Summary
Este manuscrito describe un modelo murino osteolysis calvarial por exposición a partículas de CoCrMo, que constituye un modelo animal ideal para la evaluación de las interacciones entre las partículas de desgaste y diversas células en aflojamiento aséptico.
Abstract
Osteólisis inducida por partículas de desgaste es una de las principales causas del aflojamiento aséptico en el fracaso de la artroplastia, pero el mecanismo subyacente es incierto. Debido al largo seguimiento necesarios para detección y ocurrencia esporádica, es difícil evaluar la osteólisis inducida por el ofparticle de patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, modelos animales óptimos se requieren estudios adicionales. El modelo murino de osteólisis calvarial establecido por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta eficaz y válida para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, las partículas de CoCrMo primero fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina con tampón fosfato a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Después de dos semanas, los ratones fueron sacrificados y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron evaluaciones cualitativas y cuantitativas por hematoxilina y eosina y micro tomografía computada. Los puntos fuertes de este modelo incluyen simplicidad de procedimiento, evaluación cuantitativa de la pérdida de masa ósea, rapidez de desarrollo de osteólisis, uso potencial transgénico o knockout modelos y un costo relativamente bajo. Sin embargo, este modelo no puede utilizarse para evaluar la fuerza mecánica y efectos crónicos de las partículas en aflojamiento aséptico. Modelo murino osteolysis calvarial generado por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de desgaste y varias células, por ejemplo, los macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.
Introduction
Aflojamiento aséptico es la causa más común de artroplastia total de cadera (THA) y fracaso de la artroplastia (TKA) total de la rodilla, que requiere de cirugía de revisión1. Sin embargo, el mecanismo subyacente permanece claro2. Una carta recordativa larga es necesaria para detectar la osteólisis inducida por partículas cuya ocurrencia es rara; por lo tanto, es un reto a explorar su patogenesia en casos clínicos. Por lo tanto, estudios más centrados en mecanismos celulares y tejidos complejos requieren que ambos experimentos en vivo en usan modelos de la osteólisis inducida por partículas y en vitro ensayos en células relacionadas con la homeostasis3del hueso. Un modelo animal válido es importante en revelar los efectos de las partículas de desgaste en la pérdida ósea, proporcionando la evidencia para otros ensayos celulares.
Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es un método efectivo y válido para evaluar las interacciones entre las partículas y diversas células en aflojamiento aséptico. En este modelo, partículas de CoCrMo causan osteólisis calvarial induciendo citoquinas inflamatorias en macrófagos, activación de osteoclastos, inhibiendo la proliferación de osteoblastos, y promover la apoptosis de osteoblastos.
Sólo se tarda dos semanas para establecer este modelo. Osteólisis puede ser visualizada y cuantificada por hematoxilina y eosina (H & E) coloración y micro computarizada de tomografía (micro-CT)2. Además, este modelo tiene un ratón de relativamente bajo costo y transgénico y knockout modelos pueden utilizarse para un gran número de compuestos en diversas dosis3.
El procedimiento para establecer y evaluar este modelo es simple. En primer lugar, las partículas de CoCrMo fueron obtenidas por alto vacío de tres electrodos corriente y resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL. Entonces, 50 μl de la suspensión resultante se aplicó a la mitad de la calvaria murino después de la separación del periostio craneal por agudo disección. Los ratones fueron sacrificados después de dos semanas, y se cosecharon muestras de la calvaria; se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos por H & E tinción andmicro-CT.
Un modelo murino osteolysis calvarial construido por exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de CoCrMo y varias células, como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos, en aflojamiento aséptico.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Nanjing.
1. preparación de la partícula CoCrMo
- Obtener partículas de CoCrMo mediante alto vacío fabricadas tres electrodos corriente4. Aleación de CoCrMo lugar en el instrumento bajo 10-3 Pa vacío, 0,04 MPa argón y 3:2 (v/v) de hidrógeno y 650 A cátodo actuales.
- Medir los diámetros de las partículas de CoCrMo.
- Añadir 1 mg de CoCrMo partículas en 1,5 mL de etanol anhidro.
- Resuspender las partículas CoCrMo en etanol anhidro por agitación ultrasónica a 28 kHz y 600 W durante 5 minutos.
- Aplicar una gota (aproximadamente 20 μl) de la suspensión resultante de la tabla objetivo de microscopio electrónico de transmisión (TEM). Serie de fotos TEM en el voltaje de aceleración de 200 kV y 0,24 nm resolución de captura.
- Utilice el software suministrado para calcular la distribución tamaño medio diámetro y partícula en micrografías TEM.
- Descontaminación de endotoxinas
- Autoclave de 50 g de partículas durante 15 min a 121 ° C y 15 psi.
- Detectar endotoxinas por un análisis cuantitativo de amebocitos de Limulus Lysate (LAL) (< 0,25% consideró indican ausencia de endotoxina UE/mL)5.
- Resuspender las partículas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 50 mg/mL solución stock6.
2. construcción del modelo Calvarial Osteolysis
- Anestesiar el 6 semana de edad C57BL/J6 (seis ratones por grupo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilice la prueba del pellizco para evaluar el nivel de anestesia. Prevenir la resequedad de los ojos con solución salina normal.
- Lugar de ratones en la posición propensa. Quitar la piel sobre el cráneo con una afeitadora y desinfectar la piel utilizando las bolas de algodón médico que contiene el etanol del 75%.
- Para el punto de localización, identificar dos puntos, incluyendo los puntos medios entre los dos ojos y las orejas, respectivamente. Luego, determinar la línea entre los dos más puntos y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea de arriba con unas tijeras (figura 1A).
- Retire el periostio craneal del calvaria con un bisturí (figura 1B)6.
- Piel en ambos extremos de la sutura con sutura interrumpida simple.
- Hacer una línea de sutura a través del centro de la incisión sin anudar. Sujete los dos extremos de la línea de sutura.
- Incorporar 50 μl de suspensión de partículas de CoCrMo (50 mg/mL en PBS) en medio de la calvarias (figura 1)2.
- Nudo la última puntada de la sutura interrumpida simple (figura 1).
- Mantener los ratones durante otras 2 semanas.
3. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por la exploración Micro-CT
- Sacrificar a los ratones con dióxido de carbono. Decapita a los ratones en el plano horizontal. Retire el tejido cerebral dentro y la piel y la piel exterior. La cosecha la calvarias para experimentos adicionales.
- Aclarar suavemente todo el tejido suave en el calvaria con pinzas. Fijar el calvarias despejado en paraformaldehído al 4% a 4 ° C por 24 h. sumergir calvarias en PBS 24 h antes de la exploración micro-CT.
- Analizar la calvarias ratones mediante micro-CT en alta resolución en una resolución isométrica de 18 μm y la configuración de energía de rayos x de 45 kV y 550 mA.
- Llevar a cabo la reconstrucción tridimensional de los datos con el software micro-CT.
- Análisis cuantitativo y cualitativo.
- En primer lugar, seleccione la región cuadrada alrededor de la sutura de la línea media como la región de interés.
- En segundo lugar, medir la densidad mineral ósea (DMO), osea el volumen total volumen (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th), separación/separación trabecular (Tb.Sp) y porcentaje de porosidad total con el software suministrado para micro-CT.
- En tercer lugar, comparar los tres grupos para las distintas medidas por ANOVA unidireccional. Para el análisis post-hoc de la varianza, aplicar el método de Bonferroni2.
4. evaluación del modelo de osteólisis Calvarial por tinción H & E
- Descalcificar muestras de calvaria en 15% ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiar la solución de descalcificación cada día durante 3 semanas.
- Incrustar las muestras descalcificadas en parafina para un 2 x 1 cm x 1 cubo de cm y cortar en secciones de 2 μm en la zona de deposición de partículas.
- Mancha las secciones con hematoxilina y eosina como describió anteriormente7.
- Capturar imágenes de la pathomorphism general por microscopia ligera.
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Representative Results
Las partículas de nanoescala producido interno CoCrMo fueron alrededor de 50 nm (error estándar de 3.56) de diámetro, como cuantificado por TEM (figura 2). Después de la exposición de ratón calvarias a partículas de CoCrMo, los animales (n = 6 por grupo) se mantuvieron durante dos semanas. Dentro de dos semanas, la incisión calvarial fue curada completamente, y la sutura puede caer. Cualquier infección local o no sindical puede afectar la evaluación de la pérdida de hueso. Después del sacrificio del ratón, se cosecharon muestras de calvaria. Entonces, todos los tejidos blandos con suavidad fue aclarado, y micro-CT fue utilizado para cuantificar la pérdida de hueso. Imágenes de reconstrucción tridimensional tanto representante coronales fotografías en la sección transversal, la pérdida ósea significativa se observó en ratones tratados con partículas de CoCrMo (figura 3). Densidad mineral (DMO) del hueso, hueso volumen total volumen (BV/TV), número trabecular (Tb.N) y grosor trabecular (Tb.Th) se redujeron significativamente, mientras que la porosidad total y la separación/separación trabecular (Tb.Sp) aumentaron significativamente en el CoCrMo Grupo en comparación con los grupos de operación control y simulada (figura 4). Prueba t de Student se utilizó para evaluar las diferencias entre los grupos y p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Además, H & E tinción de secciones de calvaria confirmó la pérdida de hueso en ratones tratados con partículas de CoCrMo (figura 5).
Figura 1 : Esquema del modelo de ratón de la osteólisis inducida por partículas (PIO). La izquierda muestra la posición del ratón en el modelado. (A) punto de localización. Determinar los puntos medios entre los dos ojos y las orejas, respectivamente y haga una incisión en la piel a lo largo de la línea entre ellos. (B) exponer y retirar el periostio craneal del calvaria. (C) suspensión de partículas de CoCrMo incrustar en medio del calvaria. (D) la sutura piel en sutura interrumpida simple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Transmisión análisis de microscopia electrónica de partículas de CoCrMo. (A) imágenes de microscopia electrónica de transmisión representante de CoCrMo partículas. (B) distribución de tamaño de partícula de las partículas de CoCrMo se cuantificó con el software. Cada barra representa la frecuencia normalizada para el número total de partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis de micro-CT con la reconstrucción 3 dimensional de muestras de ratones de control y los tratados con PBS (operación simulada) y partículas de CoCrMo. La línea horizontal blanca indica la ubicación de la imagen de corte transversal. La flecha blanca indica la pérdida ósea en el grupo de implantación de CoCrMo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis cuantitativo de imágenes micro-CT después de la reconstrucción tridimensional de. Cuantificación de hueso densidad mineral (DMO) (A), volumen del volumen total de hueso (BV/TV) (B), porcentaje de porosidad total (C), número trabecular (Tb.N) (D), espesor trabecular (Tb.Th) (E)y trabecular separación/separación (Tb.Sp) (F), en mean±standard error. Prueba t de Student se utilizó para evaluar las diferencias entre los grupos, con p < 0,05 considerado como estadísticamente significativo. **, P < 0.01; , P < 0.001. n = 6 ratones por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Imágenes representativas de H & E tinción de muestras de la calvaria (10 ×) de ratones de control y las trataron con PBS (operación simulada) y partículas de CoCrMo. Flecha roja indica el osteolysis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Existen dos métodos principales para la osteólisis inducida por partículas de desgaste en ratones: el modelo de bolsa de aire y el modelo de osteólisis calvarial. En el modelo de bolsa de aire, una bolsa de aire subcutáneo generada se establece primero, seguido por la introducción de partículas de desgaste y la implantación en el tejido óseo del8. La pared de bolsa imita el periostio en aflojamiento aséptico. Sin embargo, la implantación de hueso es no vascular sin actividad biológica, que hace difícil evaluar las interacciones directas entre las partículas y el tejido óseo. El osteolysis calvarial tiene varias ventajas sobre la contraparte de la bolsa de aire. En primer lugar, las partículas de desgaste expuestas directamente al calvaria, lo que permite evaluar las interacciones entre las partículas de desgaste y hueso homeostasis, incluyendo la resorción del hueso y los osteoblastos, osteoclastos y macrófagos actividades9,10 . En segundo lugar, las medidas cuantitativas de la pérdida de hueso están disponibles, permitiendo la evaluación de varios posibles enfoques genéticos y biológicos de prevención de pérdida ósea11. En tercer lugar, es posible evaluar la relación entre las partículas de desgaste y pérdida de masa ósea en diferentes fondos genéticos, incluyendo transgénicos y genes knockout ratones12,13. En cuarto lugar, puede ser utilizado para un gran número de compuestos en varias dosis. Sin embargo, la tasa de éxito del modelo de osteólisis traditionalcalvarial es relativamente baja, y utilizando histomorfometría ósea osteolisis de medir hace que los resultados menos objetivo1.
Para mejorar la tasa de éxito del modelo y render resultados más objetivos, se hicieron varias modificaciones. Primero, las partículas de nanoescala fueron utilizadas para mejorar las interacciones entre la calvaria y partículas de desgaste. De hecho, las interacciones entre partículas a nanoescala y el calvaria es mayor en comparación con comercialmente partículas de aleación, con un diámetro medio de 1,5 μm14,15. En segundo lugar, una zona de2 cm 1,0 en la calvaria fue delineada para lograr la exposición adecuada de la calvaria. En tercer lugar, la reconstrucción micro-CT y tridimensional se utilizaron para cuantificar pérdida de masa ósea.
Existen varias limitaciones en el modelo actual. Primer equipo de micro-CT para ratones no está ampliamente disponible para los investigadores y técnicos son necesarios para la reconstrucción tridimensional y análisis. En segundo lugar, las nanopartículas de CoCrMo utilizadas en el modelo actual no están comercialmente disponibles, y su producción cuenta con el apoyo de técnicos de la ciencia de los materiales. En tercer lugar, este modelo no representa efectos crónicos de las partículas en la masa ósea y carece de factores no biológicos relacionados con osteólisis como presión oscilatoria o fuerzas mecánicas. La eficacia del modelo podría incrementarse significativamente con la ayuda de partículas de nanoescala y suficiente exposición de la calvaria. Pérdida de masa ósea podría ser cuantificada, y datos más objetivos obtienen con micro-CT.
Un modelo murino osteolysis calvarial establecido por la exposición a partículas de CoCrMo es una herramienta ideal para evaluar las interacciones entre las partículas de CoCrMo y diversas células como macrófagos, fibroblastos, osteoblastos y osteoclastos en aflojamiento aséptico. Además, una serie de medicamentos puede probar sus efectos en el aflojamiento aséptico usando este modelo.
Hay muchos pasos críticos de este procedimiento. La primera es la aplicación de nanopartículas de CoCrMo con un diámetro promedio de 50 nm. En segundo lugar, se logró la exposición adecuada de la calvaria. Un área de 1.0 cm2 en el calvaria era bastante en este modelo, y el periostio en el calvaria debe ser disecado cuidadosamente y completamente. Una clara disección del periostio intensifica la interacción entre las partículas y calvaria. En tercer lugar, una medida cuantitativa de la pérdida de hueso por micro-CT es posible. Las medidas cuantitativas de la pérdida de hueso de tres reconstrucción tridimensional, como la DMO, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp y porcentaje de porosidad total, que sea más fácil distinguir las diferencias de pérdida de hueso en diversos tratamientos y proporcionan evidencia sólida de Osteólisis en comparación con la histomorfometría ósea tradicionales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81572111), la clínica de la ciencia y tecnología proyecto de Fundación de la provincia de Jiangsu (BL2012002), el proyecto de investigación científica de Nanjing (201402007), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (BK20161385) y la Fundación especial de asociación médico chino (2015COS0810).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoCrMo alloy from prosthesis | Waldemar Link GmbH & Co | GEMINI MK II | Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles |
| Fabricated high-vacuum three-electrode direct current | College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology | Self designed machine | |
| 6 week old male C57BL/6J mice | Model animal research center of Nanjing University | N000013 | |
| 100% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691514023 | Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W603 | |
| Microanalytical balance | Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD | EX125DZH | |
| Ultrasonic shaker | Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD | YH-200DH | To suspend CoCrMo nanoparticles |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G20 | |
| SimplePCI software | Compix Inc. | 6.6 version | To calculate the mean diameter and particle size distribution. |
| High-handed sterilization pan | QIULONGYIQI | KYQL-100DS | To decontaminate endotoxin |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay | Charles River | R13025 | To detect endotoxin |
| 15 ml Microcentrifuge tubes | Taizhou Suyi Medical | B122 | |
| Phosphate-buffered saline | Boster Biological Technology | AR0030 | Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | P3761 | To anesthetize mice |
| Normal saline | SACKLER | SR8572EP-15 | To prevent drying of mice eyes |
| 75% Ethanol | Nanjing Reagent | C0691560275 | Disinfection |
| Medical cotton ball | Shuitao | 1278298933 | Disinfection |
| Shaver | Kemei | KM-3018 | To shave the fur |
| Scissor | RWD LIFE SCIENCE | S12005-10 | To incise skin |
| Suture | RWD LIFE SCIENCE | F34001-01 | To suture skin |
| Needle holder | RWD LIFE SCIENCE | F33001-01 | To suture skin |
| Needle | RWD LIFE SCIENCE | R14003-12 | To suture skin |
| Vessel forceps | RWD LIFE SCIENCE | F22003-09 | To suture skin |
| Scalpel | RWD LIFE SCIENCE | S31010-01 | To harvest calvaria |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | To harvest calvaria |
| 100 µL pipettes | Eppendorf | 3120000240 | To embed particles suspension in the calvatias |
| 100 µL pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | To embed particles suspension in the calvatias |
| 5 ml Microtubes | Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD | W621 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | Fixation |
| Micro Computed Tomography | SkyScan | SkyScan1176 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid | Servicebio | G1105 | Decalcification |
| Paraffin | Servicebio | #0001 | |
| Paraffin slicing machine | Leica | RM2125RTS | |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | |
| Cover glass | Servicebio | 200 | |
| HE staining kit | Servicebio | #1-5 | HE staining |
| Light microscope | Nikon | E200 |
References
- Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
- Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
- Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
- Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
- Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
- Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
- Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
- Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
- Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774 (2015).
- Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
- Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853 (2015).
- Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
- Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
- Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).
