الجيش الملكي النيبالي هو موضح في الموقع البروتوكول التهجين يسمح الكشف عن الحمض النووي الريبي في أسرة المورفولوجية أجنة أو أنسجة تشريح. استخدام لوحات microtiter 96-جيدا وتضخيم إشارة تيراميدي، يمكن اكتشاف النصوص في عالية الدقة والحساسية، والإنتاجية، وتكلفة منخفضة نسبيا.
في جهودنا الرامية إلى تحديد أنماط التعبير والتعريب سوبسيلولار من المورفولوجية الكشف على نطاق الجينوم، وفي مجموعة متنوعة من الأنسجة، قمنا بتطوير العديد من التعديلات والتحسينات على موقعنا الأصلي فلوري في الموقع البروتوكول التهجين (الأسماك). لتسهيل الإنتاجية وفعالية التكاليف، جميع الخطوات، من جيل التحقيق للكشف عن إشارة، يتم تنفيذها باستخدام لوحات microtiter 96-جيدا إكسون. ديجوكسيجينين (حفر)-تحقيقات المسمى antisense الحمض النووي الريبي يتم إنتاجها باستخدام الحيوانات المستنسخة كدنا أو الحمض النووي كقوالب. بعد تثبيت الأنسجة وبيرميبيليزيشن، هي تهجين المسابير للمحاضر الحرفية للفائدة وتم الكشف عنها باستخدام سلسلة الأجسام المضادة حفر مترافق ثم إلى البيوتين، streptavidin مترافق بالفجل البيروكسيديز (HRP) وفلوريسسينتلي مترافق تيراميدي، التي تنتج متوسط شدة رد الفعل الذي يربط بين المناطق الكثيفة إلكترون من البروتينات متاخم حضور برنامج الصحة الإنجابية،. تنتج هذه الخطوات التضخيم والتعريب إشارة قوية وعالية مترجمة يسهل الترجمة نسخة الخلوية وسوبسيلولار على حد سواء. لقد تم تحسين البروتوكولات المقدمة لإنتاج إشارات محددة للغاية في مجموعة متنوعة من الأنسجة ومراحل النمو. كما تتوفر المراجع للتغيرات الإضافية التي تسمح للكشف عن العديد من النصوص، أو النصوص والبروتينات، متزامنة في نفس الوقت.
أساليب الكشف عن الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم جديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي توسعت إلى حد كبير معرفتنا متى وأين يتم التعبير عن الجينات، وإزاء ما مستويات1. ومع ذلك، توفر هذه القرار الزماني والمكاني فقيرة نسبيا. الجيش الملكي النيبالي في التهجين الموقع يسمح التوزيع المكاني للنصوص التي سيحتفل بها بصريا في الأنسجة الثابتة، مما يكشف عن تفاصيل التعريب الخلوية وسوبسيلولار2. يسمح القرار المكانية أكثر كما أنه يسمح باستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية، مثل ورقة [كنفوكل] والخفيفة الميكروسكوب3باستخدام التهجين في الموقع نيون (الأسماك). يمكن أيضا استخدام علامات مضيئة مثل DAPI إقامة علاقات سوبسيلولار4. الأسماك يسهل أيضا الملاحظة للكشف والبروتينات متعددة في وقت واحد مع مؤشرات واضحة للتداخل على مستوى سوبسيلولار. ويمكن الاطلاع على الكواشف فريدة من نوعها والخطوات اللازمة لوضع العلامات المزدوجة في المراجع التالية3،5.
تعمل الإجراءات الموضحة هنا تستخدم لوحات microtiter 96-جيدا لجميع الخطوات، بما في ذلك إنتاج قالب كدنا (مستعمرة PCR)، إنتاج مسبار الحمض النووي الريبي (باستخدام النسخ بوليميريز-تعتمد على الجريان السطحي T7, T3 أو SP6)، التهجين في الموقع ، و وضع إشارة الفلورسنت. يتم إضافة عدد كاف من أجنة أو أنسجة لكل جيدا لصفيحة 96-جيدا للسماح بتقييم الاتساق وتقلبه. ويتلقى كل جيدا ثم تحقيق مختلفة. بعد وضع إشارة، هي صفت أجنة أو أنسجة من كل بئر على شرائح المجهر الفردية للتحليل المجهري.
استخدام التضخيم إشارة تيراميدي (TSA) لكشف المسبار تنتج إشارات قوية مع قرار استثنائي سوبسيلولار 5،6،،من78. تعريب سوبسيلولار للكشف هو إليه تنظيمية هامة 9 التي يبدو أن يحدث مع تقريبا جميع الكشف 4،،من1011. وأظهرت هذه التحليلات أيضا أن العديد من النصوص التي لم يتم الكشف عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي هي سهولة الكشف عن الأسماك 8. تكييف الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين إلى لوحات 96-جيدا يسمح تحليل الجينات تصل إلى 96 من الفائدة في كل مرة (وتستخدم لوحات أكثر إذا إضافية)، مما يجعل من الممكن تحليل مجموعات البيانات الكبيرة. قطع اللوحات إلى مقاطع أصغر، تتكيف الأسلوب أيضا بسهولة عينات قليلة فقط. وينص البروتوكول المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي لتوزيع في معظم أنواع الأنسجة. على الرغم من أن لا يظهر، أنها قابلة للتكيف لغير-المورفولوجية الأنسجة، وكذلك.
ينص البروتوكول على وصف أسلوب استنساخه عالية وحساسة، واقتصادا للكشف عن معظم الكشف في الأنسجة أو أجنة المورفولوجية الثابتة. على الرغم من أن قليلاً أكثر تعقيداً مما الأكثر تقليديا تستخدم الأسلوب الفوسفاتيز القلوية للكشف عن التحقيق، أن القرار تم الحصول عليها من الأسماك أكبر بكثير والحساسية قابلة للمقارنة أو تحسين 7،8. باستخدام لوحات microtiter كاملة أو جزئية، يمكن استخدام البروتوكولات لتحليلات واسعة النطاق أو محدودة للجينات للفائدة. تجدر الإشارة إلى أن المجسات التي تم إنشاؤها يمكن الكشف عن كافة أو لصق نسخة متعددة الأشكال ما لم تكن مصممة على وجه التحديد المسابر (أي، واحد exons). على الرغم من اختبرناها المسابير صغيرة النيوكليوتيدات 200 بنجاح معقولة، تميل إلى أن تكون أقل فعالية المسابير أصغر وقد يكون أقل تحديداً. ومن الواضح أن هذا البروتوكول غير مناسب للكشف عن الصغيرة introns، exons، أو معالجة ميكرورناس.
على الرغم من أن هذا النهج يستخدم خطوة الانزيمية لتعزيز قوة الإشارات، يظهر كثافة إشارة يكون متناسباً مع الهدف التعبير الجيني في نطاق مستويات التعبير الخطي وواسع نسبيا. في أعلى التكبير، يعتبر الإشارة بونكتا أو تلامس داخل الخلايا والأنسجة. وينظر للنصوص نادرة نسبيا سوى عدد قليل من بونكتا صغيرة. كما يزيد من وفرة نسخة، وهذه تنمو في عدد وحجم. كما هو الحال مع جزيء واحد الأسماك (سمفيش)، بونكتا صغيرة واحدة قد تقابل أيضا الكشف واحدة وينبغي أيضا سهولة كمياً باستخدام برمجيات التصوير والمعلوماتية. مقارنات بين الصور المنشورة الحصول عليها باستخدام سمفيش مع الصور التي كنا قد رعاية للأهداف نفسها التي تشير إلى أن عموما وحساسية وحلها بالطريقتين متشابهة نسبيا، على الرغم من أن هذا ينبغي أن يمكن اختباره بواسطة مقارنات أكثر صرامة. الأسلوب المقدمة هنا نظراً لنفقات أعلى كثيرا من سمفيش، ينبغي أن تعطي نتائج مماثلة في جزء صغير من التكلفة. ومع ذلك، إذا كان الهدف الكشف عن النصوص الصغيرة، أو أجزاء منفصلة من النصوص، ينصح سمفيش.
نظراً لحجم أصغر من بعض المسابير الأسماك، قد يكون هذا الأسلوب أيضا أفضل في اختراق الأنسجة التي تكون كبيرة أو عقبات كبيرة. ومع ذلك، تظهر استخدامنا لمستويات أعلى من المنظفات والأنسجة من التثبيت وبيرميبيليزيشن من القرص حل هذه المشكلة. أخيرا، على الرغم من أن البلدان المتقدمة النمو للأنسجة المورفولوجية ، ينبغي أيضا العمل مخازن المنظفات عالية الموصوفة هنا لتشريح الأنسجة للأجنة المورفولوجية ، فضلا عن معظم الكائنات الحية والأنسجة الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
تمويل الدعم لهذا المشروع قدمت منحة إلى همك “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (منح باتاكا 133473).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |