष्ठभूमि नियंत्रण, जोड़ें 25 µ परख के बजाय एंटीबॉडी के बफर एल । - transfected कोशिकाओं या संक्रमित कोशिकाओं की प्लेट पर इसी कुओं के लिए कदम ३.२ से प्रश्नपत्र पतला एंटीबॉडी के 25 μL स्थानांतरण ।
- एक ३७ डिग्रीसी मशीन (5% सह2के साथ) 15 मिनट के लिए में मशीन ।
- उपयुक्त संशोधित प्रभाव के 25 μL जोड़ें Jurkat सेल एक्सप्रेस murine FcgRIV या मानव FcgRIIIa (कोशिकाओं के ७५,०००/ प्रत्येक कुआं के लिए कुल मात्रा ७५ µ एल और एंटीबॉडी के प्रारंभिक अंतिम एकाग्रता 10 µ जी/एमएल (चित्र 1b) पर है होना चाहिए ।
नोट: पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए, 25 µ l के बजाय प्रभाव कोशिकाओं की परख बफ़र जोड़ें । एंटीबॉडी-निर्भर सेल-मध्यस्थता phagocytosis की जांच करने के लिए, मानव FcgRIIa व्यक्त एक संशोधित Jurkat सेल का उपयोग किया जा सकता है । - 6 एच के लिए 5% सह2 के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में मशीन ।
- गल और गर्म luciferase सब्सट्रेट बफर के बारे में एक ३७ °सी पानी में 1 के बारे में उपयोग करने से पहले एच ।
नोट: luciferase सब्सट्रेट बफर बनाने के लिए, प्रदान की परख बफर में lyophilized luciferase परख सब्सट्रेट का पुनर्गठन । गठित सब्सट्रेट बफर-30 डिग्रीसी करने के लिए छह सप्ताह के लिए-10 डिग्रीसेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । - पृष्ठभूमि नियंत्रण के अलावा सभी कुओं के लिए luciferase सब्सट्रेट बफर के ७५ μL/कुआं जोड़ें ।
- एक luminometer पर पढ़ें ।
- निंनलिखित समीकरण के साथ गुना प्रेरण की गणना: गुना प्रेरण = (प्रेरित मूल्य-पृष्ठभूमि मूल्य)/(कोई मॉब मूल्य-पृष्ठभूमि मूल्य) ।
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Representative Results
हम प्रदर्शन किया है कि एक डंठल विशिष्ट मॉब, 6F12, लेकिन सिर विशिष्ट एक सिर विशिष्ट मॉब, PY102, CD107a और इंटरफेरॉन γ19को विनियमित द्वारा प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को सक्रिय करने में सक्षम था । प्राथमिक मानव NK कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए एक डंठल-विशिष्ट एंटीबॉडी की क्षमता मॉडल करने के लिए, हम बताते हैं कि एक डंठल विशिष्ट मॉब, 6F12, मजबूती से संशोधित Jurkat murine FcγRIV द्वारा व्यक्त सेल को सक्रिय कर सकते हैं ~ 14-गुना. दूसरी ओर, सिर-विशिष्ट मॉब, PY102 और नियंत्रण आईजीजी नहीं (चित्रा 2)28।
अगर संक्रमण की बहुलता (MOI) की जांच करने के लिए Jurkat murine FcγRIV व्यक्त कोशिकाओं की प्रेरण को प्रभावित कर सकते हैं, हम MDCK के साथ X31 कोशिकाओं को संक्रमित (एक मिश्रित इंफ्लूएंजा एक वायरस के hemagglutinin और neuraminidase व्यक्त एक/हांग कांग/ 3, 1, या ०.३३ के एक MOI के साथ एक/पर्टो रीको/8/34 (H1N1)) के आंतरिक क्षेत्रों के साथ वायरस । चौबीस घंटे बाद, Jurkat कोशिकाओं murine FcγRIV और मॉब 9H10 व्यक्त करने के लिए संक्रमित MDCK कोशिकाओं के इधार जोड़ा गया । चित्रा 3में, हम 3 के एक MOI से संक्रमित कोशिकाओं ०.३३ के एक MOI से संक्रमित MDCK कोशिकाओं की तुलना में अधिक 3 गुना के आसपास luminescence प्रेरित कर सकते हैं कि दिखाते हैं ।
चित्र 1 : एक नमूना प्लेट लेआउट और प्रयोगात्मक समूहों की संरचना की एक योजनाबद्ध. (क) प्रत्येक एंटीबॉडी नमूना के लिए शुरू एकाग्रता में 10 µ जी/एमएल और प्रश्नपत्र पतला प्लेट भर में है (कॉलम 1 से कॉलम 12) 4-गुना । प्रत्येक नमूना triplicates में किया जाता है । पंक्ति G कोई मॉब नियंत्रण और पंक्ति H पृष्ठभूमि है के लिए आरक्षित है । (ख) luciferase सब्सट्रेट बफर के अलावा प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए अंतिम मात्रा ७५ µ एल है । नोट की, नमूना और ' कोई मॉब समूह ' है 25 µ प्रभाव कोशिकाओं के एल जोड़ा है, जबकि पृष्ठभूमि नियंत्रण समूहों ७५ परख मीडिया के µ एल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : संशोधित Jurkat कोशिकाओं की प्रेरण एक डंठल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा FcgR व्यक्त । A549 सेल 3 के एक MOI के साथ एक/पर्टो रीको/8/34 (H1N1) से संक्रमित थे । 24 घंटे के बाद संक्रमण, murine FcγRIV-एक्सप्रेस Jurkat कोशिकाओं के संयोजन में PY102, 6F12 या एक आईजीजी नियंत्रण के साथ जोड़ा गया । Jurkat कोशिकाओं की प्रेरण NFAT प्रतिक्रिया तत्व के तहत जुगनू luciferase द्वारा उत्पंन luminescence संकेत द्वारा मूल्यांकन किया गया । त्रुटि पट्टियां = मानक विचलन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : संक्रमण की बहुलता एक डंठल-विशिष्ट एंटीबॉडी की प्रेरण को प्रभावित करता है । MDCK कोशिकाओं X31 (H3N2) के साथ 3, 1, या ०.३३ के एक MOI के साथ संक्रमित थे । 24 एच पोस्ट संक्रमण में, 9H10 के साथ संयोजन में FcgR-व्यक्त Jurkat कोशिकाओं (10 µ g/एमएल के कमजोर पड़ने शुरू) जोड़ा । Jurkat कोशिकाओं की प्रेरण NFAT प्रतिक्रिया तत्व के तहत जुगनू luciferase द्वारा उत्पंन luminescence संकेत द्वारा मूल्यांकन किया गया । त्रुटि पट्टियां = मानक विचलन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां वर्णित विधि उपयोगकर्ता murine FcγRIV संलग्न करने के लिए एक हा विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की क्षमता को मापने के लिए अनुमति देता है । लक्ष्य प्रतिजन, इंफ्लूएंजा वायरस hemagglutinin, वायरस या प्लाज्मिड डीएनए के अभिकर्मक द्वारा संक्रमण के बाद कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की है । परख आगे अलग सतह का उपयोग करने के लिए उत्तरदाई है-अंय FcγRs (मनुष्य या murine) के साथ संयोजन में वायरल प्रोटीन व्यक्त की । इसके अतिरिक्त, हम एक polyclonal संदर्भ में एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए एफसी प्रभाव कार्य प्रेरित (डेटा दिखाया नहीं), जो अधिक प्रासंगिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं जब अनुकूली प्रतिरक्षा संक्रमण से प्रेरित प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए सीरा नमूनों का इस्तेमाल किया है या टीकाकरण. हम इसके अलावा अटकलें है कि परख के लिए एंटीबॉडी की प्रेरण कि सीधे घुलनशील प्रोटीन के साथ प्लेटों कोटिंग द्वारा आंतरिक वायरल प्रोटीन पहचान को मापने संशोधित किया जा सकता है । हालांकि, इस कार्यप्रणाली का कड़ाई से परीक्षण नहीं किया गया है ।
एंटीबॉडी-निर्भर प्रभाव कार्य की प्रेरण सहित कई कारकों से प्रभावित किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं करने के लिए प्रभाव लक्ष्य अनुपात (प्रभाव के प्रति कोशिकाओं की संख्या में अच्छी तरह से जोड़ा), एंटीबॉडी इस्तेमाल की एकाग्रता, के बीच गर्मी की लंबाई प्रभाव और लक्ष्य कोशिकाओं, और कम आईजीजी सीरम परख बफर में इस्तेमाल की एकाग्रता ।
ऐतिहासिक, मानक परख एंटीबॉडी या polyclonal सीरा के एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर cytotoxicity गतिविधि को मापने के प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा (NK) दाताओं से काटा कोशिकाओं शामिल है । FcγR और intracellular मार्ग के सक्रियकरण की सगाई आम तौर पर सक्रियण मार्करों CD107a और/या IFN-γ19,23,24,31की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित है । हालांकि शास्त्रीय परख और अधिक प्रासंगिक प्रभाव कोशिकाओं का उपयोग करता है के रूप में वे आनुवंशिक रूप से इंजीनियर नहीं किया गया है, दाता भिंनता FcγR में allelic मतभेदों के कारण NK सेल सक्रियकरण और बैच में परिवर्तन बैच में परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक ADCC गतिविधि के लिए किराए के रूप में इस्तेमाल किया परख एक FcγR डिमर-एलिसा या एक क्रोमियम की हत्या परख25पर आधारित शामिल हैं । हालांकि एक FcγR डिमर आधारित एलिसा का उपयोग उच्च प्रवाह है, परख शारीरिक रूप से इस परख के रूप में प्रासंगिक नहीं हो सकता है प्रभाव कोशिकाओं३२का उपयोग नहीं करता है । जबकि क्रोमियम जारी परख प्रत्यक्ष हत्या के उपाय, यह उच्च प्रवाह नहीं है और प्राथमिक NK कोशिकाओं की आवश्यकता है जो फिर से कर रहे है दाता पर निर्भर३३। हाल ही में एक विधि murine टी के उपयोग का वर्णन-सेल hybridomas छुरा chimeric FcγR-CD3ζ श्रृंखला अणुओं और उपाय सक्रियकरण एक्सप्रेस IL-2 के स्राव के माध्यम से । वर्णित परख यहां वर्णित विधि के समान है, जो एक प्रभाव सेल के लिए एक किराए के रूप में एक संशोधित टी सेल का उपयोग करता है एक विलक्षण सक्रिय FcγR३४व्यक्त । वैकल्पिक रूप से, एक सेल लाइन (nk 92.05-CD16) व्यक्त FcγRIIIa के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रभाव सेल और दानेदार बनाना प्रतिजन CD107a एक सक्रियण मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, बाद में प्रोटोकॉल पर एलिसा प्लेटों पर virions और वायरल पेप्टाइड्स का उपयोग hydrophobic सतहों पर लेपित प्रोटीन के रूप में उल्लेख किया जाना चाहिए हमेशा दोहराऊंगा प्रतिजनों की शारीरिक संरचना नहीं हो सकता है३५।
विधि यहां वर्णित एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप परख है, शारीरिक रूप से प्रासंगिक और natively वायरल लक्ष्य व्यक्त का उपयोग करता है और murine या मानव एंटीबॉडी के लिए संशोधित किया जा सकता है । आनुवंशिक रूप से संशोधित Jurkat कोशिकाओं को संस्कृति और cryopreserved३६में बनाए रखा जा सकता है । हालांकि वर्तमान में प्रभाव कोशिकाओं केवल एक सक्रिय FcγR व्यक्त करते हैं, इस अध्ययन में वर्णित इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के कई लाभ ध्यान में रखा जाना चाहिए जब एंटीबॉडी-निर्भर कोशिका मध्यस्थता प्रभाव समारोह को मापने.
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।
Acknowledgments
इस परियोजना के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग, CEIRS अनुबंध P01AI097092-04S1 (P.E.L.) के तहत संस्थानों से संघीय धन के साथ भाग में वित्त पोषित किया गया है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | Human embryonic kidney cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | Transfection reagent |
| 1X Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| White tissue culture treated 96-well plate | Corning, Inc. | 3917 | Assay plates |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell expressing murine FcgRIV | Promega | M1201 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIIa | Promega | G7010 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Jurkat cell expressing human FcgRIIa | Promega | G9901 | Kit provides includes cells, Bio-Glo Luciferase assay system, 1X RPMI and low IgG serum |
| Luminometer | BioTek | Synergy H1 Multi-Mode reader | Luminescence plate reader |
| Bio-Glo Luciferase Assay System | Promega | G7940 | Contains luciferase assay buffer and luciferase assay substrate |
| Madin Darby canine kidney cells | ATCC | CCL-34 | Canine kidney cells |
References
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