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Cancer Research

स्तनधारी कोशिकाओं में एकल और डबल किनारा तोड़ने की मरंमत की परीक्षा के लिए लेजर माइक्रो विकिरण के आवेदन

Published: September 5, 2017 doi: 10.3791/56265
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

Summary

फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और लेजर सूक्ष्म विकिरण प्रस्ताव उपकरण डीएनए क्षति उत्प्रेरण और चयनित उप-परमाणु क्षेत्रों में डीएनए की मरंमत प्रोटीन की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए । यह तकनीक काफी क्षति का पता लगाने, संकेतन, और भर्ती के हमारे ज्ञान उंनत है । इस पांडुलिपि इन प्रौद्योगिकियों को दर्शाता है की जांच करने के लिए एकल और डबल किनारा तोड़ मरंमत ।

Abstract

अत्यधिक समंवित डीएनए मरंमत मार्ग का पता लगाने, उत्पाद शुल्क और क्षतिग्रस्त डीएनए ठिकानों की जगह, और डीएनए किनारा टूटता की मरंमत समंवय मौजूद हैं । जबकि आणविक जीवविज्ञान की तकनीक संरचना, एंजाइमी कार्यों को स्पष्ट किया है, और मरंमत प्रोटीन की कैनेटीक्स, वहां अभी भी एक को समझने की कैसे मरंमत नाभिक के भीतर समंवित है की जरूरत है । लेजर माइक्रो-विकिरण डीएनए क्षति उत्प्रेरण और मरंमत प्रोटीन की भर्ती की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है । लेजर सूक्ष्म विकिरण द्वारा डीएनए क्षति की प्रेरण तरंग दैर्ध्य की एक सीमा के साथ हो सकता है, और उपयोगकर्ताओं को मज़बूती से एकल किनारा टूट जाता है, आधार घावों और खुराक की एक सीमा के साथ डबल किनारा टूटता प्रेरित कर सकते हैं । यहां, लेजर माइक्रो विकिरण की मरंमत की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है एकल और डबल किनारा दो आम फोकल लेजर तरंग दैर्ध्य, ३५५ एनएम और ४०५ एनएम द्वारा प्रेरित टूटता है । इसके अलावा, विशिष्ट नुकसान मिश्रण उत्प्रेरण के लिए एप्लाइड लेजर खुराक का उचित लक्षण वर्णन किया गया है, तो उपयोगकर्ताओं लेजर सूक्ष्म विकिरण डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण प्रदर्शन reproducibly कर सकते हैं ।

Introduction

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में उभरा है सेलुलर वास्तुकला कल्पना, प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच, और प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन-डीएनए बातचीत की निगरानी । इस तरह पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के रूप में वैश्विक डीएनए हानिकारक एजेंटों, के आवेदन के बाद डीएनए क्षति प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, विकिरण, रासायनिक ऑक्सीकरण या alkylating एजेंटों, और/या chemotherapeutics में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है दीक्षा, संकेतन, और डीएनए की मरंमत प्रोटीन की भर्ती डीएनए की साइटों को नुकसान1,2। हालांकि, इन वैश्विक और अतुल्यकालिक हानिकारक घटनाओं सीमित कर रहे हैं, अगर भर्ती आदेश, एसोसिएशन या पृथक्करण के कैनेटीक्स के बारे में विस्तृत जानकारी, और प्रमुख डीएनए मरंमत प्रोटीन के बीच संबंधों की मांग कर रहे हैं । सौभाग्य से, लेजर में प्रगति फोकल सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग, नुकसान की व्यापक उपलब्धता-उत्प्रेरण लेजर तरंग दैर्ध्य, और पिछले 25 वर्षों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन में सुधार इन जांच के लिए बेहतर उपकरण के साथ शोधकर्ताओं ने प्रदान की है डीएनए की मरंमत के पहलुओं, लक्षित डीएनए क्षति प्रेरण के माध्यम से ।

सेलुलर और सेलुलर कार्यों का अध्ययन करने के क्रम में लेजर microbeams के साथ कोशिकाओं के विकिरण कोशिका और विकिरण जीवविज्ञान में एक अच्छी तरह से स्थापित उपकरण है3. डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए इस तकनीक के आवेदन उभरा जब Cremer और सह श्रमिकों एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित यूवी (२५७ एनएम) लेजर microbeam प्रणाली का इस्तेमाल किया एक ०.५ µm स्थान पर डीएनए क्षति प्रेरित करने के लिए चीनी हंसटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं में4 और की प्रेरण स्थापित इस प्रणाली द्वारा डीएनए photolesions5. जबकि समय पर यूवी microbeam तरीकों पर महत्वपूर्ण सुधार की पेशकश, इस हानिकारक प्रणाली की गोद लेने के कारण सीमित किया गया था इसके विशेष सेट, और अपने को डबल किनारा टूटता (DSBs)6उत्पंन अक्षमता । यूवी बी की एक किस्म (२९०-३२० एनएम) और यूवी-एक (३२०-४०० एनएम) तरंग दैर्ध्य समूहों की एक संख्या के बाद की जांच से पता चला कि यूवी photoproducts, oxidative आधार घावों, एकल किनारा टूटता है (एसएसबी), और DSBs लेजर तरंग दैर्ध्य पर निर्भर प्रेरित किया जा सकता है और पावर लागू किया गया4,7,8,9,10 (में समीक्षा की 3) । इसके अलावा, इन यूवी बी और यूवी के संयोजन-संवेदनशील एजेंटों के साथ एक तरंग दैर्ध्य, psoralen की तरह, bromodeoxyuridine (BrdU), और Hoechst रंजक, भी डीएनए तरंग दैर्ध्य, बिजली पर निर्भर नुकसान, और जोखिम की अवधि के लिए प्रेरित पाया गया, हालांकि बिजली की जरूरत प्रेरित नुकसान अक्सर इन एजेंटों11,12,13,14,15की उपस्थिति में कम है । इन प्रगति सूक्ष्म विकिरण के उपयोग का विस्तार, हालांकि अभी भी तकनीकी बाधाओं थे इन तरीकों के व्यापक अपनाने के लिए संबोधित किया जाएगा ।

Cremer और सह कार्यकर्ता काफी सूक्ष्म विकिरण के क्षेत्र को ठीक यूवी microbeam ध्यान केंद्रित द्वारा सेल में एक उच्च स्थानीयकृत क्षेत्र पर महत्वपूर्ण हानिकारक ऊर्जा लागू करने के लिए उंनत । के रूप में फोकल सूक्ष्मदर्शी और लेजर microdissection प्रणाली उंनत, कसकर ध्यान केंद्रित प्रकाश अधिक मोटे तौर पर सुलभ था; हालांकि, क्षेत्र के लिए यूवी स्रोतों युग्मन और रंगीन वाकया वे प्रेरित अभी भी सबसे उपयोगकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों3,6,16प्रस्तुत से निपटने । यूवी रंजक के रूप में 1990 के दशक भर में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है, ध्यान केंद्रित करने में सक्षम प्रकाशिकी और यूवी पर कब्जा उत्तेजित प्रतिदीप्ति अधिक व्यापक रूप से16उपलब्ध हो गया, और लेजर स्कैनिंग में सुधार प्रयोक्ताओं की पेशकश करने के लिए अत्यधिक ध्यान केंद्रित यूवी बनाने की क्षमता 6,17कोशिकाओंकेभीतर उत्तेजना स्पॉट । हालांकि, यह जल्दी-2000 तक नहीं था कि कसकर उच्च तीव्रता पराबैंगनीकिरण के साथ मुस्कराते हुए ध्यान केंद्रित के इस संयोजन का सही प्रभाव महसूस किया गया था, जब कई रिपोर्टों का प्रदर्शन उभरा है कि डीएनए किनारा टूटता के साथ और में संवेदी के बिना प्रेरित किया जा सकता है यूवी-ए रेंज6,10,18,19,20, ४०५ एनएम21,22,23,24, 25,26, और यहां तक कि अब ४८८ एनएम27तरह दिखाई तरंग दैर्ध्य । इन प्रगति वाणिज्यिक प्रणालियों के एक नंबर पर माइक्रो-विकिरण तकनीक के अधिक व्यापक अपनाने के लिए अनुमति दी । इन घटनाओं के साथ समानांतर में, दो फोटॉन तकनीक भी उभरा है कि डीएनए क्षति के सटीक प्रेरण की अनुमति दी; हालांकि इन प्रगति यहां चर्चा नहीं की जाएगी, वहां की समीक्षा इन तरीकों9,28,29,30के तरीके पर चर्चा लेख के एक नंबर रहे हैं ।

उच्च केंद्रित यूवी प्रकाश और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की व्यापक प्रसार उपलब्धता देने में सक्षम फोकल सूक्ष्मदर्शी के वर्तमान पहुंच के साथ डीएनए की मरंमत प्रोटीन की वास्तविक समय पर नज़र रखने की अनुमति, सूक्ष्म विकिरण तकनीक में विकसित किया है डीएनए क्षति प्रतिक्रिया और मरंमत रास्ते की जांच के लिए शक्तिशाली उपकरण । हालांकि, उपयोगकर्ताओं को पता है कि डीएनए क्षति की पीढ़ी लेजर तरंग दैर्ध्य और उप परमाणु क्षेत्र के लिए लागू शक्ति पर अत्यधिक निर्भर है की जरूरत है । यूवी-सी (~ २६० एनएम) तरंग दैर्ध्य का उपयोग प्रत्यक्ष डीएनए उत्तेजना और यूवी photoproducts7,8के प्रेरण के लिए उच्च selectivity अनुमति देते हैं । यूवी बी और यूवी-एक तरंग दैर्ध्य डीएनए क्षति (आधार घाव, एसएसबी, और DSBs), लागू शक्ति और सेलुलर पृष्ठभूमि का उपयोग7पर निर्भर के मिश्रण का उत्पादन । लक्षित कोशिकाओं में अंतर्जात photosensitizers और एंटी-ऑक्सीडेंट स्तर इन तरंग दैर्ध्य द्वारा उत्पादित डीएनए क्षति मिश्रण को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, exogenous photosensitizers (BrdU, आदि) का उपयोग डीएनए क्षति के प्रेरण के लिए आवश्यक ऊर्जा को कम करने में सहायता कर सकते हैं । हालांकि, इन एजेंटों खुद से डीएनए क्षति पैदा कर सकते हैं, और वे सेल चक्र और क्रोमेटिन संरचना को बदल सकते हैं, तो उनके उपयोग अवांछित प्रभाव है कि उपयोगकर्ता द्वारा विचार किया जा करने की आवश्यकता का उत्पादन कर सकते हैं । इसलिए, से पहले का उपयोग करने के लिए माइक्रो-विकिरण डीएनए क्षति प्रतिक्रिया और मरंमत का अध्ययन, सावधान विचार के डीएनए की मरंमत मार्ग के हित, उपयोग के लिए उपलब्ध तरंग दैर्ध्य, और डीएनए की क्षति का मिश्रण बनाया आवश्यक है ।

यहां, लेजर माइक्रो विकिरण दो सामांयतः इस्तेमाल तरंग दैर्ध्य, ३५५ एनएम और ४०५ एनएम पर किया जाता है, संवेदी के बिना डीएनए इन तरंग दैर्ध्य और प्रभाव से प्रेरित इन नुकसान मिश्रण की मरंमत की जांच पर है के मिश्रण प्रदर्शितएसएसबी और DSBs । उपयोगकर्ताओं को इन तरंग दैर्ध्य कतरा विराम या आधार घावों की एक एकल प्रजाति नहीं बना कि पता होना चाहिए । आदेश में डीएनए मरंमत रास्ते के बीच भेदभाव करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को ध्यान से नाभिक के एक विशिष्ट क्षेत्र पर लागू शक्ति को नियंत्रित करना होगा और प्रेरित कई किनारा तोड़ मार्करों और डीएनए घाव एंटीबॉडी का उपयोग कर नुकसान की विशेषताएं । यदि ठीक से लागू किया और विशेषता, लेजर माइक्रो-विकिरण डीएनए क्षति की कुछ प्रजातियों को समृद्ध कर सकते हैं, उपयोगकर्ताओं को आधार घावों और एसएसबी या DSBs की मरंमत का आकलन करने के लिए अनुमति देता है, कुछ विशिष्टता के साथ । इसलिए, हम एक उपयोगकर्ता reproducibly लेजर माइक्रो-विकिरण प्रदर्शन करने की अनुमति विधि प्रदान की है, डीएनए क्षति लागू लेजर खुराक द्वारा प्रेरित मिश्रण की विशेषताएं, और डेटा विश्लेषण करते हैं ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. कोशिका संस्कृति और स्थिर कोशिकाओं की पीढ़ी

  1. बढ़ने चो-K1 कोशिकाओं को ंयूनतम आवश्यक मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक । एक humidified मशीन में कोशिकाओं को बनाए रखने के साथ 5% कं 2 पर ३७ & #176; ग.
  2. Transfect चो-K1 कोशिकाओं के साथ 1 & #181; प्लाज्मिड डीएनए युक्त मानव XRCC1 के साथ एक सी-टर्मिनल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) टैग एक वाणिज्यिक अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर के बाद निर्माता & #39; s निर्देश.
  3. का चयन करें चो-K1 कोशिकाओं छुरा व्यक्त मानव XRCC1-GFP संलयन का उपयोग ८०० & #181; जी/एमएल geneticin और समृद्ध XRCC1-GFP व्यक्त जनसंख्या का उपयोग प्रतिदीप्ति असिस्टेड सेल छँटाई (FACS).
  4. प्लेट कोशिकाओं coverglass नीचे से संस्कृति वाहिकाओं में माइक्रो विकिरणित हो, तो वे अगले दिन लगभग ७५% या अधिक से अधिक प्रवाह तक पहुँचने. कक्षों के बीच कुछ रिक्तियां वांछनीय हैं, विशेष रूप से एक ही छवि फ़ील्ड पर वापस जाने के लिए पंजीकरण का उपयोग करते हुए (खंड ३.२ में वर्णित) ।
< p class = "jove_title" > 2. माइक्रोस्कोप सेट अप

  1. एक लेजर का चयन करें फोकल माइक्रोस्कोप उपयुक्त पराबैंगनीकिरण और प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित, और माइक्रो-विकिरण के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर/photostimulation । प्रस्तुत प्रयोगों एक लेज़र स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप है कि एक ३५५ एनएम लेजर शामिल करने के लिए संशोधित किया गया है का उपयोग करें, फाइबर-एक गैल्वेनोमीटर photoactivation miniscanner करने के लिए युग्मित और निर्माता & #39; s नियंत्रण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग नियंत्रित. इस प्रणाली को photoactivation miniscanner (३५५ एनएम लेजर) या मानक फोकल गैल्वेनोमीटर (४०५ एनएम लेजर) का उपयोग कर (रॉय) ब्याज की एक प्रयोक्ता नामित क्षेत्र में सूक्ष्म विकिरण प्रदर्शन कर सकते हैं ।
  2. तरंग दैर्ध्य सूक्ष्म विकिरण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए का चयन करें, सुनिश्चित करना है कि सूक्ष्म विकिरण lightpath में सभी ऑप्टिकल घटक चुना तरंग दैर्ध्य के लिए उपयुक्त हैं.
    नोट: प्रस्तुत प्रणाली एक ४० & #215 का उपयोग करता है; c-Apochromat (संख्यात्मक एपर्चर (na) १.२) तेल विसर्जन उद्देश्य एक यूवी फिल्टर घन के साथ ३५५ एनएम के लिए माइक्रो-विकिरण, और एक 20 & #215; सी-Apochromat (na ०.७५) शुष्क वस्तुनिष्ठ मानक का उपयोग करते हुए फोकल lightpath ४०५ एनएम माइक्रो विकिरण के लिए । 20 & #215; सेटअप में प्रयुक्त उद्देश्य ३५५ एनएम तरंग दैर्ध्य के साथ संगत नहीं है; इसलिए हमने ३५५ एनएम के लिए ४० & #215; हानिकारक के लिए शुष्क उद्देश्य का उपयोग करने की अनुमति देता है इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल बंद विसर्जन तेल सफाई, जो है क्यों हम इस उद्देश्य जब संभव उपयोग के बिना बहाव लागू हो ।
  3. सूक्ष्म विकिरण प्रयोग के लिए माइक्रोस्कोप विन्यस्त करें । प्रयोगों के बीच निरंतरता बनाए रखने के लिए, सूक्ष्म विकिरण के प्रत्येक प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए माइक्रोस्कोप घटकों के एक मानकीकृत विन्यास निर्दिष्ट. इन सेटिंग्स को माइक्रोस्कोप के भीतर एक प्रीसेट के रूप में सहेजें & #39; s ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर, यदि संभव हो तो.
    नोट: प्रस्तुत प्रणाली में, कोशिकाओं माइक्रो विकिरणित है और एकतरफ़ा स्कैनिंग, 1x स्कैन ज़ूम के साथ 1024x1024 पिक्सल के एक स्कैन संकल्प, सेकंड (एफपीएस) प्रति 8 तख्ते की एक फ्रेम दर पर, और pinhole सेट के साथ लगभग 4 हवादार इकाइयों (AU), के रूप में ४८८ एनएम लेजर के लिए निर्धारित (६९ & #181; m) । इस ओपन pinhole सेटिंग प्रत्येक छवि में कब्जा कर लिया प्रकाश की राशि को अधिकतम करने के लिए चुना गया था, कम इमेजिंग लेजर शक्तियों के उपयोग की अनुमति है और photobleaching.
    4. को कम करने
< p class = "jove_title" > 3. लेजर माइक्रो-विकिरण

  1. तैयार संस्कृति पकवान जगह, ब्याज की कोशिकाओं से युक्त, माइक्रोस्कोप मंच पर और जगह में सुरक्षित रूप से ताला ।
    1. यदि उपलब्ध है, तो एक चरण-शीर्ष मशीन में चैम्बर्ड स्लाइड रखें और ३७ & #176 पर बनाए रखें, क्षति प्रेरण के दौरान 5% सह 2 के साथ सी. यह चरण लाइव-सेल डीकॉक इमेजिंग या लांग इमेजिंग सत्रों के लिए सबसे महत्वपूर्ण है । अन्यथा माइक्रोस्कोप मंच पर जगह कोशिकाओं और कमरे के तापमान (~ 25 & #730; c) पर विकिरण प्रदर्शन, और फिर जल्दी से एक मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ३७ & #176; C with 5% सह 2 .
  2. पंजीकरण करने की अनुमति देने के लिए छवि फ़ील्ड को एक ही स्थान पर निर्धारण, धुंधला, या अंय प्रक्रियाओं के बाद वापस करने के लिए । XY स्थानों के एक धंसा या लेबल किए गए ग्रिड के साथ एनकोडेड, स्वचालित माइक्रोस्कोप स्टेज या सेल कल्चर coverglass जहाजों का उपयोग कर क्षतिग्रस्त फ़ील्ड्स का पंजीकरण करें ।
    1. अगर सॉफ्टवेयर छवि पंजीकरण का उपयोग कर, संस्कृति पोत की एक पहचानने योग्य सुविधा का चयन करें (यानी, coverglass के कोने या कुओं के बीच बाधा), एक छवि इकट्ठा, और XY स्थान रिकॉर्ड । यह नमूना तैयारी के बाद चयनित फ़ील्ड्स के XY स्थानों के संरेखण और पंजीकरण के लिए अनुमति देगा ।
    2. मैनुअल पंजीकरण, रिकॉर्ड ग्रिड या प्रत्येक क्षेत्र के लिए धंसा स्थानों का उपयोग कर यदि मैन्युअल रूप से, चरण पर पकवान के अभिविन्यास और प्लेसमेंट रिकॉर्ड करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
    3. सेल संस्कृति वाहिकाओं के लिए कोई पहचान सुविधाओं उपलब्ध हैं, तो कक्ष आकृति विज्ञान और घनत्व के दृश्य निरीक्षण के द्वारा क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की पहचान । बाद में इमेजिंग के दौरान पहचानने योग्य होने के लिए पर्याप्त रूप से विशिष्ट सुविधाओं वाले फ़ील्ड्स का चयन करने के लिए ध्यान रखें.
      नोट: यह समय लेने के लिए जब तक अभिविंयास और संस्कृति पोत के क्षेत्र कसकर प्रतिबंधित है प्रदर्शन कर सकते हैं ।
  3. सूक्ष्म विकिरण के लिए एक क्षेत्र का चयन करें और नमूना ध्यान केंद्रित । फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के लिए, अधिक से अधिक परमाणु पार-ब्याज की फ्लोरोसेंट चैनल में अनुभाग के साथ फोकल विमान का चयन करें । कोशिकाओं के लिए नहीं लेबल व्यक्त प्रोटीन, या स्पष्ट परमाणु स्थानीयकरण के बिना उन लोगों के लिए, चरण कंट्रास्ट या अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) इमेजिंग सही फोकल विमान खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    & #8203; ध्यान दें: चरण इसके विपरीत और उद्योग केंद्र इमेजिंग की एक उपयोगी सुविधा तथ्य यह है कि के रूप में फोकल विमान नमूना के माध्यम से चलता है, एक ही सुविधा के सापेक्ष फोकल विमान पर निर्भर करता है प्रकाश या अंधेरे प्रकट कर सकते हैं ।
    1. नाभिक के भीतर एक nucleolus के रूप में एक स्पष्ट सुविधा का चयन करें, और फोकल विमान ऊपर और नीचे ले जाएं, जबकि उपस्थिति में इस बदलाव को देख । सच फोकल विमान अंधेरे के लिए प्रकाश से संक्रमण के भीतर झूठ होगा । नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए, जिसमें चयनित सुविधा तीव्र कंट्रास्ट है फोकल विमान का चयन करें ।
  4. के क्षेत्र की स्थिति का पंजीकरण करें । माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के भीतर एक 3x3 पिक्सेल वर्ग रॉय बनाएं, एक सेल के नाभिक पर इस रॉय जगह क्षतिग्रस्त हो, और इस रॉय सेट करने के लिए नुकसान रॉय ।
  5. नुकसान रॉय की स्थिति सहित एक पूर्व क्षति छवि, इकट्ठा । प्रयोग के लिए
    1. कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग नहीं करते हैं, एक चरण के विपरीत या अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) brightfield छवि की पहचान करने और नुकसान के लिए नाभिक रिकॉर्ड प्राप्त ।
      2. लाइव सेल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग प्रयोगों के लिए
    2. , एक brightfield और ब्याज के प्रोटीन के लिए प्रतिदीप्ति चैनल युक्त छवि प्राप्त (यानी, लेजर लाइन GFP के उत्तेजना के लिए ४८८ एनएम, लेजर लाइन ५६१ एनएम उत्तेजना के लिए आरएफपी) । चो-K1 XRCC1-GFP, ४८८ एनएम लेजर लाइन से उत्तेजित प्रतिदीप्ति का उपयोग कर प्रयोगों में एक साथ संचारित उद्योग brightfield चैनल के साथ एकत्र किया गया था ।
  6. लेजर क्षति शुरू करते हैं । प्रस्तुत प्रणाली में
    1. , कुल समय नुकसान रॉय स्कैनिंग खर्च द्वारा लेजर खुराक पर नियंत्रण । क्योंकि ३५५ एनएम लेजर के लिए गैल्वेनोमीटर एक निश्चित स्कैन दर पर चल रही है, लेजर खुराक समय खर्च बार द्वारा नियंत्रित किया जाता है फिर से चुने हुए नुकसान की स्कैनिंग रॉय: यहां प्रस्तुत आंकड़ों में, माइक्रो विकिरण ३५५ एनएम पर 2 और 10 सेकंड के लिए किया जाता है ।
    2. इसके विपरीत, स्कैन दर मॉडुलन और चयनित नुकसान रॉय के एक स्कैन करने के द्वारा ४०५ एनएम लेजर खुराक नियंत्रित करते हैं । डेटा p मेंयहां आक्रोशित, माइक्रो विकिरण के लिए ४०५ एनएम में 8 और ०.५ एफपीएस का उपयोग करें । 8 एफपीएस की एक स्कैन दर ०.५ एफपीएस से एक कम लेजर खुराक बचाता है, क्योंकि लेजर स्कैन के दौरान प्रत्येक पिक्सेल पर कम समय खर्च करता है । दोनों पराबैंगनीकिरण १००% बिजली पर संचालित कर रहे हैं । सीधे लेजर शक्ति को मापने पर निर्देशों के लिए धारा ३.७ देखें ।
      नोट: प्रत्येक व्यक्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली कैसे लेजर शक्ति में अलग हो सकता है एक निर्दिष्ट रॉय, कैसे ३५५ एनएम और ४०५ एनएम प्रस्तुत प्रणाली में अलग करने के लिए इसी तरह के लिए दिया जाता है । उपयोगकर्ताओं को अपने माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए इस प्रक्रिया का निर्धारण और उनके तरीकों वर्गों के भीतर इन मापदंडों की रिपोर्ट की आवश्यकता होगी ।
      3. लाइव सेल इमेजिंग के लिए
    3. , brightfield और प्रतिदीप्ति चैनल के डीकॉक इमेज अधिग्रहण करते हैं । अवधि और डीकॉक की आवृत्ति समायोजित डेटा संग्रह का अनुकूलन करने के लिए, आदर्श रूप में प्रयोग के समय पाठ्यक्रम पर नुकसान रॉय और इसके पृथक्करण पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संचय पर कब्जा । XRCC1 का उपयोग कर प्रयोगों-GFP छवियों हर 30 सेकंड के लिए 20 मिनट के लिए एकत्र.
      & #8203; नोट: डीकॉक इमेजिंग की आवृत्ति fluorophore, संचय और पृथक्करण के उलझी विश्लेषण के photobleaching द्वारा सीमित किया जा सकता है । Photobleaching डीकॉक के दौरान नुकसान की कोशिकाओं को देख और अधिग्रहण की स्थिति को एडजस्ट करने के लिए इन नुकसान कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट संकेत नुकसान को कम करने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । कुछ photobleaching अपरिहार्य हो सकता है, इसलिए उपयोगकर्ताओं को डीकॉक के प्रत्येक फ्रेम में नुकसान कोशिकाओं के उन क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट तीव्रता सामांय द्वारा संकेत हानि के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं ।
      1. समय पाठ्यक्रम पूरा हो जाने के बाद, क्षति के लिए कक्षों की एक नई फ़ील्ड का चयन करें या खंड 4 में वर्णित के रूप में आगे विश्लेषण के लिए क्षतिग्रस्त कक्षों को सुधारें ।
      2. जारी रखें माइक्रो विकिरण और डीकॉक इमेजिंग क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की वांछित संख्या तक पहुँच गया है जब तक.
        & #8203; ध्यान दें: हम प्रेरित क्षति के जवाब में सेल-टू-सेल विविधता का आकलन करने के लिए चयनित शर्त के अनुसार कुल 10-25 कक्षों को क्षति पहुंचाने की सलाह देते हैं । हालांकि सबसे फोकल सिस्टम उपयोगकर्ताओं को एक सूक्ष्म विकिरण के दौरान एक से अधिक सेल को नुकसान करने की अनुमति देगा, इस चौंका देने वाला नुकसान दीक्षा बार, जो कोशिकाओं या पृथक्करण समय की एक बड़ी संख्या में चोटी भर्ती समय का विश्लेषण जटिल कर सकते है परिचय तेज घटनाओं के लिए । कुछ प्रणालियों में, कई ROIs पर एक साथ नुकसान प्रेरण एक स्वतंत्र रॉय द्वारा प्राप्त लेजर खुराक को कम कर सकते हैं । इसलिए, जब तक कि इन समय/पावर समस्या सीधे उपयोगकर्ता द्वारा संबोधित किया है, यह अनुशंसित है कि कक्ष व्यक्तिगत रूप से क्षतिग्रस्त हो ।
    4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण के लिए (IF), क्षति करने और या तो तुरंत कक्षों को ठीक, अनुभाग 4 में वर्णित के रूप में, या कक्षों को समय की चयनित वृद्धि के लिए सुधार करने की अनुमति दें (यानी, 1, 5, 10 या 20 मिनट) । के बाद वांछित समय बीतने, फिक्स और दाग कोशिकाओं, के रूप में खंड 4 में विस्तृत ।
      1. अगर विश्लेषण के लिए समग्र सेल संख्या में वृद्धि करने के लिए, संस्कृति पोत के भीतर अतिरिक्त क्षेत्रों को नुकसान के बाद एक बहु क्षेत्र के बाद क्षति प्रतिक्रिया का समय पाठ्यक्रम उत्पंन करते हैं । प्रत्येक फ़ील्ड के XY स्थान और क्षति हुई जो समय रिकॉर्ड करें । के बाद वांछित कुल मरंमत समय बीतने, फिक्स और नीचे विस्तृत रूप में कोशिकाओं दाग ।
  7. चयनित खुराक में प्रोटीन भर्ती के अवलोकन के बाद, माप और रिपोर्ट लेजर शक्ति का स्तर पोस्ट-फाइबर और बाद उद्देश्य के लिए सही विशेषताएं और लेजर खुराक की रिपोर्ट । हम एक कॉंपैक्ट डिजिटल बिजली मीटर और दो अलग photodiode संवेदक प्रमुखों का उपयोग करें; एक लेजर फाइबर के लिए सीधे युग्मित के बाद फाइबर उत्पादन को मापने के लिए, और दूसरे के बाद उद्देश्य उत्पादन को मापने के लिए माइक्रोस्कोप मंच पर रखा.
    1. लेजर पावर को मापने के लिए, सेंसर इच्छित विन्यास में जगह (पोस्ट-फाइबर या बाद के उद्देश्य) और ऊपर वर्णित के रूप में माइक्रो-विकिरण प्रदर्शन, जबकि बिजली मीटर द्वारा किए गए माप रिकॉर्डिंग. ध्यान रखें कि बिजली मीटर की नमूना दर बहुत तेजी से सूक्ष्म विकिरण की घटनाओं पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है, तो यह है कि बिजली मीटर सही ढंग से लागू खुराक का पता लगाता है यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के कई पुनरावृत्ति चलाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
      नोट: ३५५ एनएम लेजर के लिए, हम लगभग 5 मेगावाट के बाद फाइबर और लगभग 19 & #181; W के बाद उद्देश्य की एक औसत पीक शक्ति मापा । ४०५ एनएम लेजर के लिए, माइक्रो-विकिरण 30 पुनरावृत्तियों के छोरों में प्रदर्शन किया गया बिजली मीटर के ०.०१ एस अधिकतम नमूना दर पर काबू पाने के लिए, और १.५ मेगावाट और २.४ मेगावाट की औसत चोटी शक्तियों 8 और ०.५ फ्रेम प्रति सेकंड की स्कैन गति का उपयोग कर मापा गया क्रमश. हर बिजली मीटर अलग है । उपयोगकर्ताओं को अपने व्यक्तिगत बिजली मीटर के लिए परिचालन तरंग दैर्ध्य और नमूना दरों का निर्धारण करने की आवश्यकता होगी ।
< p class = "jove_title" > 4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रियाओं

  1. विश्लेषण कतरा टूट प्रेरण द्वारा यदि धुंधला ।
    1. 10 min. महाप्राण formaldehyde समाधान के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में ३.७% formaldehyde (सावधानी) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और पंजाबियों के साथ 3 बार धो लें । यहां पर पंजाबियों को वापस कोशिकाओं पर रखकर प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है, और कोशिकाओं को 4 & #730; C पर 1 सप्ताह तक स्टोर किया जा सकता है ।
      सावधानी: Formaldehyde विषैला और यलो है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं द्वारा निर्देश के रूप में विषाक्त पदार्थ के निपटान.
    2. Permeabilize कक्ष तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए पंजाब में ०.२५% ट्राइटन X-१०० का उपयोग कर और फिर धो 3 पंजाबियों के साथ बार ।
    3. ब्लॉक गैर विशिष्ट एंटीबॉडी आर टी.
      4. पर 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त पंजाब में 30 मिनट के लिए मशीन द्वारा बाध्यकारी
    4. के साथ प्राइमरी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ़ & #947; H2AX और प्राथमिक polyclonal एंटीबॉडी के खिलाफ 53BP-1 दोनों 1% BSA पर आरटी के लिए 1% से युक्त 1:750, और फिर धो 3 पंजाबियों के साथ बार ।
    5. alexa ४८८ बकरी विरोधी माउस और alexa ५४६ बकरी विरोधी खरगोश के साथ गर्मी कोशिकाओं दोनों 1% के लिए आर टी में 1% BSA युक्त पंजाब में 1:2000 पतला, और फिर धो 3 पंजाबियों के साथ बार ।
    6. दाग परमाणु डीएनए के साथ एक 10 mg/DAPI के एमएल समाधान (4 & #39;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, सावधानी) 5 मिनट के लिए पंजाब में 1:5000 को पतला, या तुलनीय परमाणु डाई का उपयोग करें, और फिर धो 3 बार के साथ पंजाब.
      सावधानी: DAPI विषाक्त और mutagenic है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं द्वारा निर्देश के रूप में विषाक्त पदार्थ को निपटाने ।
    7. प्लेस पंजाबियों या पंजाब + ०.१% सोडियम azide (सावधानी) वापस दाग कोशिकाओं पर । प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और कक्ष 4 & #730; C पर कई दिनों के लिए, या खंड 5 में छवि प्राप्ति के लिए आगे बढ़ने के लिए संग्रहीत ।
      & #8203; सावधानी: सोडियम azide विषाक्त है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं द्वारा निर्देश के रूप में विषाक्त पदार्थों को निपटाने ।
  2. के आधार घावों या डीएनए adducts की प्रेरण अगर धुंधला से विश्लेषण ।
    1. फिक्स और permeabilize कोशिकाओं में आइस-कोल्ड मेथनॉल (सावधानी) के लिए 20 min at-20 & #176; C.
      चेतावनी: मेथनॉल विषाक्त और ज्वलनशील है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं द्वारा निर्देश के रूप में विषाक्त पदार्थ को निपटाने ।
    2. महाप्राणthanol और नमूना 15 मिनट के लिए पूरी तरह से शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और कोशिकाओं पर संग्रहीत-20 & #730; सी ड्राई अप करने के लिए 3 दिनों के लिए.
    3. 15 min.
      4. के लिए पंजाब में कोशिकाओं reहाइड्रेट
    4. स्वभाव डीएनए आरटी पर ४५ मिनट के लिए 2 एन एचसीएल (सावधानी) का उपयोग और धो पंजाब के साथ 3 बार ।
      चेतावनी: एचसीएल राक है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और संक्षारक पदार्थ के रूप में संस्थागत पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं द्वारा निर्देश निपटाने ।
    5. ५० mM Tris में बेअसर-5 मिनट के लिए एचसीएल पीएच ८.८ ने पंजाबियों के साथ 3 बहाकर पीछा किया ।
    6. अवरुद्ध बफर में गर्मी कोशिकाओं 5% सामांय बकरी सीरम और ०.१% ट्राइटन X-पंजाब में 1 ज के लिए RT.
      7. में १०० के साथ बनाया
    7. 8 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन-oxo-2 & #180;-deoxyguanosine (8-oxodG, 1:400) या cyclobutane न्यूक्लियोटाइड डिमर (सीपीडी, 1:1000) में बकरी सीरम ब्लॉकिंग बफर 1 ज पर आरटी, और फिर धो 3 बार के साथ पंजाब.
    8. Alexa ४८८ बकरी विरोधी माउस के साथ गर्मी में एक 1:2000 अनुपात में बकरी सीरम अवरुद्ध 1 ज पर आरटी के लिए बफर, और धो 3 पंजाबियों के साथ बार ।
    9. दाग परमाणु डीएनए 5 मिनट के लिए पंजाब में 1:5000 DAPI (10 मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग कर, और धो 3 बार पंजाबियों के साथ ।
    10. अगर चैम्बर्ड coverglass का उपयोग कर, प्लेस पंजाब या पंजाब + ०.१% सोडियम azide वापस दाग कोशिकाओं पर । प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है और कक्ष 4 & #730; C पर कई दिनों के लिए, या खंड 5 में छवि प्राप्ति के लिए आगे बढ़ने के लिए संग्रहीत ।
    11. वैकल्पिक रूप से, पसंदीदा बढ़ते माध्यम में कोशिकाओं माउंट, अगर एक अतिरिक्त coverglass संस्कृति पोत के शीर्ष पर रखा जा सकता है । एक बार ठीक हो, घुड़सवार कोशिकाओं समय की लंबी अवधि के लिए 4 & #730; C पर संग्रहित किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए छवि अधिग्रहण

