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Medicine

Costruzione e valutazione di un modello murino Osteolysis Calvarial tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo in allentamento asettico

doi: 10.3791/56276 Published: February 17, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto descrive un modello murino calvarial osteolisi da esposizione a particelle di CoCrMo, che costituisce un modello animale ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule nella mobilizzazione asettica.

Abstract

Osteolisi indotta da particelle di usura sono delle principali cause di allentamento asettico in un arthroplasty fallimento, ma il meccanismo di fondo rimane poco chiaro. A causa del lungo follow-up necessari al rilevamento ed avvenimento sporadico, è difficile per valutare l'osteolisi indotta da ofparticle patogenesi nei casi clinici. Quindi, modelli animali ottimale sono richiesti per ulteriori studi. Il modello murino di osteolysis calvarial stabilito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. Dopo due settimane, i topi sono stati sacrificati, e sono stati raccolti campioni di calvaria; valutazioni qualitative e quantitative sono state eseguite da ematossilina ed eosina e micro tomografia computata. I punti di forza di questo modello includono procedura semplicità, la valutazione quantitativa di perdita dell'osso, la rapidità di sviluppo di osteolisi, uso potenziale transgenico o Knock e un costo relativamente basso. Tuttavia, questo modello non può essere utilizzato per valutare la forza meccanica ed effetti cronici delle particelle in allentamento asettico. Modello murino osteolisi calvarial generato tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra le particelle di usura e varie cellule, ad es., macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

Introduction

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Mobilizzazione asettica è la causa più comune di arthroplasty totale dell'anca (THA) e guasto (TKA) arthroplasty totale del ginocchio, che richiede la chirurgia di revisione1. Tuttavia, il meccanismo di fondo rimane poco chiaro2. Un lungo follow-up è necessario per rilevare il osteolysis particella-indotto, cui il caso è raro; di conseguenza, è difficile per esplorare la relativa patogenesi nei casi clinici. Quindi, ulteriori studi concentrandosi sui complessi meccanismi cellulari e tessutali richiedono che entrambi gli esperimenti in vivo a indossano modelli osteolysis particella-indotto e saggi in vitro in cellule legate alle ossa omeostasi3. Un valido modello animale è importante nel rivelare gli effetti particelle di usura su perdita dell'osso, fornendo la prova per ulteriori test cellulari.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è un metodo efficace e valido per valutare le interazioni tra particelle e varie cellule nella mobilizzazione asettica. In questo modello, le particelle CoCrMo provocare osteolisi calvarial d'induzione di citochine infiammatorie in macrofagi, attivando gli osteoclasti, inibendo la proliferazione degli osteoblasti, e promuovendo l'apoptosi degli osteoblasti.

Ci vogliono solo due settimane per stabilire questo modello. Osteolisi possono essere visualizzato e quantificata con ematossilina ed eosina (H & E) e micro computato tomografia (micro-CT)2. Inoltre, questo modello ha un relativamente basso costo e transgenico e knockout mouse modelli possono essere utilizzati per lo screening di un gran numero di composti alle varie dosi3.

La procedura per stabilire e valutare questo modello è semplice. In primo luogo, CoCrMo particelle sono state ottenute da tre elettrodi ad alto vuoto corrente e risospesi in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL. Quindi, 50 µ l della sospensione risultante è stato applicato alla metà del calvaria murino dopo separazione del periostio cranico di dissezione. I topi sono stati sacrificati dopo due settimane, e sono stati raccolti campioni di calvaria; analisi qualitative e quantitative sono state effettuate da H & E che macchia andmicro-CT.

Un modello murino osteolisi calvarial costruito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra particelle CoCrMo e varie cellule, quali i macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti, in allentamento asettico.

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Protocol

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Nanchino.

1. preparazione delle particelle CoCrMo

  1. Ottenere particelle CoCrMo utilizzando una corrente continua di fabbricato ad alto vuoto tre elettrodi4. Lega CoCrMo posto nello strumento sotto 10-3 Pa vuoto, 0,04 MPa argon e idrogeno 3:2 (v/v) e 650 A catodo attuale.
  2. Misurare i diametri delle particelle CoCrMo.
    1. Aggiungere 1 mg di CoCrMo particelle in 1,5 mL di etanolo anidro.
    2. Risospendere CoCrMo particelle in etanolo anidro agitando ad ultrasuoni a 28 kHz e 600 W per 5 min.
    3. Applicare una goccia (circa 20 µ l) della sospensione risultante sul tavolo oggettiva di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Serie di foto TEM a 200 kV tensione di accelerazione e 0,24 nm risoluzione di cattura.
    4. Utilizzare il software fornito per calcolare la distribuzione delle dimensioni della particella e di diametro media in micrografie TEM.
  3. Decontaminare le endotossine
    1. Autoclave 50g di particelle per 15 min a 121 ° C e 15 psi.
    2. Rilevare le endotossine da un'analisi quantitativa di Limulus metodo Lysate (LAL) (< 0,25% EU/mL è stato considerato per indicare assenza di endotossina)5.
  4. Risospendere le particelle in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 50 mg/mL come soluzione di riserva6.

2. costruzione del modello Calvarial osteolisi

  1. Anestetizzare 6 settimane di età C57BL/J6 topi (sei topi per gruppo) withpentobarbital (50 mg/kg). Utilizzare il pinch test per valutare il livello di anestesia. Prevenire la secchezza degli occhi con normale soluzione salina.
  2. Posto topi in posizione prona. Rimuovere la pelliccia sul cranio con un rasoio e disinfetti la pelle usando batuffoli di cotone medico contenente etanolo di 75%.
  3. Per la localizzazione del punto, identificare due punti, inclusi i punti medi tra i due occhi e orecchie, rispettivamente. Quindi, determinare la linea tra i due punti e incise la pelle lungo la linea di cui sopra con le forbici (Figura 1A).
  4. Rimuovere il periostio cranico dalla calvaria con un bisturi (Figura 1B)6.
  5. Pelle di sutura a entrambe le estremità con semplice sutura interrotto.
  6. Fare una linea di sutura nel mezzo dell'incisione senza annodatura. Tenere le due estremità della linea di sutura.
  7. Incorporare 50 µ l di sospensione di particelle di CoCrMo (50 mg/mL, in PBS) nel mezzo del calvarias (Figura 1)2.
  8. Annodare l'ultimo punto all'interno di semplice sutura interrotto (Figura 1).
  9. Mantenere topi per altre 2 settimane.

3. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial scansionando Micro-CT

  1. Sacrificare i topi con anidride carbonica. Decapitare i topi nel piano orizzontale. Rimuovere il tessuto cerebrale all'interno e la pelle e pelliccia all'esterno. Raccogliere il calvarias per ulteriori esperimenti.
  2. Tutti i tessuti molli il calvaria delicatamente chiaro con le pinzette. Difficoltà il calvarias liquidati in paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 24 h. Immergere il calvarias in PBS 24 h prima di micro-TAC.
  3. Analizzare il calvarias di topi di micro-CT ad alta definizione a una risoluzione isometrica di 18 µm e le impostazioni di energia dei raggi x di 45 kV e 550 mA.
  4. Condurre la ricostruzione tridimensionale di dati micro-CT con il software.
  5. Analisi quantitativa e qualitativa.
    1. In primo luogo, selezionare l'area quadrata intorno la sutura mediana come la regione di interesse.
    2. In secondo luogo, misurare la densità minerale ossea (BMD), osso volume/totale volume (BV/TV), trabecular numero (Tb.N), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) e percentuale di porosità totale con il software fornito per micro-CT.
    3. In terzo luogo, confrontare i tre gruppi per varie misure di One-way ANOVA. Per post-hoc analisi della varianza, applicare il metodo di Bonferroni2.

4. valutazione del modello di Osteolysis Calvarial macchiando di H & E

  1. Decalcificare campioni di calvaria in 15% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-PBS a 4 ° C. Cambiare la soluzione di decalcificazione ogni giorno per 3 settimane.
  2. Incorporare i campioni decalcificati in paraffina per 2 cm x 1 cm x 1 cubo di cm e tagliateli a fettine in 2 sezioni di µm nella zona di deposizione delle particelle.
  3. Macchia le sezioni con ematossilina ed eosina come precedentemente descritto7.
  4. Catturare micrografie della pathomorphism complessiva da microscopia chiara.

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Representative Results

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Le particelle di CoCrMo in-house prodotta su scala nanometrica erano circa 50 nm (errore standard di 3,56) di diametro, come quantificato dal TEM (Figura 2). Dopo l'esposizione del mouse calvarias a particelle di CoCrMo, gli animali (n = 6 per ogni gruppo) sono stati mantenuti per un altro due settimane. Entro le due settimane, l'incisione calvarial era completamente guarito e la sutura può cadere. Qualsiasi infezione locale o non sindacale può influire sulla valutazione di perdita dell'osso. Dopo il sacrificio del mouse, sono stati raccolti campioni di calvaria. Quindi, tutti i tessuti molli delicatamente è stato riordinato e micro-CT è stato utilizzato per quantificare la perdita dell'osso. Da entrambe le ricostruzione tridimensionale immagini e fotografie rappresentative della corona nella sezione trasversale, perdita significativa dell'osso è stata osservata in topi trattati con particelle di CoCrMo (Figura 3). Densità minerale ossea (BMD), volume/totale di osso trabecular spessore (Tb.Th), trabecular numero (Tb.N) e volume (BV/TV) sono stati ridotti significativamente, mentre la porosità totale e trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) sono stati aumentati significativamente il CoCrMo gruppo rispetto al controllo e sham operazione gruppi (Figura 4). Test t di Student è stato utilizzato per valutare le differenze tra gruppi e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Inoltre, H & E colorazione di sezioni di calvaria confermata la perdita dell'osso in topi trattati con particelle di CoCrMo (Figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Schematico del modello del topo di osteolysis particella-indotto (PIO). Il lato sinistro mostra la posizione del mouse nella modellazione. (A) punto di localizzazione. Determinare i punti medi tra i due occhi e orecchie, rispettivamente e incise la pelle lungo la linea tra di loro. (B) esporre e rimuovere il periostio cranico dalla calvaria. (C) sospensione di particelle di CoCrMo incorporare nel mezzo di calvaria. (D) suturare della pelle in semplice sutura interrotto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Trasmissione microscopia elettronica scansione di CoCrMo particelle. (A) immagini di microscopia elettronica di trasmissione rappresentante di CoCrMo particelle. (B) distribuzione granulometrica delle particelle di CoCrMo è stata quantificata con il software. Ogni barra rappresenta frequenza normalizzato al numero totale di particelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Analisi micro-CT con ricostruzione 3-dimensionale di campioni prelevati da topi di controllo e quelli trattati con PBS (operazione finta) e particelle di CoCrMo. La linea bianca orizzontale indica la posizione dell'immagine sezione trasversale. La freccia bianca indica la perdita dell'osso nel gruppo CoCrMo l'impianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Analisi quantitativa delle immagini di micro-CT dopo ricostruzione tridimensionale. Quantificazione di osso densità minerale (BMD) (A), volume volume/totale dell'osso (BV/TV) (B), percentuale di porosità totale (C), trabecular numero (Tb.N) (D), spessore trabecolare (Tb.Th) (E)e trabecular separazione/spaziatura (Tb.Sp) (F), mean±standard errore. Test t di Student è stato utilizzato per valutare le differenze fra i gruppi, con p < 0.05 considerato statisticamente significativo. * *, P < 0.01; , P < 0,001. n = 6 topi per ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Immagini rappresentative di H & E colorazione dei campioni di calvaria (10 ×) da topi di controllo e quelli trattati con PBS (operazione finta) e particelle di CoCrMo. La freccia rossa indica osteolisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Ci sono due metodi principali per usura osteolysis particella-indotto in topi: il modello aria-sacchetto e il modello di calvarial osteolisi. Nel modello aria-sacchetto, un sacchetto di aria generato per via sottocutanea è stabilito in primo luogo, seguito da introduzione delle particelle di usura e l'impianto nel tessuto osseo8. Il muro di sacchetto imita il periostio in allentamento asettico. Tuttavia, l'impianto osseo è non vascolare con nessuna attività biologica, che lo rende difficile valutare interazioni dirette tra le particelle e il tessuto osseo. Il modello di osteolisi calvarial presenta parecchi vantaggi sopra la controparte di aria-sacchetto. In primo luogo, le particelle di usura sono direttamente esposti al calvaria, che permette di valutare le interazioni tra le particelle di usura e dell'osso l'omeostasi, compreso il riassorbimento dell'osso e degli osteoblasti, osteoclasti e macrofago attività9,10 . In secondo luogo, le misure quantitative di perdita dell'osso sono disponibili, consentendo la valutazione dei vari potenziali approcci genetici e agenti biologici in osso perdita prevenzione11. In terzo luogo, è possibile valutare la relazione tra le particelle di usura e perdita dell'osso in vari ambiti di provenienza genetici, compreso transgenici e gene knockout topi12,13. In quarto luogo, può essere utilizzato per lo screening di un gran numero di composti alle varie dosi. Tuttavia, il tasso di successo del modello osteolisi traditionalcalvarial è relativamente basso, e utilizzando Istomorfometria ossea per misurare osteolisi rende i risultati meno obiettivo1.

Per migliorare il tasso di successo del modello e risultati di rendering più obiettivo, sono state apportate diverse modifiche. In primo luogo, particelle in nanoscala sono state utilizzate per migliorare le interazioni tra il calvaria e particelle di usura. Infatti, le interazioni tra particelle nanometriche e calvaria è migliorato rispetto a particelle di lega commercialmente, con un diametro medio di 1,5 µm14,15. In secondo luogo, una zona di2 cm 1,0 su calvaria è stata delineata per ottenere una adeguata esposizione di calvaria. In terzo luogo, la ricostruzione tridimensionale e di micro-CT sono stati utilizzati per quantificare la perdita dell'osso.

Ci sono diverse limitazioni nel presente modello. Prima, micro-CT apparecchiature per topi non sono ampiamente disponibile per i ricercatori e i tecnici sono necessari per la ricostruzione tridimensionale e scansione. In secondo luogo, le nanoparticelle di CoCrMo utilizzate nel modello presente non sono commercialmente disponibili e loro produzione si basa sul supporto dalla scienza dei materiali tecnici. In terzo luogo, questo modello non rappresentano effetti cronici delle particelle sulla massa dell'osso e manca di fattori non biologici legati all'osteolisi, come la pressione del fluido oscillatoria o forze meccaniche. L'efficacia del modello potrebbe essere aumentato significativamente con l'aiuto di particelle nanometriche e sufficiente esposizione di calvaria. Perdita dell'osso può essere quantificata e dati più oggettivi ottenuti con micro-CT.

Un modello murino di osteolisi calvarial stabilito tramite l'esposizione a particelle di CoCrMo è uno strumento ideale per valutare le interazioni tra particelle CoCrMo e diverse cellule quali macrofagi, fibroblasti, osteoblasti e osteoclasti in allentamento asettico. Inoltre, una serie di farmaci possono essere testata dei loro effetti sull'allentamento asettico utilizzando questo modello.

