Summary
共焦荧光显微镜和激光微辐照提供的工具, 诱导 dna 损伤和监测的反应, dna 修复蛋白在选定的 sub-nuclear 地区。这项技术大大提高了我们对损伤检测、信号和招聘的认识。这份手稿演示了这些技术, 检查单和双链断裂修复。
Abstract
高度协调的 dna 修复通路存在检测、切除和替换受损的 dna 基, 并协调 dna 链断裂的修复。虽然分子生物学技术已经明确了结构, 酶的功能, 和修复蛋白的动力学, 仍然有需要了解如何修复是在细胞核内协调。激光微辐照为诱导 DNA 损伤和监测修复蛋白的招募提供了有力的工具。激光微辐照诱导 DNA 损伤可以发生在波长范围内, 用户可以可靠地诱导单链断裂, 基底病变和双链断裂的剂量范围。在这里, 激光微辐照用于检测由两个共焦激光波长, 355 nm 和 405 nm 诱导的单和双链断裂的修复。此外, 还描述了用于诱导特定损伤混合物的激光剂量的适当表征, 使用户可以性进行激光微辐照数据的采集和分析。
Introduction
荧光显微镜已经成为一种强有力的技术来可视化细胞结构, 检查蛋白质的定位, 并监测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA 相互作用。使用荧光显微镜研究 dna 损伤反应的应用后, 全球 dna 损害剂, 如紫外线 (UV) 光, 电离辐射, 化学氧化或烷剂, 和/或化疗提供了新的洞察dna 修复蛋白在 dna 损伤部位的启动、信号传导和招募1,2。然而, 这些全球性和异步破坏性事件的限制, 如果详细信息有关的招聘秩序, 动力学的联系或离解, 以及关键 DNA 修复蛋白之间的关系寻求。幸运的是, 在过去25年中, 激光扫描共聚焦显微镜的进步、损伤诱导激光波长的更广泛的可用性以及荧光蛋白的改进, 为研究人员提供了改进的工具。dna 修复方面, 通过靶向 dna 损伤诱导。
细胞与激光 microbeams 的辐射, 以研究细胞和亚单位功能是一个行之有效的工具, 在细胞和辐射生物学3。该技术在 dna 修复研究中的应用出现在郭理默和同事使用高度聚焦的紫外线 (257 nm) 激光微系统诱导中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞的0.5 µm 斑点的 dna 损伤时,4并建立了诱导这个系统的 DNA photolesions5。虽然在当时对 UV 微方法提供了显著的改进, 但由于它的专门设置和无法生成双链断裂 (DSBs)6, 因此采用这种破坏性系统是有限的。随后对各种紫外线-b (290-320 nm) 和紫外线 a (320-400 nm) 波长的研究表明, 紫外线化、氧化基底病变、单链断裂 (办学) 和 DSBs 可以诱导依赖于激光波长和电源应用4,7,8,9,10 (在3中进行了审阅)。此外, 这些紫外线-b 和紫外线-波长与敏感剂, 如脂, 尿 (BrdU) 和赫斯特染料, 也被发现, 以诱导 DNA 损害的波长, 功率和持续时间的暴露, 虽然需要的权力在这些代理11、12、13、14、15的存在中, 通常会降低诱导损坏。这些进步扩大了微辐照的使用, 尽管仍有技术上的障碍需要解决, 以便更广泛地采用这些方法。
郭理默和同事通过精确聚焦紫外线微, 在细胞内高度局部化的区域应用显著的破坏性能量, 显著地提高了微辐照的领域。随着共焦显微镜和激光显微切割系统的先进, 紧凑的聚焦光更广泛地接近;然而, 耦合 UV 源的范围和处理他们所诱发的色差仍然给大多数用户带来了重大挑战3,6,16。随着 uv 染料在整个二十世纪九十年代的普及, 能够聚焦和捕捉紫外激发荧光的光学变得更加广泛可用16, 并且激光扫描的改进为用户提供了创建高度聚焦紫外线的能力。单元格中的励磁点6,17。然而, 直到2000s 代初, 这种紧密聚焦光束与高强度激光结合的真正影响被认为是, 当大量的报告显示, DNA 链断裂可以诱导和没有剂在UV-一个范围6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25、26, 甚至在较长的可见波长 (如 488 nm27) 上。这些进步使微辐照技术在许多商业系统中得到更广泛的采用。与这些发展同时, 双光子技术也出现了, 允许精确诱导 DNA 损伤;虽然这些进展不会在这里讨论, 但有许多评论文章讨论这些方法9,28,29,30。
随着目前可利用的共焦显微镜能够提供高度聚焦的紫外线光和广泛的可用性荧光蛋白, 使 real-time 跟踪 DNA 修复蛋白, 微辐照技术已演变成检测 DNA 损伤反应和修复通路的强大工具。然而, 用户需要知道, DNA 损伤的产生高度依赖于激光波长和功率应用于 sub-nuclear 地区。使用紫外线-C (〜 260 nm) 波长允许直接 DNA 激发和高选择性的感应紫外线化7,8。紫外线-b 和紫外线-波长产生 DNA 损伤的混合物 (基底病变, 办学, 和 DSBs), 依赖于应用电源和蜂窝背景使用7。靶细胞内源性光敏和抗氧化剂水平能影响这些波长产生的 DNA 损伤混合物。此外, 外源光敏 (BrdU 等) 的使用可能有助于降低诱导 DNA 损伤所需的能量。然而, 这些药物可以自行诱导 DNA 损伤, 它们可能改变细胞周期和染色质结构, 因此它们的使用可能产生不需要被用户考虑的不良影响。因此, 在使用微辐照研究 dna 损伤反应和修复之前, 仔细考虑 dna 修复通路的兴趣, 可供使用的波长和 dna 损伤混合物所产生的需要。
在这里, 激光微辐照是在两个常用波长, 355 nm 和 405 nm, 没有剂, 以证明这些波长引起的 DNA 损伤的混合物, 以及这些损伤混合物对检查修复的影响办学和 DSBs. 用户应该知道, 这些波长不会产生一个单一的链断裂或基底损害物种。为了区分 dna 修复通路, 使用者必须仔细控制细胞核的特定区域的应用功率, 并利用多股断裂标记物和 dna 损伤抗体来表征诱导损伤。如果正确应用和表征, 激光微辐照可以丰富一些物种的 DNA 损伤, 允许用户评估修复的基础病变和办学或 DSBs, 具有一定的特异性。因此, 我们提供了一种允许用户性进行激光微辐照的方法, 表征了应用激光剂量诱导的 DNA 损伤混合物, 并进行了数据分析。
Protocol
1. 细胞培养和稳定细胞的生成
- 在最小必需培养基中生长 CHO-K1 细胞, 辅以10% 胎牛血清。在 5% CO 2 的湿恒温箱中维护电池, 在37和 #176; C.