  1. इथेनॉल के साथ संस्कृति पोत के coverglass नीचे साफ और इसे वापस फोकल माइक्रोस्कोप मंच पर जगह है । सुनिश्चित करें कि अभिविंयास और मंच पर पोत की स्थिति अभिविंयास और जब नुकसान प्रेरित किया गया दर्ज की स्थिति से मेल खाती है । इष्टतम पंजीकरण और इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति पोत को सुरक्षित करें ।
  2. पहले की स्थिति जानें पंजीकरण तकनीक का उपयोग कर चयनित क्षेत्रों (३.२ में वर्णित) ।
    1. एक धंसा ग्रिड के साथ एक coverglass का उपयोग कर मैनुअल पंजीकरण के लिए, ध्यान में ग्रिड लाने और पहचान मार्क्स पाते हैं । फिर क्षतिग्रस्त कक्षों को ढूँढने के लिए रिकॉर्ड किए गए XY निर्देशांक का उपयोग करें.
    2. छवि आधारित स्वचालित पंजीकरण के लिए, संरचनात्मक सुविधा चरण 3.2.1 में एक संदर्भ के रूप में उपयोग की स्थिति जानें, और फिर संभव के रूप में दर्ज की गई छवि के लिए निकटता के रूप में वर्तमान लाइव माइक्रोस्कोप दृश्य संरेखित करें । एक बार संरेखित, वर्तमान xy माइक्रोस्कोप चरण स्थान को मापने और इसे संदर्भ छवि के XY स्थान की तुलना करें । दो स्थानों के बीच रेखीय दूरी X और Y ऑफ़सेट को परिभाषित करता है । इस ऑफ़सेट को विकिरणित कक्ष वाले छवि फ़ील्ड (ओं) की पहचान करने के लिए प्रत्येक रिकॉर्ड किए गए XY स्थान पर लागू करें । इस ऑफसेट समारोह माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्वचालित किया जा सकता है या मैंयुअल रूप से प्रदर्शन किया ।
    3. यदि कोई उपयुक्त पंजीकरण बिंदुओं की पहचान नहीं की जा सकी, तो मैंयुअल रूप से स्लाइड को स्कैन करके और पहले से पहचानी गई कक्ष सुविधाओं का पता लगाने के कक्षों का पता लगाएं ।
  3. एक brightfield छवि सहित सभी दाग लक्ष्य, इकट्ठा करने के लिए उपयुक्त माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण (धारा २.३ में स्थापित करने और धारा ३.३ में ध्यान केंद्रित) । प्रस्तुत प्रयोगों में, मल्टीचैनल छवियों निंनलिखित उत्तेजना लेजर लाइनों और fluorophores: ४०५ एनएम (DAPI), ४८८ एनएम (alexa ४८८ और संचारित उद्योग brightfield), और ५६१ एनएम (alexa ५४६) का उपयोग कर एकत्र किए गए । सभी पराबैंगनीकिरण एक एकल acousto-ऑप्टिकल स्वरित्र दोनों लेजर तरंग दैर्ध्य और शक्ति के संचरण को नियंत्रित करने फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं ।
< p class = "jove_title" > 6. माइक्रो-विकिरणित साइटों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन की भर्ती के लाइव सेल छवि विश्लेषण

  1. एक छवि विश्लेषण आवेदन में अधिग्रहीत छवियों को खोलने (यानी, NIS तत्वों या ImageJ). यदि आवश्यक हो, डीकॉक छवियों के साथ पूर्व विकिरण छवि गठबंधन के लिए पूर्व के एक एकल छवि अनुक्रम और बाद क्षति प्रेरण उत्पंन करते हैं । उपयोगकर्ता पूरे नाभिक में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता के सापेक्ष विकिरणित क्षेत्र पर फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा भर्ती दिखा सकते हैं (प्रतिनिधि परिणाम देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ब ).
  2. प्रत्येक कोशिका के लिए मापा जा करने के लिए, पहले एक संदर्भ रॉय कि नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है उत्पंन । फ्लोरोसेंट संकेत है कि ऊपर नाभिक बनाने पिक्सल शामिल है पर एक थ्रेसहोल्ड एल्गोरिथ्म का प्रयोग करें, और फिर एक रॉय में इस क्षेत्र में परिवर्तित । यदि आवश्यक हो, रॉय मैंयुअल रूप से एक संदर्भ के रूप में brightfield का उपयोग करने में तैयार किया जा सकता है । समय पाठ्यक्रम पर रॉय को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि परमाणु क्षेत्र सही रॉय द्वारा कवर किया जाता है, और प्रत्येक फ्रेम के लिए इस रॉय के भीतर फ्लोरोसेंट संकेत का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट ।
    3. प्रत्येक कोशिका के लिए
  3. मापा जा करने के लिए एक 6x6 पिक्सेल रॉय बनाने के लिए और यह समय पाठ्यक्रम के प्रत्येक फ्रेम के लिए नुकसान रॉय पर जगह है । यह बड़ा रॉय अब नुकसान विश्लेषण के लिए रॉय है । प्रत्येक फ़्रेम के लिए माध्य ROI प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट करना.
    नोट: अधिकांश वाणिज्यिक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 2d वस्तु पर नज़र रखने के लिए मॉड्यूल शामिल हैं, और ImageJ या फिजी कि तेजी से कार्यप्रवाह और उच्च प्रवाह की सुविधा के लिए उपयोगकर्ता विकसित मैक्रोज़ के एक नंबर रहे हैं (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/देखें).
  4. एक इसी संदर्भ रॉय के डीकॉक के प्रत्येक फ्रेम में मतलब नुकसान रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामांय । यहां, मतलब परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता संदर्भ रॉय के रूप में प्रयोग किया जाता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ). & #160; सामांयीकरण माध्य से माध्य संदर्भ ROI प्रतिदीप्ति तीव्रता घटाया द्वारा किया जा सकता है नुकसान रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता, या मतलब क्षति रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभाजित करके अर्थ संदर्भ रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता से ।
    नोट: विभाजन के अनुसार सामान्यता अप्रत्याशित परिणाम प्राप्त कर सकते हैं, अगर बहुत कम संदर्भ तीव्रता मूल्यों के साथ स्थितियों में इस्तेमाल किया.
  5. सभी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के लिए दोहराएं, साथ ही साथ कम से दो नियंत्रण के लिए, unक्षतिग्रस्ed कोशिकाओं । यदि आवश्यक हो, तो नियंत्रण कक्ष परिणाम आगे सामांयीकरण के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
    6. समय पर
  6. ग्राफ सामान्यीकृत तीव्रता मूल्यों प्रयोगात्मक उपचार के एक समारोह के रूप में भर्ती गतिशीलता में परिवर्तन दिखाने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पता लगाया प्रोटीन भर्ती की छवि विश्लेषण

  1. ओपन पूर्व और एक छवि विश्लेषण आवेदन में पोस्ट क्षति छवियों । पूर्व क्षति छवियों को नुकसान रॉय (ओं) सूक्ष्म विकिरण के लिए इस्तेमाल होते हैं । रॉय (ओं) की प्रतिलिपि बनाएँ और पोस्ट-क्षति छवियों में पेस्ट करने के लिए लक्षित कोशिकाओं की पहचान.
  2. प्रोटीन भर्ती के विश्लेषण के लिए एक 6x6 पिक्सेल रॉय उत्पंन और नुकसान रॉय के स्थान पर इस रॉय जगह है । यह बड़ा रॉय अब नुकसान विश्लेषण के लिए रॉय है । रिपोर्ट मतलब नुकसान रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता ।
  3. एक इसी संदर्भ रॉय की है कि करने के लिए मतलब नुकसान रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता सामांय । यहाँ, क्षतिग्रस्त कोशिका के माध्य नाभिकीय प्रतिदीप्ति तीव्रता को संदर्भ ROI के रूप में उपयोग किया जाता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ). संदर्भ roi को नाभिक को परिभाषित करने के लिए DAPI संकेत पर थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग करके जेनरेट करें और फिर इस क्षेत्र को ROI में रूपांतरित करें. मतलब संदर्भ रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट । सामान्य अर्थ नुकसान रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता से मतलब संदर्भ रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता से घटाकर किया जा सकता है, या मतलब संदर्भ रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता से अर्थ क्षति रॉय प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके.
    नोट: विभाजन के अनुसार सामान्यता अप्रत्याशित परिणाम प्राप्त कर सकते हैं, अगर बहुत कम संदर्भ तीव्रता मूल्यों के साथ स्थितियों में इस्तेमाल किया.
  4. सभी क्षतिग्रस्त कक्षों के लिए दोहराएं, और एक ही विश्लेषण पर कम दो नियंत्रण कक्ष, ऊपर वर्णित के रूप में निष्पादित करें ।
  5. ग्राफ एक समय के खिलाफ मापा सूक्ष्म विकिरण घटना के लिए सामान्यीकृत तीव्रता मूल्यों प्रोटीन भर्ती या प्रयोगात्मक उपचार के एक समारोह के रूप में डीएनए क्षति के प्रकार में परिवर्तन दिखाने के लिए ।

Representative Results

प्रेरित डीएनए क्षति के लक्षण वर्णन
आधार घावों और किनारा टूट की प्रेरण चयनित परमाणु क्षेत्र के लिए लागू लेजर खुराक पर निर्भर है और सेल मॉडल के सेलुलर microenvironment7का उपयोग किया । फ्लोरोसेंट प्रोटीन, XRCC1, 53BP1, Ku70, या Rad51 की तरह प्रोटीन की मरंमत के लिए जुड़े हुए, ंयूनतम एक क्षति रॉय के भीतर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संचय को देखने के लिए आवश्यक ऊर्जा की स्थापना के लिए उपयोगी एकल और डबल किनारा तोड़ मार्करों प्रदान बैकग्राउंड प्रतिदीप्ति9,19,31. एक बार शर्तों है कि एक प्रतिक्रिया प्रेरित पाया जाता है, यह है कि विशिष्ट तरंग दैर्ध्य और खुराक द्वारा प्रेरित नुकसान मिश्रण विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है । खुराक की क्षीणन और तरंग दैर्ध्य प्रयोग किया जाता है पर अवधि के जटिल नुकसान मिश्रण के गठन को कम करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति कर सकते हैं. यूवी में कम लेजर खुराक-एक सीमा के मुख्य रूप से एसएसबी और आधार घावों की एक छोटी राशि का उत्पादन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, SSBR और मांक रास्ते का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त10,28. खुराक में वृद्धि अधिक जटिल आधार घावों, oxidative और यूवी प्रेरित बनाता है, और DSBs7,10की अधिक महत्वपूर्ण संख्या लाती है । जबकि डीएनए क्षति की एक एकल प्रजातियों की प्रेरण विशिष्ट डीएनए की मरंमत रास्ते की परीक्षा के लिए वांछनीय है, यह अधिक संभावना है कि उपयोगकर्ताओं को डीएनए घावों का एक मिश्रण उत्प्रेरण कर रहे हैं, एसएसबी की तरह एक विशिष्ट घावों के साथ जा रहा है और अधिक आधार घावों या DSBs की तुलना में अक्सर । यह डीएनए क्षति हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) या मिथाइल methanesulfonate (एमएमएस)३२की तरह रासायनिक एजेंटों द्वारा प्रेरित मिश्रण के समान है । उपयोगकर्ताओं को पता है जब वे परिणाम रिपोर्ट है कि नुकसान मिश्रण हो सकता है की जरूरत है, और खुराक और घावों पर प्रेरित क्षति साइट पर सावधान लक्षण वर्णन reproducibility और उनके परिणामों की तुलना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं ।

माइक्रो-विकिरण अध्ययन में, XRCC1-GFP अक्सर आधार घावों और एसएसबी9,28की प्रेरण के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है । XRCC1 एक पाड़ प्रोटीन है कि एसएसबी मरंमत (SSBR) और आधार उत्पाद सुधार (मांक) में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और भी अंय मरंमत रास्ते में भाग लेता है, जैसे न्यूक्लियोटाइड उत्पाद शुल्क मरंमत (नेर)३३,३४,३५ . यह डीएनए की मरंमत में एक महत्वपूर्ण समंवय भूमिका निभाता है, प्रमुख प्रोटीन की एक संख्या के साथ बातचीत, पाली सहित (ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1 (प्प-1), डीएनए पोलीमरेज़ β (पॉल β), और डीएनए ligase III । हम XRCC1-GFP छुरा चो-K1 कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए लेजर एसएसबी और DSBs उत्पंन करने के लिए आवश्यक खुराक निर्धारित करने का उपयोग किया । हम पहली बार एक तरंग दैर्ध्य (चित्रा 1) के लिए XRCC1-GFP की एक चौकस भर्ती प्रेरित करने के लिए आवश्यक न्यूनतम खुराक की पहचान की. ३५५ एनएम तरंग दैर्ध्य के लिए, एक 2 परिभाषित नुकसान रॉय के भीतर एक वृद्धि हुई फ्लोरोसेंट संकेत है कि रॉय, डीएनए क्षति की प्रेरण कि पृष्ठभूमि (चित्रा 1ए) से अधिक का संकेत था उत्पंन पर समय आवास एस । ४०५ एनएम के लिए, एक 8 एफपीएस स्कैन दर को नुकसान रॉय को एक चौकस भर्ती उत्पंन (चित्रा 1ए) की जरूरत थी । खुराक तो बढ़ गया था (३५५ एनएम के लिए 10 एस और ४०५ एनएम के लिए ०.५ एफपीएस) एक और अधिक तीव्र नुकसान रॉय (चित्रा 1ए) बनाने के लिए ।

भर्ती और प्रेरित क्षति के स्थल पर XRCC1-GFP के प्रतिधारण तो डीकॉक इमेजिंग द्वारा निगरानी की गई । डीएनए की क्षति के स्थल पर प्रोटीन की अवधारण पर संकेत हो सकता है डीएनए की मरंमत जा रहा है, जबकि प्रेरित नुकसान की साइट से प्रोटीन की पृथक्करण अक्सर मांक या SSBR के पूरा होने के लिए एक मार्कर माना जाता है । हालांकि, वहां कोई स्पष्ट लेजर से XRCC1 के पृथक्करण जोड़ने सबूत है मरंमत के पूरा होने के साथ डीएनए क्षति साइटों प्रेरित किया गया है । नुकसान की साइट पर प्रोटीन की भर्ती क्षतिग्रस्त रॉय के भीतर फ्लोरोसेंट संकेत की अर्थ तीव्रता की रिपोर्ट द्वारा मापा जाता है मतलब फ्लोरोसेंट संकेत पूरे नाभिक (चित्रा 1बी) के लिए मापा । इस प्रकार के सामान्यीकरण में मदद करता है पता तीव्रता उतार चढ़ाव परमाणु संकेत में, हालांकि अन्य सामान्य तकनीक ब्याज की प्रोटीन के सेलुलर वितरण के आधार पर नियोजित किया जा सकता है. यहां, XRCC1 परमाणु डिब्बे में स्थानीयकृत है, इसलिए परमाणु क्षेत्र को सामांय नुकसान रॉय के लिए संकेत के पुनर्वितरण के उपाय । रॉय फ्लोरोसेंट तीव्रता का मतलब है तो डीकॉक में प्रत्येक छवि के लिए दर्ज की गई है, पूर्व सहित क्षति छवि, और समय के एक समारोह के रूप में रेखांकन (चित्रा 1सी) ।

हम तो आगे दो चयनित लेजर खुराक द्वारा प्रेरित नुकसान डीएनए आधार घावों के गठन की जांच की विशेषता । सबसे पहले, सीपीडी के गठन, एक भारी यूवी प्रेरित घाव, नेर प्रकार घावों के लिए एक मार्कर के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा जांच की थी (चित्रा 2) । फिर, oxidatively प्रेरित आधार lesion8-oxodG मांक प्रकार घावों के लिए एक मार्कर के रूप में जांच की गई थी (चित्रा 2बी) । सीपीडी घावों में कोई उल्लेखनीय वृद्धि दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए कम खुराक जोखिम पर मनाया गया (३५५ एनएम के लिए 2 एस और ४०५ एनएम के लिए 8 एफपीएस), जबकि दोनों तरंग दैर्ध्य पर उच्च खुराक उपचार (10 एस के लिए ३५५ एनएम और ०.५ एफपीएस ४०५ एनएम के लिए) फ्लोरोसेंट में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखा दिया संकेत नुकसान रॉय के भीतर मनाया (चित्रा 2) । सीपीडी रॉय का एक तितर बितर साजिश का मतलब है प्रत्येक क्षतिग्रस्त कोशिका को क्षति के गठन और दोनों तरंग दैर्ध्य और खुराक पर पता लगाने में विविधता दिखाता है, यह दर्शाता है कि कम मात्रा में सीपीडी घावों के निचले स्तर पर मौजूद हो सकता है, लेकिन लोड काफी नहीं हो सकता है एक उच्च खुराक लागू किया जाता है जब तक पता चला. scatterplot भी पता चलता है कि एंटीबॉडी में अक्षमता का पता लगाने कि नुकसान मिश्रण का सही ठहराव सीमा हो सकती है ।

यह आगे मार्कर द्वारा oxidatively प्रेरित डीएनए घावों का पता लगाने में प्रकाश डाला है 8-oxodG. नुकसान रॉय के भीतर फ्लोरोसेंट संकेत में कोई स्पष्ट वृद्धि या तो लेजर तरंग दैर्ध्य या खुराक इस्तेमाल किया पर 8-oxodG के लिए मनाया गया (चित्रा 2बी) । इस कार्य के लिए उपयोग किया गया एंटीबॉडी पिछले प्रकाशन9,10,३६के अनुरूप है; हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वहां 8 के गठन को देख में सीमाएं हो सकती है३७,३८एंटीबॉडी के साथ oxodG । oxidatively प्रेरित घावों की कमी की पुष्टि भी एक दूसरे मार्कर द्वारा सिफारिश की है, 8 की भर्ती की तरह-Oxoguanine डीएनए Glycosylase (OGG1), 8 डीएनए से oxodG को हटाने के लिए जिंमेदार एंजाइम10। हम हमारे डीएनए क्षति साइटों के लिए OGG1 भर्ती का निरीक्षण नहीं किया; हालांकि, oxidatively प्रेरित डीएनए क्षति के निंन स्तर के गठन पूरी तरह से इंकार नहीं किया जा सकता है ।

अंत में, हम दो मार्करों, γH2AX और 53BP-1 का उपयोग कर DSBs के गठन की जांच की, पर चुनेंd लेज़र डोज by इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 3 & #38; 4). γH2AX सामांयतः एक किनारा तोड़ मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन DSBs के लिए इसकी विशिष्टता रिपोर्ट३९,४०की संख्या में पूछताछ की गई है । इसके अतिरिक्त, यह एक फास्फारिलीकरण घटना है कि कतरा तोड़ साइट से प्रचारित है, तो एक कतरा तोड़ने के लिए संकेत के स्थानीयकरण इस संकेत के प्रचार के कारण सीमित किया जा सकता है । इसलिए, 53BP के साथ γH2AX के संयोजन-1 नुकसान रॉय के भीतर DSB गठन के अधिक सटीक आकलन के लिए अनुमति देता है ।

सूक्ष्म विकिरण के लिए γH2AX और 53BP-1 की प्रतिक्रिया दोनों तरंग दैर्ध्य और खुराक निर्भर है । कम खुराक (2 एस) ३५५ एनएम पर उत्तेजना 5 और 20 मिनट में कोई जवाब नहीं है, और एक कमजोर और चर प्रतिक्रिया 10 मिनट के बाद विकिरण (चित्रा 3ए) दोनों मार्करों के लिए । उच्च खुराक (10 एस) ३५५ एनएम माइक्रो-विकिरण के भीतर एक बढ़ा फ्लोरोसेंट संकेत लाती है 5, 10 पर नुकसान रॉय, और 20 मिनट के बाद विकिरण है कि ४० मिनट (चित्रा 3बी) में कम है । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सावधान अनुमापन ३५५ एनएम खुराक की मरंमत रास्ते की पार उत्तेजना को कम करने के लिए आवश्यक है, के रूप में शुरुआती समय अंक पर डबल किनारा तोड़ मार्कर γH2AX के कम पता लगाने के द्वारा प्रदर्शन (& #60; 20 मिनट) कम खुराक पर लागू.

इसी तरह के प्रयोगों दोनों कम (8 एफपीएस) और उच्च खुराक (०.५ एफपीएस) ४०५ एनएम लेजर उत्तेजना (चित्रा 4) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । इस तरंग दैर्ध्य क्षति के भीतर फ्लोरोसेंट तीव्रता के महत्वपूर्ण संचय पर रॉय दोनों 53BP के लिए मनाया गया था-1 और γH2AX लागू खुराक की परवाह किए बिना, यह दर्शाता है कि इन खुराक एकल और डबल किनारा टूट के एक जटिल मिश्रण उत्पन्न लगभग तत्काल डीएनए क्षति (चित्रा 4) के प्रेरण के बाद । इसके अतिरिक्त, ४०५ एनएम की उच्च खुराक में एक वृद्धि दिखाने के पैन-परमाणु γH2AX धुंधला होने के 10 मिनट के भीतर नुकसान प्रेरण (चित्रा 4बी, नीचे) है कि नुकसान का पता लगाने के लिए मुश्किल ROI रिपोर्ट करने के लिए, जबकि 53BP-1 संचय अधिक है नुकसान रॉय के भीतर निहित ।

इन परिणामों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि ४०५ एनएम माइक्रो विकिरण SSBR या मांक निगरानी के लिए उपयुक्त नहीं है, और है कि डीएनए adducts और किनारा टूट के लिए कई मार्करों पूरी तरह प्रेरित घावों और डीएनए की मरंमत प्रतिक्रियाओं को वर्गीकृत करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए ।

खुराक-XRCC1-GFP की भर्ती और प्रतिधारण में निर्भर परिवर्तन
एक बार प्रेरित डीएनए क्षति विशेषता हो गया है, लेजर माइक्रो विकिरण डीएनए की मरंमत प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मंच हो सकता है । प्रतिधारण और XRCC1-GFP के पृथक्करण कैनेटीक्स एक खुराक निर्भरता (चित्रा 1) है, जो प्रत्येक तरंग दैर्ध्य द्वारा विभिन्न नुकसान मिश्रण की प्रेरण दिया अप्रत्याशित नहीं है दिखाता है. उच्चतम विकिरण खुराक (10 एस और ०.५ एफपीएस) 20 मिनट के कोर्स (चित्रा 1) पर नुकसान के स्थल पर कम खुराक और XRCC1-GFP के लंबे समय तक प्रतिधारण के सापेक्ष XRCC1-GFP की एक उच्च तीव्रता भर्ती दिखाने के लिए (सी) । यह इंगित करता है कि डीएनए क्षति दोनों ३५५ और ४०५ एनएम के लिए उच्च खुराक पर बनाया की संभावना प्रयोग के दौरान हल नहीं है, जो उपस्थिति और DSB मार्करों, γH2AX और 53BP-1 के प्रतिधारण के अनुरूप है (आंकड़े 3 & #38; 4 ).

दिलचस्प है, कम नुकसान खुराक (2 एस और 8 एफपीएस) XRCC1-GFP की क्षति साइटों और पृथक्करण के XRCC1-GFP प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम पर पूर्व विकिरण स्तर (चित्रा 1) के लिए तेजी से भर्ती दिखा । क्षति मिश्रण के पूर्ण लक्षण वर्णन के बिना, यह निष्कर्ष है कि एसएसबी और आधार घावों को पूरी तरह से इन हानिकारक स्थितियों का उपयोग कर हल कर रहे है के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, γH2AX और 53BP-1 की उपस्थिति ३५५ एनएम के लिए ४० मिनट पर और ४०५ एनएम के लिए 5 मिनट में विभिंन व्याख्याओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ३५५ एनएम 2 एस खुराक के लिए, नुकसान मिश्रण मुख्य रूप से एसएसबी हो सकता है, इसलिए ४० मिनट पर DSB मार्करों की उपस्थिति का संकेत हो सकता है कि कुछ मरंमत घावों DSBs करने के लिए अग्रणी हो सकता है या कि इस ऊर्जा द्वारा उत्पंन DSBs एक लंबे समय पैमाने पर सुधार कर रहे हैं । SSBR और DSB मरंमत के बीच समय पैमाने पर अंतर पहले28,४१,४२रिपोर्ट किया गया है । इसी तरह, ४०५ एनएम कम खुराक (8 एफपीएस) पृथक्करण एसएसबी के एक निंन स्तर या एसएसबी कि तेजी से DSBs, जो उच्च नुकसान माइक्रो विकिरण और अंय डीएनए हानिकारक एजेंटों पहले से४३के लिए उल्लेख किया गया है में परिवर्तित कर रहे है के एक क्लस्टरिंग संकेत हो सकता है, ४४ , ४५.

एक साथ इन परिणामों निस्र्पक प्रेरित नुकसान मिश्रण के महत्व पर प्रकाश डाला और भर्ती और प्रेरित नुकसान की साइटों पर डीएनए की मरंमत प्रोटीन की अवधारण की व्याख्या के लिए कई डीएनए की मरंमत प्रोटीन और मार्कर का उपयोग ।

Figure 1
चित्र 1 . लेजर माइक्रो-विकिरण XRCC1-GFP की भर्ती लाती है । 
(क) चो-K1 कोशिकाओं को छुरा XRCC1-GFP व्यक्त विकिरणित और पहले और तुरंत नुकसान प्रेरण के बाद छवि थे । तीर माइक्रो-विकिरण खुराक और स्केल बार के स्थान का संकेत 10 µm है । (ख) भर्ती नुकसान रॉय के भीतर मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता का निर्धारण और पूरे नाभिक का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता को सामान्य करने से मापा जाता है । (ग) भर्ती की गतिशीलता प्रत्येक डीकॉक छवि के लिए मापा जा सकता है । रेखांकन त्रुटि SEM (n = 24) का प्रतिनिधित्व सलाखों के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . लेजर माइक्रो-विकिरण न्यूक्लियोटाइड क्षति लाती है । 
चो-K1 कोशिकाओं लेजर सूक्ष्म विकिरण के अधीन थे और तुरंत नुकसान प्रेरण के बाद तय की । इम्यूनोफ्लोरेसेंस सीपीडी और 8-oxodG adducts का पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया । (क) शीर्ष, तितर बितर भूखंड रॉय मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता सीपीडी धुंधला के बाद क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में मनाया । नीचे, सीपीडी धुंधला के प्रतिनिधि छवियां । तीर माइक्रो-विकिरण का स्थान इंगित करता है और स्केल बार 10 µm (n = 12) है । (ख) 8 के लिए प्रतिनिधि छवियां-oxodG धुंधला । तीरसूक्ष्म विकिरण के स्थान का संकेत है और पैमाने पर बार 10 µm है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . डीएनए डबल किनारा तोड़ मार्करों ३५५ एनएम सूक्ष्म विकिरण एक खुराक निर्भर तरीके से जवाब । 
चो-K1 कोशिकाओं सूक्ष्म विकिरण के अधीन थे और समय के बाद संकेत उत्तेजना अंक पर तय की । DSB मार्करों γH2AX और 53BP-1 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन किया गया । (क) सामान्यीकृत क्षति रॉय के तितर बितर भूखंड का मतलब है प्रतिदीप्ति तीव्रता और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के लिए मापा । त्रुटि पट्टियां SEM (n = 12) के प्रतिनिधि हैं । (ख) γH2AX और 53BP-1 धुंधला के लिए प्रतिनिधि छवियां । तीर माइक्रो-विकिरण के स्थान का संकेत है और पैमाने पर बार 10 µm है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4। डीएनए डबल किनारा तोड़ मार्करों मजबूती से ४०५ एनएम माइक्रो विकिरण का जवाब ।
चो-K1 कोशिकाओं को सूक्ष्म विकिरण के अधीन थे और समय पर तय अंक उत्तेजना के बाद संकेत दिया । DSB marks γH2AX और 53BP-1 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस । (क) सामान्यीकृत क्षति रॉय के तितर बितर भूखंड का मतलब है प्रतिदीप्ति तीव्रता और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के लिए मापा । त्रुटि पट्टियां SEM (n = 12) के प्रतिनिधि हैं । (ख) γH2AX और 53BP-1 धुंधला के लिए प्रतिनिधि छवियां । तीर माइक्रो-विकिरण के स्थान का संकेत है और पैमाने पर बार 10 µm है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित शर्तों का उपयोग करना, किसी भी फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक यूवी-एक या ४०५ एनएम लेजर, या तो निर्माता द्वारा एकीकृत या अंत उपयोगकर्ता द्वारा जोड़ा गया, एक सेल के नाभिक के भीतर डीएनए क्षति पैदा कर सकते हैं और की साइट के लिए डीएनए की मरम्मत प्रोटीन की भर्ती की अनुमति प्रेरित डीएनए क्षति पर नजर रखी जाए । हालांकि, के रूप में प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम, तरंग दैर्ध्य चयन, लागू शक्ति में उल्लेख किया है, और क्षति लक्षण वर्णन सभी महत्वपूर्ण मुद्दों है कि उपयोगकर्ता द्वारा पहले संबोधित करना चाहिए क्रम में एक विशिष्ट डीएनए मरंमत मार्ग का अध्ययन कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक डिजाइन कि उपयोगकर्ताओं द्वारा भी विचार किया जाना चाहिए में अंय विचार कर रहे हैं ।

आदेश में जीवित कोशिकाओं में एक प्रोटीन के व्यवहार की निगरानी के लिए माइक्रो विकिरण के बाद, एक फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन बनाया जाना चाहिए । फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला की उपलब्धता है कि वर्णक्रम से अलग किया जा सकता प्रोटीन फ्यूजन कि डीएनए नुकसान की प्रेरण के लिए निस्र्पक सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बनाने के लिए उपकरण प्रदान करता है । ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्षणिक अभिकर्मक हानिकारक स्थितियों, उत्परिवर्तनों, या यहां तक कि अवरोधकों के त्वरित जांच के लिए अनुमति देता है, जबकि छुरा transfected कोशिकाओं अभिव्यक्ति के स्तर पर अधिक नियंत्रण की पेशकश और अंय जैव रासायनिक के लिए अनुमति characterizations प्रदर्शन किया जा करने के लिए, सूक्ष्म विकिरण परिणाम मांय । वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी एक ही मार्ग के भीतर या विभिन्न रास्ते में प्रोटीन के बीच बातचीत की निगरानी करने के लिए एक ही सेल में उपयोग किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए की जरूरत को खत्म करने और नुकसान के प्रेरण के बाद समय की लंबी अवधि के लिए प्रोटीन व्यवहार के जीवित सेल की निगरानी की अनुमति ।

हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के इस्तेमाल में भी कमियां हैं । आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बिना प्रोटीन (ओं) में ब्याज की कमी, अंतर्जात प्रोटीन फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे । N या सी प्रोटीन की टर्मिनस को फ्लोरोसेंट टैग की विकार प्रोटीन तह बदल सकता है, प्रमुख प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, या ब्लॉक translocation संकेतों बाधा; समारोह में फेरबदल और संभावित भर्ती गतिशीलता को प्रभावित । इन प्रभावों की रिपोर्ट के एक नंबर में प्रदर्शन किया गया है, जहां immunofluorescent धुंधला नाटकीय रूप से अलग भर्ती और अंतर्जात प्रोटीन के लिए प्रतिधारण समय नुकसान स्थल28पर प्रदर्शित । क्षणिक अभिकर्मक या स्थिर क्लोन का उपयोग भी मनाया प्रतिक्रिया बदल सकते हैं, आमतौर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव के माध्यम से । इसके अलावा, एक प्रयोग में कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग भी भर्ती की गतिशीलता बदल सकते हैं, अगर प्रोटीन का स्तर अच्छी तरह से equilibrated नहीं कर रहे है या यदि बड़ी फ्लोरोसेंट की भर्ती-टैग की गईं प्रोटीन ब्लॉक अंय प्रोटीन की भर्ती . अंत में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन कमजोर संवेदी एजेंटों के रूप में कार्य कर सकते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के गठन में वृद्धि, और संभावित डीएनए क्षति४६प्रेरित मिश्रण बदलने,४७। इन कमियों के बावजूद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन सूक्ष्म विकिरण के साथ डीएनए की मरंमत के अध्ययन में विभिंन लाभों की एक संख्या प्रदान करते हैं, और यदि उपयोगकर्ताओं को इस तरह के नुकसान लक्षण वर्णन के रूप में उचित नियंत्रण, शामिल यहां वर्णित है, वे नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है नुकसान प्रतिक्रिया और प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत में3।

यदि लाइव सेल इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रेरित नुकसान की प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशिष्ट समय पर कोशिकाओं फिक्सिंग द्वारा क्षति प्रेरण और प्रोटीन और ब्याज के घावों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ धुंधला, नुकसान प्रेरण के स्थिर स्नैपशॉट और भर्ती और मरंमत प्रोटीन की अवधारण बनाया जा सकता है । एंटीबॉडी के लिए ब्याज की कई प्रोटीन की भर्ती पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और/या पोस्ट-शोधों डीएनए क्षति प्रतिक्रिया द्वारा प्रेरित संशोधनों । इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए की जरूरत समाप्त, और अंतर्जात प्रोटीन व्यवहार के लिए अनुमति देता है की जांच की जाएगी । हालांकि, इस विधि में भी अपनी कमियां हैं । अति विशिष्ट एंटीबॉडी आवश्यक हैं, और permeabilization और अवरुद्ध प्रक्रियाओं पर्याप्त संकेत तीव्रता के साथ भर्ती का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । प्रक्रियाओं फिक्सिंग तात्कालिक नहीं हैं, और इस भौतिक बाधा इस दृष्टिकोण के लौकिक संकल्प सीमा । नुकसान की साइट मानचित्रण तो कोशिकाओं को फिर से हो सकता है दाग के बाद स्थित भी महत्वपूर्ण चुनौतियां मौजूद कर सकते हैं । इस काम में इस्तेमाल किया फोकल माइक्रोस्कोप ऊपर वर्णित के रूप में छवि आधारित पंजीकरण के लिए अनुमति देता है, तो क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को उच्च परिशुद्धता के साथ स्थित किया जा सकता है. यदि चरण पंजीकरण या धंसा coverglass उपलब्ध नहीं है, समय चरण पंजीकरण के बिना कोशिकाओं को स्थानांतरित करने में शामिल निवेश, क्षति प्रेरण और छवि में भर्ती के बीच निहित देरी के साथ युग्मित, इम्यूनोफ्लोरेसेंस कर सकते है कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए बदसूरत । हालांकि, सबसे सटीक और पूरा सूक्ष्म विकिरण प्रयोगात्मक डिजाइन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के साथ समानांतर में दृष्टिकोण के इन प्रकार के शामिल होंगे, के रूप में प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित है ।

यहां, दोनों लाइव सेल इमेजिंग और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेजर माइक्रो विकिरण की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Immunofluorescent धुंधला हमें सही डीएनए क्षति के मिश्रण की जांच करने के लिए बनाया है और प्रत्येक लेजर शक्ति है, जो हमें बेहतर भर्ती और XRCC1 की अवधारण-GFP में मनाया परिवर्तन व्याख्या करने की अनुमति द्वारा प्रेरित प्रोटीन की भर्ती की अनुमति देता है । इन परिणामों के आधार पर, ४०५ एनएम पराबैंगनीकिरण का उपयोग मांक और SSBR प्रोटीन की परीक्षा के लिए सीमित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, इष्टतम प्रयोगात्मक डिजाइन उद्देश्य के बाद शक्ति माप शामिल हैं, एक पूर्ण क्षति प्रत्येक सेल लाइन के लिए मिश्रण लक्षण वर्णन, इस्तेमाल किया और भर्ती और प्रतिधारण के सत्यापन के साथ फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन में मनाया इम्यूनोफ्लोरेसेंस. जाहिर है, उपकरण, समय, और लागत विचार इन इष्टतम प्रयोगात्मक कुछ उपयोगकर्ताओं के लिए असंभव डिजाइन कर सकते हैं । हालांकि, इन तत्वों में से प्रत्येक के महत्व को यहां का प्रदर्शन किया है, और उपयोगकर्ताओं को मन में इन बातों को रखना चाहिए जब सूक्ष्म विकिरण प्रयोगों की शुरुआत ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस काम में इस्तेमाल सेल लाइनों के लिए पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान में डॉ शमूएल एच विल्सन का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope Nikon
NIS Elements software Nikon
355 nm laser PicoQuant VisUV Radiation source
Galvanometer photoactivation miniscanner Bruker
Microscope slide photodiode power sensor THORLabs S170C
Fiber photodiode power sensor THORLabs S150C
Digital handheld optical power and energy meter THORLabs PM100D
CHO-K1 From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential media Hyclone SH3026501
Fetal bovine serum Atlanta biologicals S11550
XRCC1-GFP Origene RG204952
Jetprime Polyplus transfection 11407
Geneticin ThermoFisher 10131035
4 chambered coverglass ThermoFisher 155382
8 chambered coverglass ThermoFisher 155409
Anti 53BP-1 Novus NB100304
Anti-phospho-histone H2AX  Millipore 05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimer Cosmo Bio clone CAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine  Trevigen 4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouse ThermoFisher A11029
Alexa 546 goat anti-rabbit ThermoFisher A11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher R37606 Caution toxic!
Phosphate buffered saline ThermoFisher 0780
Normal goat serum ThermoFisher 31873
Bovine serum albumin (BSA) Jackson Immuno Research 001-000-162
37% Formaldehyde ThermoFisher 9311 Caution toxic!
Ethanol Decon Labs 2716
Methanol VWR BDH1135 Caution toxic!
HCl Fisher SA49
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002 Caution toxic!
Tris Hydrochloride Amresco O234
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

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References

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