Ci sono molti passaggi critici di questa procedura. Il primo è l'applicazione di CoCrMo nanoparticelle con un diametro medio di 50 nm. In secondo luogo, è stata realizzata una adeguata esposizione di calvaria. Un'area di2 cm 1,0 su calvaria era abbastanza in questo modello, e il periostio il calvaria dovrebbe essere dissecato accuratamente e completamente. Una dissezione chiara del periostio intensifica le interazioni tra le particelle e la calvaria. In terzo luogo, una misura quantitativa della perdita dell'osso da micro-CT è possibile. Le misure quantitative di perdita dell'osso da ricostruzione tridimensionale, come BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp e percentuale di porosità totale, rendono più facile distinguere le differenze di perdita dell'osso in vari trattamenti e forniscono solide prove di osteolisi confrontato con l'Istomorfometria ossea tradizionale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da National Natural Science Foundation of China (81572111), la scienza clinica e tecnologia progetto Fondazione della provincia di Jiangsu (BL2012002), il progetto di ricerca scientifica di Nanchino (201402007), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20161385) e la fondazione speciale dell'associazione cinese medico (2015COS0810).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoCrMo alloy from prosthesis Waldemar Link GmbH & Co GEMINI MK II Raw material to obtain CoCrMo nanoparticles
Fabricated high-vacuum three-electrode direct current College of Materials Science & Engineering , Nanjing University of Technology Self designed machine
6 week old male C57BL/6J mice Model animal research center of Nanjing University N000013
100% Ethanol Nanjing Reagent C0691514023 Solvent of CoCrMo nanoparticles for transmission electron microscope scanning
1.5 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W603
Microanalytical balance Shenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTD EX125DZH
Ultrasonic shaker Shanghai Yuhao scientific instrument co., LTD YH-200DH To suspend CoCrMo nanoparticles
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai G20
SimplePCI software Compix Inc. 6.6 version To calculate the mean diameter and particle size distribution.
High-handed sterilization pan QIULONGYIQI KYQL-100DS To decontaminate endotoxin
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assay Charles River R13025 To detect endotoxin 
15 ml Microcentrifuge tubes Taizhou Suyi Medical B122
Phosphate-buffered saline Boster Biological Technology AR0030 Solvent of CoCrMo nanoparticles stock solution
Pentobarbital Sodium Sigma P3761 To anesthetize mice
Normal saline SACKLER SR8572EP-15 To prevent drying of mice eyes
75% Ethanol Nanjing Reagent C0691560275 Disinfection
Medical cotton ball Shuitao 1278298933 Disinfection
Shaver Kemei KM-3018 To shave the fur
Scissor RWD LIFE SCIENCE S12005-10 To incise skin
Suture RWD LIFE SCIENCE F34001-01 To suture skin
Needle holder RWD LIFE SCIENCE F33001-01 To suture skin
Needle RWD LIFE SCIENCE R14003-12 To suture skin
Vessel forceps RWD LIFE SCIENCE F22003-09 To suture skin
Scalpel RWD LIFE SCIENCE S31010-01 To harvest calvaria
Tweezers RWD LIFE SCIENCE F12006-10 To harvest calvaria
100 µL pipettes Eppendorf 3120000240 To embed particles suspension in the calvatias
100 µL pipette tips AXYGEN T-200-Y To embed particles suspension in the calvatias
5 ml Microtubes Taizhou Weierkang Medical Supplies co., LTD W621
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101 Fixation
Micro Computed Tomography  SkyScan SkyScan1176
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Servicebio G1105 Decalcification
Paraffin Servicebio #0001
Paraffin slicing machine Leica RM2125RTS
Glass slide Servicebio G6004
Cover glass Servicebio 200
HE staining kit Servicebio #1-5 HE staining
Light microscope Nikon E200

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References

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Jiang, H., Wang, Y., Deng, Z., Jin, J., Meng, J., Chen, S., Wang, J., Qiu, Y., Guo, T., Zhao, J. Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening. J. Vis. Exp. (132), e56276, doi:10.3791/56276 (2018).More

Jiang, H., Wang, Y., Deng, Z., Jin, J., Meng, J., Chen, S., Wang, J., Qiu, Y., Guo, T., Zhao, J. Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening. J. Vis. Exp. (132), e56276, doi:10.3791/56276 (2018).

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