En enkel og effektiv microinjection protokoll for genet redigering i kanalen Gråsteinbit embryoer bruker CRISPR/Cas9 systemet er presentert. I denne protokollen, guide RNAs og Cas9 protein var microinjected i eggeplomme av en celle embryo. Denne protokollen er validert av banke ut to kanalen Gråsteinbit immun-relaterte gener.
Komplett genomet av kanalen steinbit, Ictalurus punctatus, har blitt sekvensert, fører til større muligheter for å studere kanalen Gråsteinbit gen funksjon. Gene knockout har blitt brukt til å studere disse genet funksjoner i vivo. De klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR tilknyttet protein 9 (CRISPR/Cas9) er et kraftig verktøy som brukes til å redigere genomisk DNA-sekvenser for å endre gen funksjon. Mens den tradisjonelle tilnærmingen har vært å innføre CRISPR/Cas9 mRNA i én celle embryo gjennom microinjection, kan dette være en langsom og ineffektiv prosess i steinbit. Her er en detaljert protokoll for microinjection av kanalen Gråsteinbit embryo med CRISPR/Cas9 protein beskrevet. Kort, egg og sperm var samlet og deretter kunstig befruktning utført. Befruktede egg ble overført til en Petriskål inneholder Holtfreters løsning. Injeksjon ble kalibrert og deretter lede RNAs/Cas9 rettet mot toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM 1) gene og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet ble microinjected i eggeplomme av en celle embryo. Den gene knockout var vellykket indeler ble bekreftet av DNA sekvensering. Anslåtte protein sekvens endringer på grunn av disse mutasjonene inkludert frameshift og avkortet protein på grunn av tidlig stopp kodon.
Microinjection er en vanlig laboratoriet teknikken brukes til å levere en liten mengde av et stoff som DNA, RNA, protein og andre makromolekyler i celler eller embryo gjennom glass kapillær1. Microinjection utføres med spesialutstyr installasjonen inkludert en microinjector, micromanipulator og et mikroskop2. Teknikken har blitt brukt av forskere genetisk endre mange organismer gjennom generasjon transgenics, gene fortrenging og genterapi, med sikte på å forstå dynamikken i intracellular komponentene3,4 , 5.
Kanalen Gråsteinbit (Ictalurus punctatus) er den mest populære steinbit arten innen akvakultur og fritidsfiske aktiviteter i USA. Det er et økende behov for å studere funksjonell genomforskning i kanalen Gråsteinbit sekvensering av komplett genomet av kanalen Gråsteinbit forbedrer nytten av nylige fremskritt i genomet redigering verktøy6,7. Forstå gen funksjon ville ikke bare berike forskningen som blir gjennomført steinbit, men kan også føre til mer effektiv genetisk forbedring programmer å forbedre steinbit industrien. Når kritiske gener for en gitt egenskap av interesse er identifisert, kan de brukes til å forbedre genetisk steinbit produksjon gjennom genomet redigering for å generere gunstig alleler, valg for disse alleler, undertrykke de ødeleggende alleler, overføre de gunstige alleler gjennom transgenesis, eller en kombinasjon av disse alternativene. Kombinere beste genene for ulike kommersielt nyttige egenskaper fra ulike arter i en fisk ville forbedre produktiviteten og lønnsomheten av fisk produksjon operasjoner8.
Gene knockout er en direkte metode å studere genet funksjoner i vivo. Mutasjoner på DNA nivå vil bli arvet av fremtidige generasjoner som vil lette studiet av deres effekter i ulike generasjoner. Forskjellige genomet redigeringsverktøy er utviklet inkludert sink finger nucleases (ZFNs), transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs), og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9 ) systemet9,10,11,12.
CRISPR/Cas9 systemet er et kraftig, effektive verktøy som er brukt til å redigere genomisk DNA-sekvenser inkludert gene knockout i fisk til RNA-guidede områdespesifikke DNA cleavage5,13. Systemet består av en guide (gRNA), som bestemmer målrettet rekkefølgen genomet og en DNA endonuclease enzym, Cas9. CRISPR/Cas9 systemet kan utformes til å målrette en sekvens i genomet med flere fordeler sammenlignet med ZFNs og TALENs: (1) lavere pris (2) lettere engineering (3) mer spesifikke binding av guide RNA til målet sekvensen, og reduserte off-målet mutasjoner (4) flere sekvenser kan være målrettet med forskjellige gRNA på samme tid (5) høyt mutagenese satsen i gener som ikke kunne være mutert ved TALENs, og (6) forbedret germline overføringshastigheten av mutasjoner for opptil 6-fold sammenlignet med ZFNs og TALENs14, 15,16,17,18.
Den viktigste alternative metoden for microinjection er electroporation, der elektriske impulser brukes embryoer eller celler å øke membran permeabilitet og opptaket av biologiske molekyler19,20. Flere transgene fisk ble generert ved hjelp av electroporation som medaka (Oryzias latipes), sebrafisk (Danio rerio), chinook laks (Oncorhynchus tshawytscha), kanalen Gråsteinbit, Brie (Sparus sarba), og felles karpe (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
Electroporation har blitt brukt til å levere plasmider DNA, RNA og Cas9 protein for genet knockout. I pattedyrceller, Cas9/gRNA plasmider DNA, Cas9 mRNA/gRNA og Cas9 protein/gRNA komplekser ble levert med electroporation og de mutagenese prisene var høyest med Cas9 protein/gRNA komplekser for de fleste electroporation forhold testet27. I ascidian Ryggstrengdyr (Ciona intestinalis) var TALENs uttrykke konstruksjoner electroporated i befruktede egg å indusere knockout flere gener28. ZFNs uttrykke plasmider konstruksjoner var electroporated å slå ut luteiniserende hormon i kanalen Gråsteinbit29. Men når introdusert i cellen, plasmider konstruksjoner må transkribert til RNA og oversatt til funksjonelle proteiner før de kan målrette ønsket DNA sekvensen, som trolig forsinke tiden av mutagenese sammenlignet med microinjection av / protein. Som en fosteret utvikler, øker forsinket mutagenese mosaicism av injisert grunnleggere. I tillegg er transgene uttrykk usannsynlig å oppnå det uttrykket mulig med microinjection, senke mutagenese effektivitet.
Som et middel for å innføre genomet redigeringsverktøyene i celler, har microinjection flere fordeler fremfor electroporation. Genomet redigering molekyler kan bli pålitelig introdusert i celler eller embryo gjennom microinjection30. Mindre injeksjon materiale er nødvendig. Det er lett å bestemme beløpene materiale injisert. Høyere mutasjon priser med lav mosaicism i grunnlegger fisken kan være oppnådd som ville forbedre germline overføring av mutasjoner F1. Færre grunnlegger fisk må analyseres for å produsere første generasjon, på grunn av høyere Mutasjonshastigheten. I electroporation må mer grunnlegger fisk analyseres som øker kostnadene. Overlevelsen av kanalen Gråsteinbit microinjected embryoer er imidlertid lavere enn electroporated seg, selv om dette kan overvinnes ved å injisere mer embryo31,32. I kanalen Gråsteinbit, overlevelse av eggeplomme-microinjected embryo varierte fra 16 til 55%, avhengig av gener målrettet og dosering av gRNA/Cas9 protein32.
Vanlige microinjection av steinbit embryo er teknisk krevende og tidkrevende, men en rask og effektiv CRISPR/Cas9 protein microinjection protokoll presenteres for kanalen Gråsteinbit embryoer. Denne protokollen krever mindre tid og ekspertise siden CRISPR/Cas9 protein løsningen injiseres i eggeplomme av én celle embryo. Hundrevis av befruktet egg kan injiseres i 1 h (ca tiden nødvendig for første celledeling oppstår). For å validere protokollen, slått to sykdom mottakelighet-relaterte gener ut i kanalen Gråsteinbit, toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) genet og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet. TICAM 1 er involvert i signalveien initiert av toll-like reseptor (TLR) 3. I kanalen Gråsteinbit var TICAM 1 dramatisk upregulated etter bakteriell utfordring med Edwardsiella ictaluri, mens det var downregulated i blå steinbit, en art motstandsdyktig til E. ictaluri33. RBL spiller en viktig rolle i tidlig infeksjon med Flavobacterium columnare, den utløsende agenten for columnaris sykdom, der akutt og solid upregulation ble spilt inn i en columnaris-følsomme kanalen Gråsteinbit belastning sammenlignet med en columnaris-resistent stamme34.
En detaljert protokoll for microinjection av kanalen Gråsteinbit embryo å oppnå genet knockout ble presentert. Injeksjon av CRISPR/Cas9 protein i eggeplomme er mye enklere, sparer tid og krever ikke omfattende opplæring i forhold til microinjecting blastodisc av en celle embryoet, som er den vanlige fremgangsmåten for de fleste genoverføring og gene redigering med fisk 30 , 42. gjeldende protokollen viste seg for å være vellykket i inducing indeler i kana…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av USDA-NIFA prisen 2015-67015-23488 til Roger Cone. Forfatterne takker Dr. Ronald Phelps for beskrivelsen av Foreldreomsorg og yngelens lager utvalgskriterier i videoen. Ahmed Elaswad og Karim Khalil gjerne takke egyptiske kulturelle og pedagogiske byrå i Washington DC for finansiering deres doktorgrad forskning.
Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |