Summary
Эта рукопись описывает модель мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частицы, которая является идеальной животной модели для оценки взаимодействия частиц износа и различные клетки в асептических рыхления.
Abstract
Износ частиц индуцированной остеолиза является основной причиной асептического рыхления артропластика провалом, но основной механизм остается неясным. Из-за давно прослеживаний необходимую для обнаружения и спорадических случаев это сложно оценить ofparticle индуцированной остеолиза патогенеза в клинических случаях. Таким образом оптимальная Животные модели необходимы для дальнейших исследований. Мышиных модель черепа остеолиза, создана под воздействием частиц CoCrMo является эффективным и действительным инструментом для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы были впервые получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. После двух недель мышей были принесены в жертву, и Кальвария образцы были собраны; качественные и количественные оценки были исполнены гематоксилином и эозином и Микро Компьютерная томография. Преимущества этой модели включают в себя простоту процедуры, количественная оценка потери костной массы, быстрота развития остеолиза, потенциального использования трансгенных или нокаут моделей, и относительно низкой стоимости. Однако эта модель не может использоваться для оценки механических сил и хронические эффекты частиц в асептических рыхления. Мышиных подвздошную остеолиза модель, созданная под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между износ частиц и различные клетки, например, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических рыхления.
Introduction
Разрыхление асептическое является наиболее распространенной причиной всего тазобедренного сустава (THA) и всего коленного сустава (ТКА) провал, который требует пересмотра хирургии1. Однако основной механизм остается неясным2. Длинные последующей деятельности требуется для обнаружения частиц индуцированной остеолиза, чье появление редко; Таким образом это сложно для изучения патогенеза в клинических случаях. Таким образом дальнейшие исследования, посвященные сложные механизмы клеточной и тканевой требуют как в естественных условиях экспериментов в носить модели частиц индуцированной остеолиза и в пробирке анализов в клетках, относящиеся к кости гомеостаза3. Действительный животных модель имеет важное значение в раскрытии эффекты частиц износа на потери костной массы, предоставления доказательств для дальнейшего сотовой анализов.
Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo это эффективный и действительный метод для оценки взаимодействия между частицами и различные клетки в асептических рыхления. В этой модели CoCrMo частицы вызывают подвздошную остеолиза, вызывая воспалительные cytokines в макрофагах, активация остеокластов, остеобластов распространения и поощрения остеобластов апоптоз.
Это займет всего две недели для создания этой модели. Остеолиза могут быть визуализированы и количественно гематоксилином и эозином (H & E) и Микро Компьютерная томография (микро CT)2. Кроме того эта модель имеет сравнительно низкой стоимости и трансгенных и нокаут мыши, что модели могут использоваться для экран большое количество соединений в различных дозах3.
Процедура создания и оценивать эту модель очень проста. Во-первых CoCrMo частицы были получены высокого вакуума тремя электродами постоянного тока и высокомобильна в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл. Затем 50 мкл в результате приостановления был применен к середине мышиных Кальвария после разделения черепной надкостницы, острый рассечение. Мышей были принесены в жертву после двух недель, и Кальвария образцы были собраны; качественный и количественный анализы на H & E пятнать andmicro-CT.
Мышиных подвздошную остеолиза модель построена под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между CoCrMo частиц и различные клетки, макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты, в асептических ослабление.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Нанкин.
1. CoCrMo частиц подготовка
- Получите CoCrMo частицы, используя сфабрикованные высокого вакуума тремя электродами постоянного тока4. Место CoCrMo сплава в обсуждаемый документ 10-3 ПА вакуум, 0,04 МПа аргона и водорода 3:2 (v/v) и 650 A катод текущей.
- Измерьте диаметры CoCrMo частиц.
- Добавьте 1 мг CoCrMo частиц в 1,5 мл безводного этилового спирта.
- Ресуспензируйте CoCrMo частиц в безводном этаноле ультразвуковой встряхивания на 28 кГц и 600 Вт на 5 мин.
- Нанесите одну каплю (около 20 мкл) результирующий подвески на объективную таблицу просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА). Захват серии фотографий ТЕА на 200 кв ускорение напряжения и 0.24 резолюции Нм.
- Используйте предоставленное программное обеспечение для расчета среднего диаметра и размер распределение частиц в ТЕА микроскопии.
- Обеззараживанию эндотоксины
- Автоклав 50 g частиц для 15 мин при температуре 121 ° C и 15 psi.
- Обнаружения эндотоксинов, количественного анализа Limulus Lysate амебоцит (Лал) (< 0,25%, чтобы указать отсутствие эндотоксинов считался ЕС/мл)5.
- Ресуспензируйте частицы в фосфат амортизированное saline (PBS) в концентрации 50 мг/мл как Стоковый раствор6.
2. Построение модели подвздошную остеолиза
- Анестезировать 6 неделя старый C57BL/J6 мышей (шесть мышей на группу) withpentobarbital (50 мг/кг). Используйте Пинч тест для оценки уровня анестезии. Предотвращения высыхания глаз с нормальное saline.
- Место мыши в лежачем положении. Удаление мех на череп с бритвы и дезинфекции кожи с помощью медицинских ватные шарики, содержащего 75% этанола.
- Для локализации точки определите две точки, включая среднее положение между двумя глазами и ушами, соответственно. Затем определите линии между двумя выше пунктов и надрезать кожу вдоль линии выше с ножницами (рис. 1A).
- Удалите головы надкостницы из Кальвария с скальпель (рис. 1B)6.
- Шовный материал кожи на обоих концах с простой Прерванный швом.
- Сделать линию шва через середины разреза без завязывать. Держите два концы линии швов.
- Внедрить 50 мкл CoCrMo частиц суспензии (50 мг/мл, в PBS) в середине глядя (рис. 1 c)2.
- Узел последний стежок в простой Прерванный шов (рис. 1 d).
- Сохранить мыши еще 2 недели.
3. Оценка модели подвздошную остеолиза микро КТ сканирование
- Пожертвуйте мышей с двуокиси углерода. Обезглавить мышей в горизонтальной плоскости. Удаление ткани мозга внутри и кожу и мех снаружи. Урожай глядя для дальнейших экспериментов.
- Аккуратно очистите всех мягких тканей на Кальвария с помощью пинцета. Исправьте очищается глядя в параформальдегида 4% при температуре 4 ° C для 24 h. погрузиться глядя в PBS 24 h до микро КТ.
- Анализировать глядя мышей с высоким разрешением микро CT в изометрии резолюции 18 мкм и параметры энергии рентгеновского 45 кв и 550 мА.
- Проведения трехмерной реконструкции микро КТ данных с программным обеспечением.
- Качественный и количественный анализ.
- Во-первых выберите квадратный регион вокруг средней линии шва как области интереса.
- Во-вторых, измерить минеральной плотности костной ткани (BMD), кость объем/общий объем (BV/TV), Трабекулярная номер (Tb.N), Трабекулярная толщина (Tb.Th), Трабекулярная разделения в интервал (Tb.Sp) и процент общей пористости с помощью предоставленного программного обеспечения для микро CT.
- В-третьих Сравните три группы для различных измерений, односторонний дисперсионный анализ. Для post hoc дисперсионный анализ применять метод Бонферрони2.
4. Оценка подвздошную остеолиза модели на H & E пятнать
- Известь Кальвария образцов в 15% этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА)-PBS при 4 ° C. Измените решение декальцинации каждый день в течение 3 недель.
- Внедрить decalcified образцы в парафин для 2 см x 1 см x 1 см куб и нарезать их на 2 мкм секции в области осаждения частиц.
- Пятно секции с гематоксилином и эозином как описано7.
- Захватить микроскопии общего pathomorphism, световой микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Собственного производства наноразмерных частиц CoCrMo были около 50 Нм (стандартная ошибка 3.56) в диаметре, как количественно ТЕА (рис. 2). После заражения мыши глядя CoCrMo частиц, животных (n = 6 для каждой группы) были сохранены еще две недели. В течение двух недель полностью исцелился подвздошную разрез, и шов может упасть. Любые местные инфекции или исправления может повлиять на оценку потери кости. После мыши жертвы были собраны образцы Кальвария. Затем все мягкие ткани мягко был очищен, и микро CT была использована для количественного определения потери костной массы. Из трехмерной реконструкции изображения и представитель корональных фотографии в поперечном сечении значительные костной потери было отмечено у мышей, получавших с CoCrMo частицами (рис. 3). Костной минеральной плотности (BMD), кость объем/общий объем (BV/TV), Трабекулярная номер (Tb.N) и трабекулярной толщина (Tb.Th) были значительно снижены, в то время как в CoCrMo были значительно увеличены общей пористости и трабекулярной разделения в интервал (Tb.Sp) Группа по сравнению с группами операции управления и Шам (рис. 4). Студент-t-тест был использован для оценки различий между группами и p < 0,05 считался статистически значимой. Кроме того H & E окрашивание участков Кальвария подтвердил потери костной массы у мышей, получавших с CoCrMo частицами (рис. 5).
Рисунок 1 : Схематические модели мыши частиц индуцированной остеолиза (PIO). Левой стороне показывает положение мыши в моделировании. (A) точки локализации. Определите среднее значение между двумя глазами и ушами, соответственно и надрезать кожу вдоль линии между ними. (B) предоставлять и удалить черепной надкостницы от Кальвария. (C) вставить CoCrMo подвеска частиц в середине Кальвария. (D) шовные кожи в простой Прерванный швов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Передача электронной микроскопии сканирование CoCrMo частиц. (A) представитель передачи электронной микроскопии изображений CoCrMo частиц. (B) распределение частиц по размерам частиц CoCrMo был количественно с помощью программного обеспечения. Каждый бар представляет частоту, нормированная на общее количество частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ микро-CT с 3-мерной реконструкции образцов от управления мышей и те относились с PBS (фиктивные операции) и частиц CoCrMo. Белая горизонтальная линия показывает расположение поперечных изображения. Белая стрелка указывает на потерю костной массы в группе имплантации CoCrMo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Количественный анализ микро КТ изображений после трехмерной реконструкции. Количественная оценка костной минеральной плотности (BMD) (A), кости объем/общий объем (BV/TV) (B), процент общей пористости (C), Трабекулярная номер (Tb.N) (D), Трабекулярная толщина (Tb.Th) (E)и трабекулярной разделение/интервал (Tb.Sp) (F), в mean±standard ошибка. Студент-t-тест был использован для оценки различий между группами, с p < 0,05 считается статистически значимым. **, P < 0,01; , P < 0,001. n = 6 мышей для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель изображения H & E окрашивания образцов Кальвария (10 ×) от управления мышей и те относились с PBS (фиктивные операции) и CoCrMo частица. Красная стрелка указывает остеолиза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует два основных метода для износа частиц индуцированной остеолиза у мышей: воздух мешочек модель и модель черепа остеолиза. В модели воздуха мешочек сначала устанавливается подкожно сгенерированный воздуха мешочек, следуют введение частиц износа и имплантации в костной ткани8. Мешочек стены имитирует надкостницы в асептических рыхления. Однако костной имплантация nonvascular с не биологической активностью, что делает его трудно оценить прямое взаимодействие между частицами и костной ткани. Подвздошную остеолиза модель имеет ряд преимуществ над воздуха мешочек коллегой. Во-первых носить частиц непосредственно подвергаются воздействию Кальвария, что делает его возможным для оценки взаимодействия между частицами износа и кости гомеостаза, включая костную резорбцию и остеобластов, остеокластов и макрофагов деятельности9,10 . Во-вторых доступны количественные измерения потери костной массы, позволяя оценки различных потенциальных подходов генетических и биологических агентов в костной потери предупреждения11. В-третьих это позволяет оценить взаимосвязь между частицами износа и потери костной массы в различных генетических традиций, в том числе трансгенных и Джин нокаут мышей12,13. В-четвертых она может использоваться для экран большое количество соединений в различных дозах. Однако процент успеха модели остеолиза traditionalcalvarial является относительно низким, и используя кости histomorphometry для измерения остеолиза делает результаты менее объективные1.
Для улучшения успеха модели и визуализации результатов более объективными, были сделаны некоторые изменения. Во-первых наноразмерных частиц были использованы для расширения взаимодействия между Кальвария и носить частиц. Действительно взаимодействие между наноразмерных частиц и Кальвария повышается по сравнению с коммерчески сплава частицы, с средним диаметром 1,5 мкм14,15. Во-вторых зона2 1.0 см на Кальвария был разделенное для достижения адекватного воздействия Кальвария. В-третьих микро CT и трехмерной реконструкции были использованы для количественной оценки потери костной массы.
Существует несколько ограничений в нынешней модели. Во-первых, микро CT оборудование для мышей не широко доступны для исследователей и технических специалистов, необходимых для сканирования и трехмерной реконструкции. Во-вторых CoCrMo наночастиц, используемых в настоящее время модели не являются коммерчески доступными, и их производство опирается на поддержку от материаловедения техников. В-третьих эта модель не представляет хроническое воздействие на костной массы частиц и не хватает-биологические факторы, связанные с остеолиза, например колебательной давление жидкости или механических сил. Эффективность модели может быть значительно увеличена с помощью наноразмерных частиц и достаточно воздействия Кальвария. Потеря костной массы может быть определена количественно, и более объективных данных, полученных с микро CT.
Мышиных подвздошную остеолиза модель создана под воздействием частиц CoCrMo является идеальным инструментом для оценки взаимодействия между CoCrMo частиц и различные клетки, такие как макрофаги, фибробласты, остеобластов и остеокласты в асептических рыхления. Кроме того ряд препаратов может быть проверена их воздействия на асептическое рыхления, с помощью этой модели.
Есть много важных шагов этой процедуры. Во-первых, применение наночастиц CoCrMo с средний диаметр 50 Нм. Во-вторых было достигнуто надлежащее воздействие Кальвария. Зона2 1.0 см на Кальвария было достаточно в этой модели, и надкостницы на Кальвария следует расчлененный тщательно и полностью. Ясно, рассечение надкостницы усиливается взаимодействие между частицами и Кальвария. В-третьих количественного измерения потери костной массы, микро CT возможен. Количественные измерения потери костной массы из трех трехмерной реконструкции, таких как противоракетная оборона, BV/ТВ, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp и процент общей пористости, сделать его легче отличить костной потери различия в различных процедур и предоставить убедительные доказательства о остеолиза, по сравнению с традиционными кости histomorphometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Фонд национального естественных наук Китая (81572111), клинические науки и технологии проекта Фонд провинции Цзянсу (BL2012002), проект научных исследований Нанкин (201402007), естественные науки Фонд провинции Цзянсу (BK20161385) и Специальный фонд китайский врач ассоциации (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