- 染 CHO-K1 细胞与1和 #181; g 的质粒 DNA 含有人类 XRCC1 与 C 终端绿色荧光蛋白 (GFP) 标签使用商业转染试剂后, 制造商和 #39; s 指令.
- 选择 CHO-K1 细胞稳定表达人类 XRCC1-GFP 融合使用800和 #181; g-418 和丰富的 XRCC1-GFP 表达人口使用荧光辅助细胞分类 (外地). 在 coverglass 底的培养血管中,
- 平板细胞被微辐照, 因此它们在第二天达到大约75% 或更大的70-100。单元格之间的一些空格是可取的, 特别是如果使用注册返回到相同的图像字段 (如3.2 节所述).
2。显微镜设置
- 选择一个装有合适激光和光学的激光扫描共聚焦显微镜, 并控制微辐照/photostimulation 的软件。提出的实验使用激光扫描共聚焦显微镜, 已被修改, 包括 355 nm 激光, 光纤耦合到一个电流计活化 miniscanner 和控制使用制造商和 #39; s 控制和分析软件。该系统可以利用活化 miniscanner (355 nm 激光器) 或标准共焦振镜 (405 nm 激光器) 在用户指定的感兴趣区域 (ROI) 进行微辐照.
- 选择用于微辐照的波长, 确保微辐照光中的所有光学元件都适用于所选波长.
注: 所提出的系统使用40和 #215; 色差 (数值孔径 (NA) 1.2) 油浸物镜与紫外线滤光片共 355 nm 微辐照, 以及20和 #215; c-色差 (na 0.75) 使用标准共焦光干目标为405毫微米微辐照。20和 #215; 在设置中使用的目标与 355 nm 波长不兼容;因此, 我们使用了40和 #215; 仅适用于 355 nm。使用干性目标的破坏性允许免疫荧光协议在下游应用, 而无需清洗浸泡油, 这就是为什么我们在可能的情况下利用这一目标. - 为微辐照实验配置显微镜。为了保持实验之间的一致性, 指定用于每种微辐照的显微镜元件的标准化配置。如果可能, 将这些设置保存为显微镜和 #39 的操作软件中的预设.
注: 在所提出的系统中, 细胞是微辐照和成像使用单向扫描, 扫描分辨率的1024x1024 像素与1x 扫描变焦, 在帧率为每秒8帧 (fps), 并与针孔设置约4通风单位 (AU),已确定为 488 nm 激光器 (69 和 #181; m)。这个开放的针孔设置被选中, 以最大限度的光捕获的数量在每个图像, 允许使用较低的成像激光功率和减少漂白.
3。激光微辐照
- 将准备好的培养皿放置在显微镜舞台上, 并将其锁定到位。
- 如果可用, 请将腔幻灯片放在顶级孵化器中, 并保持37和 #176; C 与 5% CO 2 在损伤诱导期间。这一步是最重要的活细胞时差成像或长成像会话。否则, 将细胞置于显微镜下, 在室温下 (〜25和 #730; c) 中进行照射, 然后迅速将细胞返回到37和 #176 的恒温箱中; c 与 5% CO 2 .
- 注册图像字段以允许研究员在执行固定、染色或其他操作后返回到同一位置。使用经过编码、自动显微镜阶段或细胞培养 coverglass 的容器, 用蚀刻或标记的 XY 位置栅格来进行损坏的字段的注册。
- 如果使用软件映像注册, 请选择区域性容器的可识别特征 (即, 在井之间的 coverglass 或屏障的拐角处), 收集图像, 并记录 XY 位置。这将允许在示例准备之后对选定字段的 XY 位置进行对齐和注册.
- 如果使用手动注册, 请手动记录每个字段的网格或蚀刻位置, 小心地记录菜在舞台上的方向和位置.
- 如果没有可用于细胞培养容器的识别功能, 则通过对细胞形态和密度的目视检查来识别受损的区域。注意选择具有足够明显特征的字段, 以便在以后的映像中识别.
注意: 除非文化容器的方向和区域受到严格限制, 否则这可能会耗费大量时间来执行.
- 选择一个用于微辐照的字段, 并将该示例集中在一起。对于表达荧光标记蛋白的细胞, 在感兴趣的荧光通道中选择具有最大核截面的焦平面。对于没有表达标记的蛋白质的细胞, 或对于那些没有明确核定位, 相位对比或差分干涉造影 (DIC) 成像可以用来找到正确的焦平面.
#8203; 注意: 相位对比度和 DIC 成像的一个有用的特点是, 当焦平面通过样本时, 同一特征可能会根据相对焦平面出现光或暗。- 在细胞核内选择一个清晰的特征, 如核仁, 并在观察这种变化的同时, 上下移动焦平面。真正的焦平面将位于从光到暗的过渡。若要集中示例, 请选择所选特征具有最尖锐对比度的焦点平面.
- 注册感兴趣字段的位置。在显微镜软件中创建一个3x3 的像素平方 roi, 将这个 roi 放在一个被破坏的细胞的细胞核上, 并将这个 roi 设置为损害 roi.
- 收集损伤图像, 包括损坏 ROI 的位置。
- 对于不使用荧光蛋白的实验, 获取相位对比度或差分干涉对比度 (DIC) 明图像, 以识别和记录核损伤.
- 对于使用荧光蛋白的活细胞实验, 获取含有明的图像和感兴趣的蛋白质的荧光通道 (例如, 激光线 488 nm 用于 GFP 的激发, 激光线 561 nm 激发 RFP)。在使用 CHO-K1 XRCC1-GFP 的实验中, 488 nm 激光线激发的荧光与透射 DIC 明通道同时采集.
- 启动激光损坏。
- 在所提出的系统中, 用扫描损伤 ROI 的总时间来控制激光剂量。由于 355 nm 激光器的电流计在固定扫描速率下运行, 因此激光剂量是由重复扫描所选损伤 ROI 的时间控制的: 在这里提供的数据中, 微辐照在 355 nm 执行2和10秒.
- 相比之下, 通过调节扫描速率并对所选的损伤 ROI 进行一次扫描, 来控制 405 nm 激光剂量。在数据 p反感这里, 使用8和 0.5 fps 微辐照在 405 nm。扫描率为 8 fps 提供了较低的激光剂量比 0.5 fps, 因为激光花较少的时间在每个像素扫描期间。两种激光器都以100% 的功率运行。有关直接测量激光功率的说明, 请参阅3.7 节.
注: 每个单独的显微镜系统可能不同的激光功率是如何交付到一个指定的 ROI, 类似于 355 nm 和 405 nm 在提出的系统不同。用户将需要确定他们的显微镜系统的这个过程, 并报告这些参数在他们的方法部分. - 用于活细胞成像, 对明和荧光通道进行时差图像采集。调整时差的持续时间和频率以优化数据收集, 理想的方法是在实验的时间过程中捕获荧光蛋白在损伤 ROI 中的积累及其离解。使用 XRCC1-GFP 的实验每30秒收集一次图像20分钟.
#8203; 注意: 时差成像的频率可受荧光漂白的限制, 复杂的积累和离解分析。漂白可以通过观察未受损的细胞在时差和调整捕获条件, 以尽量减少在这些未受损细胞的荧光信号损失的评估。有些漂白可能是不可避免的, 因此使用者可以通过将受损细胞的荧光强度正常化到时差的每个帧中的未损坏细胞来补偿信号丢失。- 完成时间课程后, 请选择新的单元格字段以进行损坏或修复损坏的单元格, 以进行进一步分析, 如4节所述.
- 继续进行微辐照和时差成像, 直到达到所需的损坏单元格数量.
#8203; 注意: 我们建议每个选择的条件破坏10-25 细胞, 以评估细胞的非均质性, 以应对引起的损伤。虽然大多数共焦系统将允许用户在每次微辐照时损坏多个电池, 但这会引入交错损伤起始时间, 这会使大量细胞的峰值招聘时间和离解时间的分析复杂化。用于快速事件。在某些系统中, 多个 roi 的同时损伤诱导可能会降低每个独立 ROI 所接收到的激光剂量。因此, 除非用户直接处理这些计时/电源问题, 否则建议单独损坏单元格.
- 通过免疫荧光 (IF) 进行分析, 执行损坏, 或者立即修复单元格 (如4节所述), 或允许单元格修复选定的时间增量 (即1、5、10或 20 min)。在所需时间流逝后, 修复和染色细胞, 详见4节。
- 若要增加分析的总单元数, 请在区域性容器内损坏其他字段, 以生成 post-damage 响应的多时间过程。记录每个字段的 XY 位置以及损坏发生的时间。经过所需的总修复时间后, 修复和染色的细胞如下详述.
- 在观察选定剂量的蛋白质招募后, 测量并报告激光功率水平 post-fiber 和 post-objective, 以准确描述和报告激光剂量。我们使用紧凑的数字功率计和两个不同的光电二极管传感器头;一个直接耦合到激光光纤测量 post-fiber 输出, 另一台放在显微镜上测量 post-objective 输出。
- 要测量激光功率, 请将传感器置于所需的配置 (post-fiber 或 post-objective) 中, 并按上述方法执行微辐照, 同时记录电能表所做的测量。请注意, 功率计的采样率可能不够快, 无法捕捉非常快的微辐照事件, 因此可能需要运行多次迭代实验, 以确保电能表能够准确地检测到所应用的剂量.
