Summary
Konfokal Fluorescens mikroskopi og laser mikro-bestråling tilbyder værktøjer til inducerende DNA-skader og overvåge svaret fra DNA reparation proteiner i udvalgte sub nukleare områder. Denne teknik har betydeligt avancerede vores kendskab til skader påvisning, signalering og rekruttering. Dette manuskript viser disse teknologier for at undersøge enkelt og dobbelt strand bryde reparation.
Abstract
Meget koordineret DNA reparation veje findes for at opdage, punktafgifter og Udskift beskadigede DNA-baser og koordinere reparation af DNA strand pauser. Mens molekylærbiologiske teknikker har afklaret struktur, enzymatiske funktioner og kinetik af reparation proteiner, er der stadig behov for at forstå, hvordan reparation er koordineret i kernen. Laser mikro-bestråling tilbyder et stærkt værktøj til inducerende DNA-skader og overvågning ansættelse af reparation proteiner. Induktion af DNA skader ved laser mikro-bestråling kan forekomme med en vifte af bølgelængder, og brugere kan pålideligt fremkalde enkelt strand pauser, base læsioner og dobbelt strand bryder med en række doser. Her, laser mikro-bestråling bruges til at undersøge reparation af enkelt og dobbelt strand pauser induceret af to fælles Konfokal laser bølgelængder, 355 nm og 405 nm. Yderligere, rette karakterisering af den anvendte laser dosis for at fremkalde bestemte skader blandinger er beskrevet, så brugere kan reproducerbar udføre laser mikro-bestråling dataopsamling og analyse.
Introduction
Fluorescerende mikroskopi er opstået som en kraftfuld teknik til at visualisere cellulære arkitektur, undersøge protein lokalisering og overvågning af protein-protein og protein-DNA interaktioner. Brug af fluorescerende mikroskopi til at studere DNA skader svar efter anvendelsen af globale DNA skadelige agenser, såsom ultraviolet (UV) lys, har ioniserende stråling, kemiske oxidationsmidler eller alkylerende stoffer, og/eller kemoterapeutika givet ny indsigt i indledning, signalering og rekruttering af DNA reparere proteiner til websteder af DNA skade1,2. Men disse globale og asynkron ødelæggende begivenheder er begrænsende, hvis detaljerede oplysninger om rekruttering ordre, kinetik af association og dissociation, og relationer mellem centrale DNA reparation proteiner er søgt. Heldigvis har fremskridt i laser scanning Konfokal mikroskoper, bredere tilgængelighed af skader-inducerende laser bølgelængder, og forbedringer i fluorescerende proteiner i de sidste 25 år har givet forskere med forbedrede værktøjer til at undersøge disse aspekter af DNA reparation, gennem målrettede DNA skader induktion.
Bestråling af celler med laser microbeams for at studere cellulært og subcellulært funktioner er et veletableret redskab i celle og stråling biologi3. Anvendelse af denne teknik til undersøgelse af DNA reparation fremgik når Cremer og kollegaer brugt en meget fokuseret UV (257 nm) laser microbeam system til at fremkalde DNA-skader over en 0,5 µm spot i kinesisk hamster ovarie (CHO) celler4 og etableret induktion af DNA photolesions ved dette system5. Mens tilbyder betydelige forbedringer over UV microbeam metoder på tidspunktet, vedtagelsen af denne skadelige system var begrænset på grund af dens specialiseret sæt op, og dens evne til at generere bryder dobbeltstrenget (DSBs)6. Efterfølgende undersøgelse af en række UV-B (290-320 nm) og UV-en (320-400 nm) bølgelængder af en række grupper afslørede at UV photoproducts, oxidativ basere læsioner, enkelt streng bryder (SSBs), og DSBs kunne være fremkaldt afhængig af laser bølgelængde og magten anvendes4,7,8,9,10 (revideret i 3). Yderligere, kombinationer af disse UV-B og UV-A bølgelængder med sensibiliserende stoffer, som psoralen, bromodeoxyuridine (BrdU) og Hoechst farvestoffer, blev også konstateret for at inducere DNA skader afhængig af bølgelængde, magt og varigheden af eksponering, selvom strømmen skulle fremkalde skader er ofte sænket i nærværelse af disse agenter11,12,13,14,15. Disse fremskridt udvides brugen af mikro-bestråling, men der var stadig tekniske forhindringer skal behandles for bredere anvendelse af disse metoder.
Cremer og kollegaer betydeligt avancerede inden for mikro-bestråling ved netop at fokusere UV microbeam for at anvende betydelige skadelige energi over et stærkt lokaliseret område i cellen. Som Konfokal mikroskoper og laser microdissection systems avancerede, blev stramt fokuseret lys mere bredt tilgængelige; dog præsenterede kobling UV kilder til anvendelsesområder og beskæftiger sig med den kromatiske aberration de induceret stadig betydelige udfordringer til de fleste brugere3,6,16. Som UV farvestoffer steget i popularitet i hele 1990 ' erne, optik i stand til at fokusere og fanger UV-spændt fluorescens blev mere bredt tilgængelige16og forbedringer i laser scanning tilbydes brugerne fokuseret mulighed for at skabe meget UV excitation steder inden for celler6,17. Men det var ikke indtil de tidlige 2000 'er at den reelle virkning af denne kombination af stramt fokuseret bjælker med højere intensitet lasere mente, når talrige rapporter opstået demonstrerer, at DNA strand pauser kan induceres med og uden sensibiliserende i den UV-A range6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, og selv ved længere synlige bølgelængder som 488 nm27. Disse fremskridt er tilladt for mere udbredt anvendelse af mikro-bestråling teknik på en række kommercielle systemer. Parallelt med denne udvikling opstod to-foton teknikker også der tillod præcis induktion af DNA skade; Selvom disse fremskridt ikke vil blive diskuteret her, er der en række review artikler diskuterer disse metoder9,28,29,30.
Med den aktuelle tilgængelighed af Konfokal mikroskoper kan levere meget fokuseret UV-lys og udbredt tilgængelighed af fluorescerende proteiner til at tillade sporing af DNA reparation proteiner i realtid, mikro-bestråling teknikker har udviklet sig til kraftfulde værktøjer til at undersøge DNA skader svar og reparation veje. Men brugerne skal være klar over, at generation af DNA-skader er meget afhængige af laser bølgelængde og kraften påføres de sub atomare område. Brug af UV-C (~ 260 nm) bølgelængder giver mulighed for direkte DNA excitation og høj selektivitet for induktion af UV photoproducts7,8. UV-B og UV-A bølgelængder producerer blandinger af DNA-skader (base læsion, SSBs og DSBs), afhængig af den anvendte kraft og cellulære baggrunden udnyttet7. Endogene photosensitizers og anti-oxidant niveauet i de målrettede celler kan påvirke DNA skader blandinger fremstillet af disse bølgelængder. Derudover kan brug af eksogene photosensitizers (BrdU, etc.) hjælpe til at sænke den energi, der kræves til induktion af DNA-skader. Men disse agenser kan fremkalde DNA-skader sig selv, og de kan ændre cellecyklus og kromatin struktur, så deres anvendelse kan producere uønskede virkninger, der skal overvejes af brugeren. Derfor, før du bruger mikro-bestråling for at studere DNA skader svar og reparation, nøje overvejelse af DNA reparation pathway, de bølgelængder, der er tilgængelige til brug, og DNA skader blanding lavet er påkrævet.
Her, laser mikro-bestråling er udført på to almindeligt anvendte bølgelængder, 355 nm og 405 nm, uden sensibiliserende at demonstrere blandinger af DNA-skader induceret af disse bølgelængder og den indflydelse, disse skader blandinger have på behandlingen reparation afSSBs og DSBs. brugerne skal være klar over, at disse bølgelængder ikke skaber en enkelt art af strand pauser eller base læsioner. For at skelne mellem DNA repair veje, skal brugerne omhyggeligt kontrollere anvendt magt over en specifik region af kernen og karakterisere den inducerede skader ved hjælp af flere strand bryde markører og DNA læsion antistoffer. Hvis korrekt anvendt og karakteriseret, kan laser mikro-bestråling berige nogle arter af DNA-skader, tillade brugernes hen til vurdere reparation af base læsioner og SSBs eller DSBs, med nogle specificitet. Derfor har vi fastsat en metode, tillade brugernes hen til reproducerbar udføre laser mikro-bestråling, karakterisere DNA skader blandinger induceret af den anvendte laser dosis, og udføre dataanalyse.
Protocol
1. cellekultur og generation af stabil celler
- vokse CHO-K1 celler i minimal afgørende medium suppleret med 10% føtal bovint serum. Vedligeholde celler i en fugtig kuvøse med 5% CO 2 på 37 ° C.
- Transfect CHO-K1 celler med 1 µg plasmid DNA indeholder menneskelige XRCC1 med en C-terminale grøn fluorescerende proteiner (NGL) tag ved hjælp af en kommerciel Transfektion reagens efter fabrikanten ' s instruktioner.
- Vælg CHO-K1 celler stabilt at udtrykke den menneskelige XRCC1-NGL fusion ved hjælp af 800 µg/mL geneticin og berige den XRCC1-NGL udtrykke befolkning ved hjælp af fluorescens bistået celle sortering (FACS).
- Plade celler være mikro-bestrålet i kultur fartøjer med daekglas bunde, så de nå cirka 75% eller større confluency den følgende dag. Nogle mellemrum mellem celler er ønskeligt, især hvis du bruger registrering at vende tilbage til det samme billedfelt (beskrevet i afsnit 3.2).
2. Mikroskop set-up
- Vælg en laser scanning Konfokal mikroskop udstyret med passende lasere og optik og kontrol software til mikro-bestråling/photostimulation. Præsenteret eksperimenter brugen en laser scanning Konfokal mikroskop, der er blevet ændret til at omfatte en 355 nm laser, fiber-koblet til et galvanometer photoactivation miniscanner og styres ved hjælp af fabrikanten ' s kontrol og analyse software. Dette system kan udføre mikro-bestråling i en bruger-udpegede region af interesse (ROI) ved hjælp af photoactivation miniscanner (355 nm laser) eller den standard Konfokal Drejespoleinstrument (405 nm laser).
- Vælg bølgelængde bruges til mikro-bestråling, sikre, at alle optiske komponenter i mikro-bestråling lightpath er velegnet til den valgte bølgelængde.
Bemærk: Præsenteres systemet bruger en 40 × C-Apochromat (numerisk blænde (NA) 1.2) oliebestandighedsobjektet sammen med et UV filter kube til 355 nm mikro-bestråling, og en 20 × C-Apochromat (NA 0,75) tør mål ved hjælp af de standard Konfokal lightpath for 405 nm mikro-bestråling. 20 × målet anvendt i opsætningen af er ikke kompatibel med den 355 nm bølgelængde; derfor vi brugte de 40 × til 355 nm kun. Bruger tørre målet for skadelige tillader immunofluorescens protokoller skal anvendes nedstrøms uden rengøring off immersionsolie, hvilket er grunden til vi udnytte dette mål, når det er muligt. - Konfigurere mikroskop til mikro-bestråling eksperiment. For at bevare sammenhængen mellem eksperimenter, udpege en standardiseret konfiguration af mikroskop komponenter skal bruges til hver type af mikro-bestråling. Gemme disse indstillinger som en forudindstillet inden for mikroskopet ' s opererer software, hvis det er muligt.
Bemærk: I ordningen præsenteres celler er mikro-bestrålet og afbildet med envejs scanning, en scanningsopløsning på 1024 x 1024 pixels med 1 x scan zoom, på en rammehastighed på 8 rammer pr. sekund (fps), og med pinhole indstillet til ca 4 luftige enheder (AU), som fastsat for 488 nm laser (69 µm). Denne åbne pinhole indstilling blev valgt til at maksimere mængden af lys fanget i hvert billede, der tillader anvendelse af lavere imaging laser beføjelser og reducere photobleaching.
3. Laser mikro-bestråling
- plads det forberedte kultur parabol, der indeholder celler af interesse på mikroskop fase og lås sikkert på plads.
- Hvis den er tilgængelig, placere chambered dias i en fase-top inkubator og vedligeholde ved 37 ° C med 5% CO 2 under skader induktion. Dette trin er vigtigst for live-celle timelapse imaging eller imaging lange sessioner. Ellers sted celler i mikroskop på scenen og udføre bestråling ved stuetemperatur (~ 25 ˚C), og derefter hurtigt vende tilbage celler til en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Registrere billedfelter tillade forsker at vende tilbage til den samme placering efter udførelse af fiksering, farvning eller andre procedurer. Udføre registrering af beskadigede felter ved hjælp af en kodet, automatiseret mikroskop stage eller celle kultur daekglas fartøjer med en ætset eller mærket gitter af XY steder.
- Hvis ved hjælp af software billede registrering, Vælg en genkendelige træk ved kultur fartøj (dvs. hjørnet af daekglas eller barriere mellem wells), samle et billede og registrere XY placering. Dette vil give mulighed for justering og registrering af XY placeringer af markerede felter efter prøveforberedelse.
- Hvis du bruger manuel registrering, registrere gitter eller ætset placeringer for hvert felt manuelt, være omhyggelig med at registrere retningen og placeringen af skålen på scenen.
- Hvis ingen identificerende egenskaber for celle kultur fartøjer er tilgængelige, identificere beskadigede felter ved visuel inspektion af celle morfologi og tæthed. Sørge for at vælge felter med tilstrækkeligt forskellige funktioner til at være genkendelige under senere imaging.
Bemærk: Dette kan være tidskrævende at udføre medmindre orientering og området kultur fartøj er stramt begrænset.
- Marker et felt til mikro-bestråling og fokusere prøven. For celler, der udtrykker fluorescently mærket proteiner, skal du vælge brændplanet med maksimal nukleare tværsnit i fluorescerende kanal af interesse. For celler ikke udtrykker mærket proteiner, eller for dem uden klare nukleare lokalisering, fasekontrast eller differential interferens kontrast (DIC) billedbehandling kan bruges til at finde den korrekte fokalplan.
Bemærk: en nyttig funktion i fasekontrast og DIC imaging er det faktum, at brændplanet bevæger sig gennem prøven, den samme funktion kan vises lys eller mørk alt efter den relative fokalplan.- Vælg en klar funktion i kernen, såsom en nucleolus, og flytte brændplanet op og ned under iagttagelse af denne ændring i udseendet. Det sande brændplanet vil ligge inden for overgang fra lys til mørk. For at fokusere prøven, Vælg brændplanet, hvor den valgte funktion har den skarpeste kontrast.
- Registrere placeringen af feltet af interesse. Skabe et 3 x 3 pixel kvadrat Investeringsafkast mikroskop-softwaren, placere denne ROI over kernen i en celle for at være beskadiget og angive denne ROI at være skader ROI.
- Indsamle en pre skader billede, herunder placeringen af skader ROI.
- For eksperimenter, der ikke bruger fluorescerende proteiner, erhverve en fase-kontrast eller differential interferens kontrast (DIC) brightfield billede til at identificere og registrere kerner for skader.
- For live-celle eksperimenter ved hjælp af fluorescerende proteiner, erhverve et billede, der indeholder brightfield og fluorescens kanal for protein af interesse (dvs. laser linje 488 nm for excitation af normal god landbrugspraksis, laser linje 561 nm for excitation af RFP). I eksperimenter ved hjælp af CHO-K1 XRCC1-NGL, fluorescens ophidset af 488 nm laser linje blev samtidig indsamlet med de overførte DIC brightfield kanal.
- Indviede laser skade.
- i ordningen præsenteres kontrol laser dosis af den samlede tid brugt scanning skader ROI. Fordi Drejespoleinstrument for 355 nm laser opererer på en fast scan rate, laser dosis er kontrolleret af den tid gentagne gange scanning den valgte skader ROI: i dataene, der præsenteres her, mikro-bestråling på 355 nm udføres i 2 og 10 sekunder.
- Derimod styre 405 nm laser dosis af modulerende søgehastigheden og udføre en scanning af den valgte skader ROI. I data ppræsenteres her, bruge 8 og 0,5 fps for mikro-bestråling ved 405 nm. En scanning sats på 8 fps leverer en lavere laser dosis end 0,5 fps, fordi laseren bruger mindre tid på hver pixel under scanningen. Begge lasere drives ved 100% effekt. Se afsnit 3.7 vejledning på måling laser power direkte.
Bemærk: Hver enkelte mikroskop system kan variere i hvordan laser power er leveret til en udpeget ROI, svarende til hvordan den 355 nm og 405 nm afviger i den præsenteres system. Brugerne bliver nødt til at bestemme denne procedure for deres mikroskop system og rapportere disse parametre, inden for deres metoder sektioner. - For levende celle imaging, udfører timelapse billede erhvervelse af brightfield og fluorescens kanaler. Justere varigheden og hyppigheden af timelapse at optimere dataindsamling, ideelt indfange ophobning af de fluorescerende proteiner på skader ROI og dens dissociation i tiden løbet af eksperimentet. Eksperimenter ved hjælp af XRCC1-NGL indsamlede billeder hvert 30 sekund i 20 minutter.
Bemærk: hyppigheden af timelapse imaging kan begrænses af photobleaching af fluorophore, komplicerer analysen af ophobning og dissociation. Photobleaching kan vurderes ved observation ubeskadigede celler under timelapse og justere erhvervelse betingelser at minimere tab af fluorescerende signal i disse ubeskadigede celler. Nogle photobleaching kan være uundgåelig, så brugere kan kompensere for tab af signal ved at normalisere de fluorescerende intensiteter af beskadigede celler til dem af ubeskadiget celler i hver ramme af timelapse.- Efter tid kurset er fuldført, skal du vælge et nyt felt af celler til skade eller reparere beskadigede celler for yderligere analyse, som beskrevet i afsnit 4.
- Fortsæt mikro-bestråling og timelapse imaging indtil det ønskede antal beskadigede celler er nået.
Bemærk: Vi anbefaler skadelige ialt 10-25 celler pr. valgte tilstand for at vurdere den celle til celle heterogenitet i svar på den inducerede skader. Selv om de fleste Konfokal systemer vil indrømme brugernes hen til skade mere end én celle under hver mikro-bestråling, introducerer dette forskudt skader indledning gange, hvilket kan komplicere analyse af spidsbelastningen rekruttering over et stort antal celler eller dissociation tid for hurtig begivenheder. I nogle systemer, kan samtidig skader induktion over flere ROIs reducere laser dosis modtaget af hver uafhængig ROI. Derfor, medmindre disse timing/power emner behandles direkte af brugeren, anbefales det at celler blive beskadiget individuelt.
- For analyse af immunofluorescens (IF), udføre skader og enten umiddelbart løse celler, som beskrevet i afsnit 4, eller tillade celler til at reparere for udvalgte intervaller af tid (dvs. 1, 5, 10 eller 20 min). Efter den ønskede tid der går, lave og plette celler, som nærmere beskrevet i afsnit 4.
- At øge samlede celle nummer for hvis-analyse, beskadige flere felter inden for kultur fartøj til at generere en multi feltet tidsforløb efter skader reaktion. Optage XY placeringen af hvert felt og det tidspunkt, hvor skaden skete. Efter den ønskede samlede reparere tid standardtimeouttiden er udløbet, ordne og plette celler som beskrevet nedenfor.
- Efter at have observeret af protein ansættelse på valgte doser, foranstaltning og betænkningen laser power niveauer efter fiber og efter mål præcist karakterisere og rapportere laser doser. Vi bruger en kompakt digital wattmeteret og to forskellige fotodiode sensor hoveder; en koblet direkte til laser fiber til at måle efter fiber output, og den anden placeret på stadiet mikroskop til at måle post-objective output.