注: 对于 355 nm 激光器, 我们测量了大约5兆瓦 post-fiber 和大约19和 #181 的平均峰值功率; W post-objective。对于 405 nm 激光器, 在30次迭代的循环中进行微辐照, 以克服功率计0.01 的最大采样率, 用2.4 和8帧每秒的扫描速度测量1.5 兆瓦和0.5 兆瓦的平均峰值功率分别.每一个电能表是不同的。用户将需要确定其各自的功率计的操作波长和采样率.
- 要测量激光功率, 请将传感器置于所需的配置 (post-fiber 或 post-objective) 中, 并按上述方法执行微辐照, 同时记录电能表所做的测量。请注意, 功率计的采样率可能不够快, 无法捕捉非常快的微辐照事件, 因此可能需要运行多次迭代实验, 以确保电能表能够准确地检测到所应用的剂量.
4。免疫荧光染色程序
- 通过染色分析链断裂感应。
- 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中用3.7% 甲醛 (警告) 固定细胞, 用于10分钟抽吸甲醛溶液, 用 PBS 洗涤3次。可以通过将 PBS 放回单元格来停止该协议, 并且这些单元可以存储在4和 #730; C 最多可保存1周.
注意: 甲醛是有毒和致癌的。按照机构环境健康和安全程序的指示, 佩戴适当的个人防护设备并处理有毒物质. - Permeabilize 细胞在 pbs 中使用 0.25% X-100, 在室温下为10分钟 (RT), 然后用 pbs 洗涤3次.
- 在 RT 中, 在含有1% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 PBS 中孵化30分钟, 阻止非特异性抗体结合.
- 孵育与 #947 的主要单克隆抗体; H2AX 和初级多克隆抗体对 53 bp-1 都稀释1:750 在 pbs 含有 1% BSA 1 h at RT, 然后洗涤3次 pbs.
- 用 alexa 孵育细胞488山羊 anti-mouse 和 alexa 546 山羊兔两个稀释1:2000 在 pbs 含有 1% BSA 为 1 h 在 RT, 然后用 pbs 洗涤3次.
- 用10毫克/毫升的 DAPI (4 和 #39; 6-Diamidino-2-吲, 警告) 在 pbs 中稀释为1:5000 分钟, 或使用可比较的核染料, 然后用 pbs 洗涤5次.
警告: DAPI 是有毒和诱变的。按照机构环境健康和安全程序的指示, 佩戴适当的个人防护设备并处理有毒物质. - 将 pbs 或 pbs + 0.1% 叠氮化钠 (警告) 放回染色的细胞上。协议可以在这里停止, 单元格存储在4和 #730; C 在数天内, 或者在5节中进行图像获取.
#8203; 注意: 叠氮化钠是有毒的。穿戴适当的个人防护设备, 并按照机构环境健康和安全程序的指示处理有毒物质.
- 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中用3.7% 甲醛 (警告) 固定细胞, 用于10分钟抽吸甲醛溶液, 用 PBS 洗涤3次。可以通过将 PBS 放回单元格来停止该协议, 并且这些单元可以存储在4和 #730; C 最多可保存1周.
- 通过染色分析基底病变或 DNA 加的诱导。
- 在-20 和 #176 中修复和 permeabilize ice-cold 甲醇 (警告) 中的单元格20分钟; C.
注意: 甲醇是有毒和易燃的。按照机构环境健康和安全程序的指示, 佩戴适当的个人防护设备并处理有毒物质. - 吸我thanol, 并允许样品完全干燥15分钟的协议可以在这里停止, 储存在-20 和 #730 的细胞; C 干最多3天.
- 水化 PBS 中的单元格为15分钟.
- 变性 DNA 使用 2 N HCl (警告) 为45分钟在 RT 和洗涤3次 PBS.
注意: HCl 具有腐蚀性。穿戴适当的个人防护设备, 并按照机构环境健康和安全程序的指示处理腐蚀性物质. - 中和在50毫米的三盐酸 pH 8.8, 5 分钟, 然后3冲洗与 PBS.
- 在 RT 中, 用5% 正常的山羊血清和0.1% 的 X-100 在 PBS 中孵育细胞, 在1小时内进行阻塞缓冲.
- 孵育 8-氧-2 和 #180 的主要抗体;-脱氧 (8-oxodG, 1:400) 或丁烷嘧啶二聚体 (方案, 1:1, 000) 的山羊血清阻断缓冲 1 h at RT, 然后用 PBS 洗涤3次.
- 在 RT 中, 使用 Alexa 488 山羊 anti-mouse 在山羊血清阻断缓冲液中孵育1:2000 倍的细胞, 用 PBS 洗涤3次.
- 在 pbs 中使用 1:5000 DAPI (10 毫克/毫升) 将细胞核 DNA 染色5分钟, 并用 pbs 洗涤3次.
- 如果使用腔 coverglass, 请将 pbs 或 pbs + 0.1% 钠叠氮化物放回染色细胞上。协议可以在这里停止, 单元格存储在4和 #730; C 在数天内, 或者在5节中进行图像获取.
- 或者, 在首选安装介质中安装单元格, 如果附加的 coverglass 可以放在培养容器的顶部。一旦固化, 装入的细胞可以储存在4和 #730; C 长时间.
- 在-20 和 #176 中修复和 permeabilize ice-cold 甲醇 (警告) 中的单元格20分钟; C.
5。免疫荧光实验的图像采集
- 用乙醇清洗培养容器的 coverglass 底部, 并将其放回共聚焦显微镜阶段。确保容器在舞台上的方位和位置对应于引起损坏时所记录的方位和位置。保护养殖容器, 确保最佳的注册和成像.
- 使用选定的注册技术查找以前的图像字段 (如3.2 所述)。
- 对于使用带有蚀刻网格的 coverglass 进行手动注册, 请将网格置于焦点并找到标识标记。然后使用记录的 XY 坐标定位损坏的单元格.
- 对于基于图像的自动注册, 请在步骤3.2.1 中找到用作参考的结构特征, 然后将当前的实时显微镜视图与所记录的图像尽可能紧密地对齐。对齐后, 测量当前 xy 显微镜阶段的位置, 并将其与参考图像的 xy 位置进行比较。两个位置之间的线性距离定义 X 和 Y 偏移量。将此偏移量应用于每个已记录的 XY 位置, 以标识包含所照射的单元格的图像字段。此偏移功能可在显微镜控制软件中自动执行或手动完成.
- 如果无法识别适当的注册点, 请通过扫描幻灯片并查找以前识别的单元格功能来手动定位单元格.
- 使用适当的显微镜设置获取图像以收集所有有污点的目标, 包括明图像 (在2.3 节中设置, 并集中在3.3 节)。在提出的实验中, 多通道图像收集使用下列励磁激光线和荧光: 405 nm (DAPI), 488 nm (alexa 488 和传输 DIC 明), 和 561 nm (alexa 546)。所有激光器通过单声光可调谐滤波器控制激光波长和功率的传输.
6。荧光蛋白在微辐照场所中的动态细胞图像分析
- 在图像分析应用程序 (即 NIS 元素或 ImageJ) 中打开获取的图像。如有必要, 结合预图像与时差图像, 生成一个单一的图像序列和前 post-damage 诱导。用户可以通过测量照射面积上荧光强度的变化来显示与整个细胞核内的荧光强度相比较 (见代表性结果 图 1 B).
- 对于每个要测量的单元格, 首先生成一个表示核的参考 ROI。在包含像素组成原子核的荧光信号上使用阈值算法, 然后将该区域转换为 ROI。如有必要, 可以使用明作为参考来手动绘制 ROI。调整时间过程中的 roi, 确保核区域准确地被 roi 覆盖, 并在每个帧的 roi 中报告荧光信号的平均荧光强度.
- 对于每个要测量的单元格, 创建一个6x6 像素 roi, 并将其置于时间过程的每个帧的损坏 roi 中。这个更大的 roi 现在是分析的损失 roi。报告每个帧的平均 ROI 荧光强度.
注意: 大多数商用图像分析软件都包含用于2D 对象跟踪的模块, 并且有许多用户开发的宏用于 ImageJ 或斐济, 以促进更快的工作流和更高的吞吐量 (请参见 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/). - 将平均损害 roi 荧光强度正常化为时差的每个帧的相应参考 roi。在这里, 平均核荧光强度被用作参考 roi (见代表性结果 图 1 ). #160; 正常化可以通过从平均值中减去平均参考 roi 荧光强度来执行。损害 roi 荧光强度, 或通过平均参考 roi 荧光强度除以平均损伤 roi 荧光强度.
注意: 如果在具有极低参考强度值的情况下使用, 则按除法进行规范化会产生不可预知的结果. - 对所有损坏的单元格重复, 以及至少两个控件, 未损坏的单元格。如果需要, 可以使用控制单元结果进行进一步的规范化.
- 图形化的强度值随着时间的推移显示了招聘动态的变化, 作为实验治疗的一个功能.
7。免疫荧光法检测蛋白质招募的图像分析
- 在图像分析应用程序中打开前和 post-damage 图像。损伤图像包含了用于微辐照的损伤 ROI。复制 ROI 并粘贴到 post-damage 图像中以确定目标单元格.
- 生成6x6 像素 roi, 用于分析蛋白质的招聘, 并将此 roi 放在损害 roi 的位置。这个更大的 roi 现在是分析的损失 roi。报告平均损害 ROI 荧光强度.
- 将平均损害 roi 荧光强度正常化为相应的参考 roi。这里, 被损坏的细胞的平均核荧光强度被使用作为参考 ROI (参见代表性结果 图 1 )。利用 DAPI 信号的阈值算法生成参考 roi, 以定义核, 然后将该区域转换为 roi。报告平均参考 ROI 荧光强度。从平均损伤 roi 荧光强度中减去平均参考 roi 荧光强度, 或通过平均参考 roi 荧光强度除以平均损伤 roi 荧光强度, 可以进行规范化.
注意: 如果在具有极低参考强度值的情况下使用, 则按除法进行规范化会产生不可预知的结果. - 对所有损坏的单元格重复上述操作, 并对至少两个控制单元执行相同的分析, 如上所述.
- 图形化强度值为每个被测量的微辐照事件的时间, 以显示的变化, 蛋白质招募或类型的 DNA 损伤作为一个功能的实验治疗.
Representative Results
诱导 DNA 损伤的表征
基底病变和断链的诱导依赖于所选择的核区域的激光剂量和使用7的细胞模型的细胞微环境。荧光蛋白融合到修复蛋白质, 如 XRCC1, 53BP1, Ku70, 或 Rad51, 提供有用的单和双链断裂标记, 以建立最小的能量所需的, 以看到在一个损害 ROI 的一个荧光蛋白的积累高于背景荧光9,19,31。一旦发现了诱发反应的条件, 就必须对该特定波长和剂量引起的损伤混合物进行表征。衰减的剂量和持续时间在使用的波长可以使用户最大限度地减少复杂损伤混合物的形成。低激光剂量在紫外线-一个范围已经证明产生主要办学和少量的基础病变, 适合研究 SSBR 和 BER 通路10,28。增加剂量产生更复杂的基底病变, 氧化和紫外线诱导, 并诱导更多的 DSBs7,10。虽然诱导一个单一物种的 dna 损伤是可取的检查特定的 dna 修复途径, 它更可能是用户诱导的 dna 损伤的混合物, 与特定的病变, 如办学比基底病变或 DSBs 更频繁。这类似于化学剂如过氧化氢 (H2O2) 或甲基磺酸甲酯 (MMS)32所引起的 DNA 损伤混合物。用户需要知道, 当他们报告的结果, 损害混合物可能发生, 并仔细描述的剂量和损害的诱导损伤现场是必要的, 以确保其结果的重复性和可比。
在微辐照研究中, XRCC1-GFP 常被用作诱导基底病变和办学9,28的标记。XRCC1 是一种支架蛋白, 在单边带修复 (SSBR) 和基础切除修复 (BER) 中起重要作用, 也参与其他修复途径, 如核苷酸切除修复 (耐)33,34,35.它在 dna 修复中起着重要的协调作用, 与许多关键蛋白相互作用, 包括聚 (ADP-核糖) 聚合酶 1 (PARP-1)、dna 聚合酶β (政客β) 和 dna 连接 III。我们利用 XRCC1-GFP 稳定表达的 CHO-K1 细胞, 以确定激光剂量所需的产生办学和 DSBs。我们首先确定了为每个波长诱导一个可观察的 XRCC1-GFP 招募所需的最小剂量 (图 1)。对于 355 nm 波长, 2 秒的停留时间超过定义的损害 roi 在该 roi 中生成了一个增加的荧光信号, 指示在背景中检测到的 DNA 损伤的诱导 (图 1a)。对于 405 nm, 需要 8 fps 扫描率, 以生成可观察到的对损坏 ROI 的招聘 (图 1A)。然后增加剂量 (十年代为355毫微米和 0.5 fps 为405毫微米) 创造更加强烈的损伤 ROI (图 1a)。
XRCC1-GFP 在诱导损伤部位的招募和保留, 然后通过时差成像监测。在 dna 损伤部位保留蛋白质可能表明正在进行的 dna 修复, 而从诱导损伤部位分离出的蛋白质通常被认为是完成 BER 或 SSBR 的标志。然而, 没有明确的证据将 XRCC1 与激光诱导的 DNA 损伤点的分离与修复完成联系起来。通过在整个核 (图 1B) 上测量的平均荧光信号, 通过报告受损 ROI 中的荧光信号的平均强度, 来测量损伤部位的蛋白质的招募。这种正常化有助于解决核信号中的强度波动, 尽管可以根据感兴趣的蛋白质的细胞分布来使用其他正常化技术。在这里, XRCC1 在核隔离舱内, 因此正常化到核区域测量信号的再分配到损伤 ROI。ROI 的平均荧光强度, 然后记录在时差中的每一个图像, 包括损伤图像, 并以图表的时间函数 (图 1C)。
然后, 我们进一步描绘了两个选定的激光剂量引起的损伤, 以检查 DNA 基底病变的形成。首先, 采用免疫荧光法对大体积紫外线引起的病灶的形成进行了探讨, 并以此为标志进行耐型病灶 (图 2a)。然后, 探讨了氧化诱导基底 lesion8-oxodG 作为 BER 型病变的标志物 (图 2B)。在两种波长 (2 s 为 355 nm, 8 fps 为 405 nm) 的低剂量照射下, 未观察到高剂量的损伤程度, 而两波长 (十年代为 355 nm 和 0.5 nm 为405纳米) 的高能治疗效果明显增加 在损坏 ROI 中观察到的信号 (图 2A)。对每个受损细胞的投资回报率平均强度的散射图显示了在波长和剂量上的损伤形成和检测的异质性, 这表明低剂量的高等级方案损伤可能存在于较低的程度, 但负荷可能不显著检测到更高剂量的应用。散还表明, 抗体检测效率低下, 可能会限制精确定量的损害混合物。
这是进一步强调检测氧化诱导 DNA 病变的标记 8-oxodG。没有明显增加的荧光信号在 8-oxodG 在激光波长或剂量使用 (图 2B) 中观察到的损伤 ROI。用于此工作的抗体与以前的出版物9、10、36一致;然而, 应该指出的是, 在观察 8-oxodG 的形成中可能有局限性, 有抗体37,38。确认缺乏氧化诱导病变也建议第二个标记, 如招募 8-嘌呤 dna Glycosylase (OGG1), 酶负责去除 8-oxodG 从 DNA10。我们没有观察到我们的 DNA 损伤部位的 OGG1 招募;然而, 低浓度的氧化诱导的 DNA 损伤的形成不能完全排除。
最后, 我们研究了 DSBs 的形成, 使用了两个标记, γH2AX 和 53 bp-1, 在失d 激光剂量的免疫荧光 (图 3 和 #38; 4)。γH2AX 通常用作链断裂标记, 但它的特异性为 DSBs 已经被质疑在许多报告39,40。此外, 它是一个磷酸化事件, 从链断裂的网站传播, 所以信号的定位到一个链断裂可以限制由于这种信号传播。因此, 结合γH2AX 与 53 bp-1, 可以更准确地评估在损害 ROI 中的争端形成。
γH2AX 和 53 bp-1 对微辐照的反应是波长和剂量的依赖性。低剂量 (2 s) 刺激在 355 nm 引起没有反应在5和 20 min, 和弱和可变的响应10分钟辐照 (图 3a) 两个标记。高剂量 (十年代) 355 nm 微辐照诱导增加的荧光信号在 5, 10, 和20分钟辐照后, 减少40分钟 (图 3B) 的损害 ROI。这些结果表明, 需要仔细滴定 355 nm 剂量, 以尽量减少 cross-stimulation 的修复路径, 证明了双链断裂标记γH2AX 在早期时间点 (#60; 20 分钟) 低剂量应用.
使用低 (8 fps) 和高剂量 (0.5 fps) 405 nm 激光刺激 (图 4) 进行了类似的实验。在这个波长上, 53 bp-1 和γH2AX 都观察到了在损伤 ROI 范围内荧光强度的显著积累, 无论应用剂量如何, 这表明这些剂量产生的是单双链断裂的复杂混合物, 几乎在诱导 DNA 损伤后立即 (图 4)。此外, 高剂量的 405 nm 显示, 泛核γH2AX 染色在10分钟的损害诱导 (图 4B, 底部) 的增加, 使检测的损害 ROI 难以报告, 而 53 bp-1 积累更包含在损坏 ROI 中。
这些结果清楚地表明, 405 nm 微辐照是不适当的监测 SSBR 或 BER, 和多标记的 dna 加和链断裂应使用, 以充分表征的诱导病变和 dna 修复反应。
XRCC1-GFP 招募和保留的剂量依赖性改变
一旦诱导的 dna 损伤被定性, 激光微辐照可以成为研究 dna 修复蛋白动力学的理想平台。XRCC1-GFP 的保留和离解动力学显示剂量依赖性 (图 1), 这不是意想不到的考虑到不同的损伤混合物的归纳由每个波长。最高辐照剂量 (十年代和 0.5 fps) 显示更高强度的 XRCC1-GFP 招募相对于较低剂量和更长的保留 XRCC1-GFP 在20分钟的时间课程 (图 1C) 的损害。这表明在355和405纳米的高剂量下产生的 DNA 损伤很可能在实验过程中没有得到解决, 这与争端处理标记、γH2AX 和 53 bp-1 (图 3 & #38 的外观和保留相一致; 4).
有趣的是, 较低的伤害剂量 (2 秒和 8 fps) 显示快速招募 XRCC1-GFP 的损伤地点和离解的 XRCC1-GFP 在实验时间过程中的预水平 (图 1C)。如果没有完整的损伤混合物的表征, 这可能导致结论, 办学和基底病变使用这些破坏性的条件完全解决。然而, 存在γH2AX 和 53 bp-1 在 40 min 为355毫微米和在 5 min 为405毫微米可能导致不同的解释。对于 355 nm 2 s 剂量, 损伤混合物可能主要是办学, 因此, 在40分钟的情况下, 争端检测标志的外观可能表明, 一些未病变可能导致 DSBs 或 DSBs 产生的这种能量是修复在较长的时间尺度。SSBR 和争端修复之间的时间刻度差异以前曾报告过28、41、42。同样, 405 nm 低剂量 (8 fps) 离解可能表明办学或办学的聚类迅速转化为 DSBs, 这已被注意到的高损伤微辐照和其他 DNA 损伤代理以前43,44,45。
这些结果突出说明了诱导损伤混合物的特性, 以及利用多种 dna 修复蛋白和标记物来解释诱导损伤部位的 dna 修复蛋白的招募和保留的重要性。
图 1.激光微辐照诱导 XRCC1-GFP 的招募。
(A) CHO-K1 细胞稳定表达 XRCC1-GFP 在损伤诱导前后照射和成像。箭头指示微辐照剂量的位置和规模酒吧是10µm. (B) 通过确定损害 ROI 中的平均萤光强度和对整个核的平均荧光强度的正常化来测量征聘。(C) 每个时差的形象都可以衡量征聘的动态。图代表两个独立的实验, 误差线代表 SEM (n=24)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.激光微辐照诱导核苷酸损伤。
CHO-K1 细胞受到激光微辐照, 并在损伤诱导后立即修复。免疫荧光检测的 8-oxodG 加。(A) 在染色后受损细胞中观察到的 ROI 平均荧光强度的散射图。底, 代表性图像的专业进修染色。箭头表示微辐照的位置, 刻度条为10µm (n=12)。(B) 8-oxodG 染色的代表性图像。箭头指示微辐照的位置和刻度条为10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.DNA 双链断裂标记反应 355 nm 微辐照剂量依赖性的方式。
CHO-K1 细胞受微辐照照射, 在 post-stimulation 的时间点固定。对γH2AX 和 53 bp-1 进行了免疫荧光检测。(A) 归一化损害 ROI 的散射图为未损坏和受损细胞测量的荧光强度。误差线代表 SEM (n=12)。(B) γH2AX 和 53 bp-1 染色的代表性图像。箭头表示微辐照的位置, 刻度条为10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4。DNA 双链断裂标记物对405纳米微辐照进行了强有力的响应.
CHO-K1 细胞受微辐照, 并固定在时间点指示后刺激。γH2AX 和 53 bp-1 的免疫荧光标记。(A) 归一化损害 ROI 的散射图为未损坏和受损细胞测量的荧光强度。误差线代表 SEM (n=12)。(B) γH2AX 和 53 bp-1 染色的代表性图像。箭头表示微辐照的位置, 刻度条为10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
使用这里描述的条件, 任何与 UV a 或 405 nm 激光的共焦显微镜, 无论是由制造商集成的还是由最终用户添加的, 都可能导致细胞细胞核内的 dna 损伤, 并允许将 dna 修复蛋白招募到诱发的 DNA 损伤被监测。但是, 正如在协议和代表性结果中指出的, 波长选择、应用功率和损伤特性都是用户首先必须解决的重要问题, 以便研究特定的 DNA 修复途径。此外, 在实验设计中还有其他的注意事项, 也必须由用户考虑。
为了监测在微辐照后的活细胞中蛋白质的行为, 必须建立荧光标记蛋白。可光谱分离的多种荧光蛋白的可用性提供了创建蛋白质融合的工具, 可用于表征细胞对诱导 DNA 损伤的反应。短暂转染的荧光蛋白的利益, 可以快速筛选的破坏性条件, 突变, 甚至抑制剂, 而稳定的转基因细胞提供更多的表达水平的控制, 并允许其他生物化学进行表征, 验证微辐照效果。光谱不同的荧光蛋白也可以在同一细胞中使用, 以监测同一通路内或不同通路中蛋白质之间的相互作用。荧光蛋白也消除了对每个感兴趣的蛋白质的特定抗体的需要, 并允许在诱导损伤后长时间内对蛋白质行为进行活体监测。
然而, 使用荧光蛋白也有缺点。没有基因的背景缺乏的蛋白质 (s) 的兴趣, 内源性蛋白质将与荧光标签的蛋白质竞争。将荧光标记与蛋白质的 N 或 C 末端结合, 可以改变蛋白质的折叠, 阻碍关键蛋白-蛋白质相互作用, 或阻断易位信号;改变职能和潜在影响招聘动态。在一些报告中, 荧光染色显示了在损伤站点28中内源蛋白的招募和保留时间明显不同, 这些影响已经被证实。使用瞬变转染或稳定克隆也可以改变观察到的反应, 通常是通过蛋白质表达水平的变化。此外, 在单一实验中使用多种荧光蛋白也可能改变招聘的动态, 如果蛋白质水平不平衡好, 或者如果招募更大的荧光标签的蛋白质阻止其他蛋白质的招募.最后, 荧光蛋白可以作为弱敏化剂, 增加活性氧的形成, 并有可能改变 DNA 损伤混合物诱发46,47。尽管有这些缺点, 荧光蛋白在研究 DNA 修复和微辐照方面提供了许多明显的优势, 如果用户能纳入适当的控制, 如这里描述的损伤特性, 他们可以提供新的洞察力到损伤反应和蛋白质-蛋白质相互作用3。
如果不需要活体细胞成像, 可以用免疫荧光法监测诱发损伤的反应。通过固定细胞在特定时间后损伤诱导和染色抗体特异的蛋白质和病变的利益, 静态快照的损伤诱导和招募和保留修复蛋白可以建立。抗体可以用来监测的招募多蛋白的兴趣和/或修饰修改诱导的 DNA 损伤反应。使用免疫荧光消除了对荧光蛋白的需要, 并允许对内源性蛋白质行为进行检查。但是, 这种方法也有其缺点。高度特异的抗体是必要的, 性和阻断程序需要优化, 以允许检测的招聘有足够的信号强度。固定过程不是瞬时的, 这种物理约束限制了这种方法的时间分辨率。绘制损伤诱导部位的图谱, 使细胞在染色后可以重新, 也会出现重大的挑战。在这项工作中使用的共焦显微镜允许基于图像的注册, 如上所述, 因此受损的细胞可以迁移高精度。如果阶段注册或蚀刻 coverglass 不可用, 时间投资涉及的搬迁细胞没有阶段登记, 再加上固有的延迟损伤诱导和图像招募, 可以使免疫荧光对某些用户没有吸引力。然而, 最准确和完整的微辐照实验设计将结合这些类型的方法, 同时使用荧光蛋白, 如所介绍的协议。
在这里, 使用活体细胞成像和免疫荧光技术来证明激光微辐照的效用。荧光染色使我们能够准确地检查 DNA 损伤的混合, 以及由每种激光能量引起的蛋白质的招募, 这使我们能够更好地解释在招募和保留 XRCC1-GFP 的观察到的改变。根据这些结果, 405 nm 激光器的使用应限于检查 BER 和 SSBR 蛋白。此外, 最佳的实验设计将包括在目标之后的功率测量, 对每一个细胞线的完整损伤混合物的描述, 以及在荧光标记蛋白质中观察到的招募和保留的验证荧光.显然, 设备、时间和成本考虑可能使某些用户无法进行这些优化的实验设计。然而, 这些元素的重要性在这里演示, 在开始微辐照实验时, 用户应该牢记这些因素。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢国家环境健康科学研究所的 Dr.. 威尔逊在这项工作中使用的细胞系。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| 355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
| Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
| Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
| Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
| Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
| CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
| Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
| XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
| Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
| Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
| 4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
| 8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
| Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
| Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
| Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
| Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
| Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
| Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
| Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| 37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
| HCl | Fisher | SA49 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
| Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
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