- Til at måle laser power, placere sensoren i den ønskede konfiguration (efter fiber eller post-objective) og udføre mikro-bestråling som beskrevet ovenfor, mens du optager målinger af wattmeteret. Vær opmærksom på at wattmeteret samplefrekvensen ikke kan være hurtig nok til at fange meget hurtig mikro-bestråling begivenheder, så det kan være nødvendigt at køre flere gentagelser af forsøg til at sikre, at wattmeteret præcist registrerer den anvendte dosis.
Bemærk: For 355 nm laser, vi målt en gennemsnitlig spidseffekt ca 5 mW post fiber og ca 19 µW efter mål. For 405 nm laser, mikro-bestråling blev udført i sløjfer af 30 gentagelser at overvinde 0,01 s maksimale samplefrekvensen wattmeteret og gennemsnitlige peak beføjelser på 1,5 mW og 2.4 mW blev målt ved hjælp af scanning hastigheder på 8 og 0,5 billeder pr. sekund , henholdsvis. Hver wattmeteret er forskellige. Brugerne skal fastlægge operationelle bølgelængder og prøveudtagning priser for deres individuelle wattmeteret.
- Til at måle laser power, placere sensoren i den ønskede konfiguration (efter fiber eller post-objective) og udføre mikro-bestråling som beskrevet ovenfor, mens du optager målinger af wattmeteret. Vær opmærksom på at wattmeteret samplefrekvensen ikke kan være hurtig nok til at fange meget hurtig mikro-bestråling begivenheder, så det kan være nødvendigt at køre flere gentagelser af forsøg til at sikre, at wattmeteret præcist registrerer den anvendte dosis.
4. Immunfluorescens farvning procedurer
- Analyze strand bryde induktion af hvis farvning.
- Fix celler med 3,7% formaldehyd (forsigtighed) i phosphat bufferet saltvand (PBS) for 10 min. aspirat formaldehyd løsning og vask 3 gange med PBS. Protokollen kan blive stoppet her ved at placere PBS tilbage på cellerne, og cellerne kan opbevares ved 4 ˚C for op til 1 uge.
Forsigtig: Formaldehyd er giftige og kræftfremkaldende. Slid passende personlige værnemidler og bortskaffe det giftige stof som instruerede af institutionelle miljømæssige sundhed og sikkerhed procedurer. - Permeabilize celler ved hjælp af 0,25% Triton X-100 i PBS for 10 min. ved stuetemperatur (RT) og derefter vask 3 gange med PBS.
- Bloker ikke-specifikke antistof bindende ved at inkubere for 30 min i PBS, som indeholder 1% bovint serumalbumin (BSA) på RT.
- Incubate med primære monoclonal antibody mod γH2AX og primære polyklonale antistoffer mod 53BP-1 begge fortyndet 1: 750 i PBS, som indeholder 1% BSA i 1 time på RT, og derefter vask 3 gange med PBS.
- Incubate celler med Alexa 488 ged anti-mus og Alexa 546 ged anti-kanin både fortyndet 1: 2000 i PBS, som indeholder 1% BSA i 1 time på RT og derefter vask 3 gange med PBS.
- Pletten nukleare DNA med 10 mg/mL opløsning af DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, forsigtighed) fortyndet til 1:5000 i PBS for 5 min, eller brug sammenlignelige nukleare farvestof, og derefter vask 3 gange med PBS.
Forsigtig: DAPI er giftige og mutagene. Bære passende personlige værnemidler og afhænde det giftige stof, som anvist af institutionelle miljømæssige sundhed og sikkerhed procedurer. - Sted PBS eller PBS + 0,1% natriumazid (forsigtighed) tilbage på de farvede celler. Protokollen kan blive stoppet her og celler opbevares ved 4 ˚C i flere dage, eller gå til image erhvervelse i afsnit 5.
Forsigtighed: natriumazid er giftigt. Bære passende personlige værnemidler og bortskaffer de giftige stoffer, som anvist af institutionelle miljømæssige sundhed og sikkerhed procedurer.
- Fix celler med 3,7% formaldehyd (forsigtighed) i phosphat bufferet saltvand (PBS) for 10 min. aspirat formaldehyd løsning og vask 3 gange med PBS. Protokollen kan blive stoppet her ved at placere PBS tilbage på cellerne, og cellerne kan opbevares ved 4 ˚C for op til 1 uge.
- Analyze induktion af base læsioner eller DNA adukter af hvis farvning.
- Fix og permeabilize celler i iskold methanol (forsigtighed) i 20 min. på -20 ° C.
Forsigtig: Methanol er giftige og brandfarlige. Bære passende personlige værnemidler og afhænde det giftige stof, som anvist af institutionelle miljømæssige sundhed og sikkerhed procedurer. - Opsug den migthanol og tillade prøven tørre helt i 15 min. protokol kan standses her og celler opbevares ved-20 ˚C tørre i op til 3 dage.
- Rehydrere celler i PBS for 15 min.
- Denature DNA ved hjælp af 2 N HCl (forsigtighed) for 45 min på RT og vask 3 gange med PBS.
Forsigtig: HCl er ætsende. Bære passende personlige værnemidler og afhænde den ætsende stof, som anvist af institutionelle miljømæssige sundhed og sikkerhed procedurer. - Neutraliser i 50 mM Tris-HCl pH 8,8 i 5 min. efterfulgt af 3 vasker med PBS.
- Incubate celler i blokerende buffer lavet med 5% normal ged serum og 0,1% Triton X-100 i PBS for 1 h på RT.
- Incubate med primære antistoffer for 8-oxo-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1: 400) eller cyclobutane pyrimidin dimer (CPD, 1:1, 000) i den ged serum blokerende buffer for 1 h i RT, og derefter vask 3 gange med PBS.
- Ruger celler med Alexa 488 ged anti-mus i forholdet 1: 2000 i ged serum blokerende buffer for 1 h i RT, og vask 3 gange med PBS.
- Pletten nukleare DNA ved hjælp af 1:5000 DAPI (10 mg/mL) i PBS i 5 min, og vask 3 gange med PBS.
- Hvis du bruger chambered daekglas, placere PBS eller PBS + 0,1% natriumazid tilbage på de farvede celler. Protokollen kan blive stoppet her og celler opbevares ved 4 ˚C i flere dage, eller gå til image erhvervelse i afsnit 5.
- Alternativt, montere cellerne i foretrukne montering medium, hvis en yderligere daekglas kan placeres på toppen af kultur fartøj. Når hærdet, monteret celler kan opbevares ved 4 ˚C i lange perioder.
- Fix og permeabilize celler i iskold methanol (forsigtighed) i 20 min. på -20 ° C.
5. Billed tilegnelse for immunofluorescens eksperimenter
- ren daekglas bunden af kultur fartøj med ethanol og læg den tilbage på stadiet Konfokal mikroskop. Sikre orientering og fartøjets på scenen position svarer til orientering og holdning registreres, hvornår skaden er fremkaldt. Sikre kultur fartøjet for at sikre optimal registrering og billeddannelse.
- Find tidligere afbildet felter ved hjælp af registrering teknik valgt (beskrevet i 3.2).
- Til manuel registrering ved hjælp af et daekglas med en ætset gitter, bringe gitteret i fokus og find identifikationsmaerker. Så brug optagede XY koordinater til at finde beskadigede celler.
- For image-baseret automatiseret registrering, Find den strukturelle funktion bruges som reference i trin 3.2.1, og derefter justere visningen aktuelle live mikroskop så tæt at det optagede billede som muligt. Når afstemt, måle den aktuelle XY mikroskop fase placering og sammenligne det med XY placeringen af referenceafbildningen. Den lineære afstand mellem de to lokationer definerer X og Y forskydningen. Anvende denne forskydning til hver registreret XY placering til at identificere billede eller felter der indeholder bestrålede cellen. Denne offset funktion kan automatiseret i mikroskop kontrol software eller udføres manuelt.
- Hvis ingen passende registrering point kunne identificeres, manuelt finde celler ved scanning af dias og placering af de tidligere identificerede celle funktioner.
- Erhverve billeder ved hjælp af passende mikroskop indstillinger til at indsamle alle farvede mål, herunder en brightfield billede (indstilling i afsnit 2.3 og fokuserer i afsnit 3.3). I præsenteret eksperimenter, multikanal billeder blev indsamlet ved hjælp af følgende excitation laser linjer og fluorophores: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 og overførte DIC brightfield) og 561 nm (Alexa 546). Alle lasere passere gennem en enkelt akustisk-optisk afstemmelige filter kontrollere transmission af både laser bølgelængde og power.
6. Live celle billedanalyse af ansættelse af fluorescerende proteiner til mikro-bestrålet websteder
- åben erhvervet billeder i et billede analyse program (dvs. NIS elementer eller ImageJ). Eventuelt kombinere før bestråling billedet med timelapse billeder til at generere en enkelt billedsekvens af før og efter skaden induktion. Brugere kan vise ansættelse ved at måle ændringer i fluorescerende intensitet over det bestrålede område i forhold til fluorescens intensitet måles på tværs af hele kernen (Se repræsentant resultater figur 1 B. ).
- For hver celle skal måles, først genererer en reference ROI, der repræsenterer kernen. Bruge en tærskel algoritme på det fluorescerende signal, som indeholder pixel udgør kernen, og derefter konvertere dette område til en ROI. Hvis det er nødvendigt, kan ROI drages manuelt i ved hjælp af brightfield som reference. Justere ROI løbet tid at sikre, det nukleare område er nøjagtigt dækket af ROI, og rapportere gennemsnitlige fluorescens intensiteten af de fluorescerende signal inden for denne ROI for hver frame.
- For hver celle måles oprette en 6 x 6 pixel ROI og Placer det over skader ROI for hver ramme selvfølgelig tid. Denne større Investeringsafkast er nu skader ROI for analyse. Indberette de gennemsnitlige ROI fluorescens intensitet for hver frame.
Bemærk: De fleste kommercielle billede analyse software indeholder moduler for 2D objekt tracking, og der er en række bruger-udviklede makroer for ImageJ eller FIJI, at lette hurtigere arbejdsgang og højere overførselshastighed (Se https://imagej.nih.gov/ij/plugins/). - Normalisere gennemsnitlige skader ROI fluorescens intensitet end en tilsvarende henvisning ROI i hver ramme af timelapse. Her, betyder nukleare fluorescens-intensiteten er brugt som reference ROI (Se repræsentative resultater, figur 1). normalisering kan udføres ved at fratrække den gennemsnitlige reference ROI fluorescens intensitet fra middelværdien beskadige ROI fluorescens intensitet, eller ved at dividere gennemsnitlige skader ROI fluorescens-intensiteten af den gennemsnitlige reference ROI fluorescens intensitet.
Bemærk: Normalisering af division kan give uforudsigelige resultater, hvis de anvendes i situationer med meget lav intensitet referenceværdier. - Gentag for alle beskadigede celler og for mindst to kontrol, ubeskadiget celler. Kontrol celle resultater kan bruges til yderligere normalisering, hvis det kræves.
- Graf normaliseret intensitetsværdierne over tid til at vise ændringer i rekruttering dynamics som en funktion af eksperimentel behandling.
7. Billede analyse af protein rekruttering opdaget ved immunfluorescens
- åben før og efter skaden billeder i et billede analyse program. Før skaden billeder indeholder skaden ROI(s) anvendes til mikro-bestråling. Afskrift ROI(s) og opklæbe i efter skader billederne til at identificere målrettede celler.
- Genererer en 6 x 6 pixel ROI for analyse af protein rekruttering og placere denne ROI på placeringen af skader ROI. Denne større Investeringsafkast er nu skader ROI for analyse. Indberette de gennemsnitlige skader ROI fluorescens intensitet.
- Normalisere gennemsnitlige skader ROI fluorescens intensitet end en tilsvarende reference ROI. Her, betyder nukleare fluorescens intensiteten af den skadede celle bruges som reference ROI (Se repræsentative resultater, figur 1). Generere reference Investeringsafkast ved hjælp af en tærskel algoritme på DAPI signal for at definere kernen, og derefter konvertere dette område til en ROI. Indberette de gennemsnitlige reference ROI fluorescens intensitet. Normalisering kan udføres ved at fratrække den gennemsnitlige reference ROI fluorescens intensitet fra den gennemsnitlige skader ROI fluorescens intensitet, eller ved at dividere den gennemsnitlige skader ROI fluorescens intensiteten af den gennemsnitlige reference ROI fluorescens intensitet.
Bemærk: Normalisering af division kan give uforudsigelige resultater, hvis de anvendes i situationer med meget lav intensitet referenceværdier. - Gentag for alle beskadigede celler, og udføre den samme analyse på mindst to kontrol celler, som beskrevet ovenfor.
- Graf normaliseret intensitetsværdierne for hver målt mikro-bestråling begivenhed mod tiden for at vise ændringer i protein ansættelse eller type af DNA-skader som en funktion af eksperimentel behandling.
Representative Results
Karakterisering af inducerede DNA-skader
Induktion af base læsioner og strand pauser er afhængig af den laser dosis anvendes til den valgte nukleare område og de cellulære mikromiljø celle model brugt7. Fluorescerende proteiner sammenvoksede til at reparere proteiner, som XRCC1, 53BP1, Ku70 eller Rad51, give nyttige enkelt og dobbelt aktionsdel pause markører for etablering af den nødvendige at se ophobning af en fluorescerende proteiner inden for en skade ROI ovenstående minimal energi den baggrund fluorescens9,19,31. Når betingelser, der inducerer en svar er fundet, er det kritisk at karakterisere skader blandingen induceret af den specifikke bølgelængde og dosis. Dæmpning af dosis og varighed ved bølgelængden bruges kan tillade bruger hen til bagatellisere dannelsen af komplekse skader blandinger. Lavt laser doser i rækken UV-A er blevet påvist for at producere overvejende SSBs og en lille mængde af base læsioner, passende til at studere SSBR og BER veje10,28. Øge dosis skaber mere kompleks base læsioner, oxidativ og UV-induceret, og inducerer mere betydningsfuldt antal DSBs7,10. Induktion af en enkelt art af DNA-skader er ønskeligt for undersøgelse af specifikke DNA reparation veje, men det er mere sandsynligt, at brugerne overtalelse en blanding af DNA læsioner, med en specifik læsion som SSBs at være meget hyppigere end base læsioner eller DSBs. Dette er lignende til DNA skader blandinger induceret af kemiske agenser som hydrogenperoxid (H2O2) eller methyl methanesulfonate (MMS)32. Brugere skal være opmærksomme, når de rapporterer om resultaterne, der skader blandinger kan forekomme, og omhyggelig karakterisering af dosis og læsioner på webstedet inducerede skader er nødvendige for at sikre reproducerbarhed og sammenlignelighed af resultaterne heraf.
I undersøgelser, mikro-bestråling bruges XRCC1-NGL ofte som en markør for induktion af base læsioner og SSBs9,28. XRCC1 er et stillads protein, som spiller en vigtig rolle i SSB reparation (SSBR) og base excision reparation (BER), og også deltager i andre reparation veje, ligesom nukleotid excision reparation (NER)33,34,35 . Det spiller en vigtig koordinerende rolle i DNA reparation, interagere med en række vigtige proteiner, herunder poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1), DNA polymerase β (Pol β), og DNA ligase III. Vi udnyttede XRCC1-NGL stabilt udtrykt i CHO-K1 celler for at bestemme de laser doser, der kræves til at generere SSBs og DSBs. Vi først identificeret den mindste dosis nødvendig for at fremkalde en observerbar ansættelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis for hver bølgelængde (figur 1). For 355 nm bølgelængde, en 2 s hviletiden over den definerede skader ROI genereret en øget fluorescerende signal inden for det Investeringsafkast, der angiver induktion af DNA-skader, der var spores over baggrunden (fig. 1A). For 405 nm, en 8 fps scan rate var nødvendige for at generere en observerbar rekruttering til skade ROI (fig. 1A). Dosis blev derefter øget (10 s for 355 nm og 0,5 fps til 405 nm) til at oprette en mere intens skade ROI (fig. 1A).
Rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis i stedet for induceret skade blev derefter overvåges af timelapse billeddannelse. Fastholdelse af protein i stedet for DNA-skader kan indikere igangværende DNA reparation, mens dissociation af protein fra webstedet af inducerede skader er ofte betragtes som en markør for færdiggørelsen af BER eller SSBR. Dog er der ingen klare beviser, der forbinder dissociation af XRCC1 fra laser-induceret DNA skader websteder med færdiggørelsen af reparation. Rekruttering af protein til stedet, hvor skaden er målt ved rapportering betyder intensiteten af de fluorescerende signal inden for den beskadigede ROI over den gennemsnitlige fluorescerende signal målt for hele kernen (figur 1B). Denne form for normalisering hjælper adresse intensitet udsving i den nukleare signal, selvom andre normalisering teknikker kan være ansat afhængigt af den cellulære fordeling af protein af interesse. Her, er XRCC1 lokaliseret i den nukleare rum, så normalisering på det nukleare område måler omfordeling af signalet til skade ROI. ROI gennemsnitlige fluorescerende intensiteten registreres derefter for hvert billede i timelapse, herunder pre skade billedet, og grafen som funktion af tiden (figur 1C).
Vi kendetegnet derefter yderligere skader induceret af de to valgte laser doser at undersøge dannelsen af DNA base læsioner. For det første var dannelsen af CPD, en omfangsrig UV-induceret læsion, probed ved immunfluorescens som markør for NER type læsioner (fig. 2A). Derefter, den oxidativt induceret base lesion8-oxodG var probed som markør for BER type læsioner (figur 2B). Ingen signifikant stigning i CPD læsioner blev observeret på lavdosis udsættelse for begge bølgelængder (2 s for 355 nm og 8 fps til 405 nm), mens høje dosis behandling i både bølgelængder (10 s for 355 nm og 0,5 fps til 405 nm) viste en betydelig stigning i fluorescerende signal observeret inden for skader ROI (fig. 2A). En scatter plot af CPD ROI betyde intensitet for hver beskadigede celle viser heterogenitet i skader dannelsen og registrering på både bølgelængder og doser, der angiver, at et lavt niveau af CPD læsioner kan være til stede på de lavere doser, men belastningen kan ikke være væsentligt opdaget indtil en højere dosis anvendes. Scatterplot foreslår også at ineffektivitet i påvisning af antistof, der kan begrænse nøjagtig kvantificering af skader blandinger.
Det fremhæves yderligere i påvisning af oxidativt induceret DNA læsioner af markør 8-oxodG. Ingen tydelig stigning i fluorescerende signal inden skaden ROI blev observeret for 8-oxodG på enten laser bølgelængde eller dosis anvendes (figur 2B). Antistof anvendes til dette arbejde er i overensstemmelse med tidligere publikationer9,10,36; dog skal det bemærkes, at der kan være begrænsninger i at observere dannelsen af 8-oxodG med antistoffer37,38. Bekræftelse af manglen på oxidativt induceret læsioner er også anbefalet af en anden markør, som ansættelse af 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), enzymet ansvarlig for fjernelse af 8-oxodG fra DNA10. Vi ikke observere OGG1 rekruttering til vores DNA skader websteder; men dannelsen af lave niveauer af oxidativt induceret DNA skader ikke kan udelukkes helt.
Endelig undersøgte vi dannelsen af DSBs ved hjælp af to markører, γH2AX og 53BP-1, på selected laser doser ved immunfluorescens (figur 3 & 4). ΓH2AX er almindeligt anvendt som en strand bryde markør, men dets specificitet for DSBs har spurgt i en række rapporter39,40. Desuden er det en fosforylering begivenhed, der udbreder fra webstedet strand pause så lokalisering af signalet til en strand ferie kan være begrænset på grund af dette signal formering. Derfor, kombinere γH2AX med 53BP-1 giver mulighed for mere præcis vurdering af DSB dannelse inden for skader ROI.
Svar af γH2AX og 53BP-1 til mikro-bestråling er både bølgelængde og dosisafhængige. Den lave dosis (2 s) stimulation på 355 nm fremkalder nogen reaktion på 5 og 20 min, og en svag og variable svar 10 min post bestråling (fig. 3A) for begge markører. Høj dosis (10 s) 355 nm mikro-bestråling inducerer en øget fluorescerende signal inden for skader ROI på 5, 10 og 20 min post bestråling, der er reduceret til 40 min (fig. 3B). Disse resultater tyder på, at omhyggelig med titrering af 355 nm dosis er påkrævet for at minimere cross-stimulation af reparation veje, som det fremgår af den reducerede påvisning af dobbeltstrenget pause markør γH2AX på de tidlige tidspunkt punkter (< 20 min) på den lave dosis anvendes.
Lignende forsøg blev udført ved hjælp af både lav (8 fps) og høj dosis (0,5 fps) 405 nm laser stimulation (figur 4). Ved denne bølgelængde blev betydelige ophobning af fluorescerende intensitet inden for skader ROI observeret for både 53BP-1 og γH2AX uanset anvendte dosis, der angiver, at disse doser genererer en kompleks blanding af enkelt og dobbelt strand bryder næsten umiddelbar efter induktion af DNA-skader (figur 4). Derudover de høje doser af 405 nm viser en stigning i pan-nukleare γH2AX farvning inden for 10 min af skader induktion (fig. 4B, nederst) der vanskeliggør påvisning af skade ROI til rapport, mens en 53BP-1 ophobning er mere indeholdt i skader ROI.
Disse resultater viser tydeligt at 405 nm mikro-bestråling ikke er passende til overvågning af SSBR eller BER, og at flere markører for DNA adukter og strand pauser skal være ansat til fuldt ud at beskrive den inducerede læsioner og DNA reparation svar.
Dosisafhængig ændring i rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis
Når den inducerede DNA-skader er blevet karakteriseret, kan laser mikro-bestråling være en ideel platform for at studere dynamikken i DNA reparation proteiner. XRCC1-normal god landbrugspraksis fastholdelse og dissociation forsvindingskinetik viser en dosis afhængighed (figur 1), som ikke er uventet i betragtning induktion af forskellige skader blandinger af hver bølgelængde. De højeste bestråling doser (10 s og 0,5 fps) viser en højere intensitet rekruttering af XRCC1-normal god landbrugspraksis i forhold til de lavere doser og længere fastholdelse af XRCC1-NGL i stedet for skader i 20 min. tid løbet (figur 1C). Dette indikerer, at DNA-skader oprettet ved højere doser for både 355 og 405 nm er sandsynligvis ikke løst i løbet af eksperimentet, som er i overensstemmelse med det udseende og fastholdelse af DSB markører, γH2AX og 53BP-1 (figur 3 & 4 ).
Interessant, Vis de lavere skader doser (2 s og 8 fps) hurtig ansættelse af XRCC1-NGL til skade websteder og dissociation af XRCC1-normal god landbrugspraksis i eksperimentel tid løbet før bestråling niveauer (figur 1C). Uden komplet karakterisering af skader blandingen, kan dette føre til den konklusion, at SSBs og base læsioner er helt løst ved hjælp af disse skadelige betingelser. Men tilstedeværelsen af γH2AX og 53BP-1 ved 40 min. til 355 nm og 5 min. til 405 nm kan føre til forskellige fortolkninger. For 355 nm 2 s dosis, skader blandingen kan være overvejende SSBs, så udseendet af DSB markører på 40 min tyde på at nogle unrepaired læsioner kan føre til DSBs eller at DSBs genereret af denne energi er repareret på en længere tidshorisont. Skala tidsforskelle mellem SSBR og DSB reparation har været tidligere rapporteret28,41,42. På samme måde, 405 nm lav dosis (8 fps) dissociation kan indikere et lavt niveau af SSBs eller en klynge af SSBs, der hurtigt omdannes til DSBs, som har været kendt for høj skade mikro-bestråling og andre DNA skadelige agenser tidligere43, 44 , 45.
Sammen disse resultater fremhæve betydningen af kendetegner induceret skade blandinger og udnytter flere DNA reparere proteiner og markører for at fortolke rekruttering og fastholdelse af DNA reparere proteiner på lokaliteter af induceret skade.
Figur 1 . Laser mikro-bestråling inducerer ansættelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis.
(A) CHO-K1 celler stabilt udtrykker XRCC1-normal god landbrugspraksis var bestrålet og afbildet før og umiddelbart efter skader induktion. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling dosis og skalalinjen er 10 µm. (B) rekruttering er målt ved bestemmelse af den gennemsnitlige fluorescerende intensitet inden for skader ROI og normalisering betyder fluorescerende intensiteten af den hele kernen. (C) Dynamics af ansættelse kan måles for hvert timelapse billede. Grafer er repræsentant for to uafhængige forsøg med fejllinjer repræsenterer SEM (n = 24). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Laser mikro-bestråling inducerer nukleotid skader.
CHO-K1 celler blev udsat for laser mikro-bestråling og fast umiddelbart efter skader induktion. Immunfluorescens blev udført for at opdage CPD og 8-oxodG adukter. (A) top, scatter plot af ROI gennemsnitlige fluorescens intensiteter observeret i beskadigede celler efter CPD farvning. Bunden, repræsentative billeder af CPD farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm (n = 12). (B) repræsentative billeder for 8-oxodG farvning. PileAngiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . DNA dobbeltstrenget pause markører reagerer på 355 nm mikro-bestråling i en dosis afhængige måde.
CHO-K1 celler blev udsat for mikro-bestråling og fast på den tid punkter angivet efter stimulation. Immunfluorescens for DSB markører γH2AX og 53BP-1 blev udført. (A) scatter plot af normaliserede skader ROI betyde fluorescens intensiteter målt for ubeskadigede og beskadigede celler. Fejllinjer er repræsentative for SEM (n = 12). (B) repræsentative billeder for γH2AX og 53BP-1 farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. DNA dobbeltstrenget pause markører håndfast reagere på 405 nm mikro-bestråling.
CHO-K1 celler blev udsat for mikro-bestråling og fast på tid punkter anførte indlæg stimulation. Immunfluorescens for DSB markører γH2AX og 53BP-1. (A) scatter plot af normaliserede skader ROI betyde fluorescens intensiteter målt for ubeskadigede og beskadigede celler. Fejllinjer er repræsentative for SEM (n = 12). (B) repræsentative billeder for γH2AX og 53BP-1 farvning. Pilene angiver placeringen af mikro-bestråling og skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Bruger betingelserne beskrevet her, kan enhver Konfokal mikroskop med en UV-A eller 405 nm laser, enten integreret af fabrikanten eller tilføjet af slutbrugeren, fremkalde DNA skader inden for kernen i en celle og tillade ansættelse af DNA reparation proteiner til stedet for induceret DNA skader kan overvåges. Men, som anført i protokollen og repræsentative resultater, bølgelængde udvælgelse, anvendes magt, og skader karakterisering er alle vigtige spørgsmål, som skal behandles først af brugeren for at studere en bestemt DNA reparation pathway. Derudover er der andre overvejelser i eksperimentelle design, der skal også tages i betragtning af brugere.
For at overvåge en protein adfærd i levende celler post mikro-bestråling, en fluorescently mærket protein skal oprettes. Tilgængeligheden af en bred vifte af fluorescerende proteiner, der kan adskilles spektralt tilbyder værktøjer til at skabe protein fusioner, der kan anvendes til karakterisering af cellulære svar til induktion af DNA-skader. Forbigående Transfektion af fluorescerende proteiner af interesse giver mulighed for hurtig screening af skadelige betingelser, mutationer eller endda hæmmere, mens stabilt transfekteret celler giver mere kontrol over udtryk niveauer og giver mulighed for andre biokemiske beskrivelser skal udføres, validering af mikro-bestråling resultater. Spektralt forskellige fluorescerende proteiner kan også udnyttes i den samme celle til at overvåge interaktioner mellem proteiner inden for den samme sti eller i forskellige veje. Fluorescerende proteiner også fjerne behovet for specifikke antistoffer for hvert protein af interesse og give mulighed for levende celle overvågning af protein opførsel i lang tid efter induktion af skader.
Brug af fluorescerende proteiner har dog også ulemper. Uden genetiske baggrunde mangelfuld i de(n) af interesse, vil endogene proteiner konkurrere med fluorescently mærket proteiner. Konjugation af fluorescerende tag til N eller C endestation for proteinet kan ændre proteinfoldning, hindre vigtige protein-protein interaktioner eller blokere translokation signaler; ændre funktion og potentielt påvirker rekruttering dynamics. Disse virkninger er blevet påvist i en række rapporter hvor immunfluorescent farvning demonstreret dramatisk anderledes rekruttering og retentionstiderne for endogene proteiner på skade site28. Brug af forbigående Transfektion eller stabil kloner kan også ændre svar observeret, typisk gennem variationer i protein udtryk niveauer. Yderligere, brugen af flere fluorescerende proteiner i en enkelt eksperiment kan også ændre dynamikken i rekruttering, hvis protein niveauer ikke er ekvilibreres godt eller ansættelse af de større fluorescently markeret protein blokerer ansættelse af andre proteiner . Endelig, fluorescerende proteiner kan fungere som svage sensibilisering agenter, øge dannelsen af reaktive ilt arter, og potentielt ændre DNA skader blandinger induceret46,47. Trods disse ulemper tilbyder fluorescerende proteiner en række forskellige fordele i at studere DNA reparation med mikro-bestråling, og hvis brugerne indarbejde hensigtsmæssige kontrolforanstaltninger, som skader karakterisering beskrevet her, de kan give ny indsigt i skader svar og protein-protein interaktioner3.
Hvis der ikke kræves levende celle imaging, kan immunofluorescens bruges til at overvåge svar til induceret skade. Ved fastsættelse af celler på bestemte tidspunkter efter skader induktion og farvning med antistoffer specifikke for proteiner og læsioner af interesse, statisk snapshots af skader induktion og rekruttering og fastholdelse af reparation proteiner kan bygges. Antistoffer kan bruges til at overvåge ansættelse af flere proteiner af renter og posttranslationelle modifikationer induceret af DNA skade svar. Brug af immunofluorescens eliminerer behovet for fluorescerende proteiner, og giver mulighed for endogene protein adfærd undersøges. Denne metode har imidlertid også sine ulemper. Meget specifikke antistoffer er nødvendige, og permeabilization og blokerende procedurer skal optimeres for at muliggøre påvisning af ansættelse med tilstrækkeligt signal intensitet. Fastsættelse af procedurer er ikke øjeblikkelig, og denne fysiske begrænsning begrænser den tidsmæssige opløsning af denne fremgangsmåde. Kortlægning stedet for skader induktion, så cellerne kan findes igen efter farvning kan også præsentere væsentlige udfordringer. Konfokal mikroskop bruges i dette arbejde giver mulighed for image-baseret registrering som beskrevet ovenfor, så beskadigede celler kan flyttes med høj præcision. Hvis scenen registrering eller ætset daekglas ikke er tilgængelig, den tid investeringer involveret i kan bufferzonen celler uden fase registrering, kombineret med den iboende forsinkelse mellem skader induktion og afbildet ansættelse, gøre immunfluorescens uattraktive for nogle brugere. Dog vil de mest nøjagtige og fuldstændige mikro-bestråling eksperimentelle design indarbejde disse typer af tilgange parallelt med brug af fluorescerende proteiner, som beskrevet i den præsenterede protokol.
Her, bruges både levende celle imaging og immunfluorescens til at påvise nytten af laser mikro-bestråling. Immunfluorescent farvning gør det muligt for os præcist undersøge blanding af DNA skade lavet og ansættelse af proteiner induceret af hver laser power, som giver os mulighed for bedre at kunne fortolke de observerede ændringer i rekruttering og fastholdelse af XRCC1-normal god landbrugspraksis. Baseret på disse resultater, bør brugen af 405 nm lasere være begrænset til undersøgelse af BER og SSBR proteiner. Yderligere, den optimale eksperimentelle design ville omfatte magt målinger efter målet, en fuld skader blanding karakteristika for hver cellelinje bruges og validering af rekruttering og fastholdelse observeret i fluorescently mærkede proteiner med immunfluorescens. Selvfølgelig, udstyr, tid og omkostninger overvejelser kan umuliggøre disse optimale eksperimentelle design for nogle brugere. Men betydningen af hvert af disse elementer er vist her, og brugere bør holde disse overvejelser i tankerne ved starten af mikro-bestråling eksperimenter.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Samuel H. Wilson på National Institute of miljømæssige sundhed Sciences for cellelinjer bruges i dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| 355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
| Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
| Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
| Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
| Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
| CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
| Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
| XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
| Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
| Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
| 4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
| 8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
| Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
| Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
| Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
| Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
| Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
| Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
| Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| 37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
| HCl | Fisher | SA49 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
| Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
- Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
- Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
- Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
- Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
- Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
- Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
- Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
- Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
- Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
- Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
- Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
- Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
- Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
- Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
- Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
- Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
- Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
- Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
- Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
- Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
- Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
- London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
- Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
- Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
- Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
- Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
- Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
- Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
- Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
- Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
- Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
- Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
- Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
- Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).
