Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.
Çabalarımızı ifade şekillerinin ve hücre altı Yerelleştirme Drosophila RNA’ların genom-wide olarak belirlemek için ve dokular çeşitli, çok sayıda değişiklik ve iyileştirmeler bizim orijinal floresan için in situ olarak geliştirdiğimiz hibridizasyon (balık) protokolü. Performans ve maliyet etkinliği kolaylaştırmak için sonda nesil sinyal algılama, tüm adımlar exon 96-de microtiter plakaları kullanarak gerçekleştirilir. Digoxygenin (KAZMAK)-etiketli Antisens RNA probları cDNA klonlar veya genomik DNA şablon olarak kullanılarak üretilmektedir. Sonra doku fiksasyon ve permeabilization, sondalar faiz transkript melezleşmiştir ve sonra tespit edilen Anti-KAZMAK antikor bir arkaya kullanarak biotin, horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik ve fluorescently Birleşik streptavidin Birleşik tyramide, hemen bitişik proteinler elektron yoğun bölgelere bağlar büyük ölçüde reaktif bir orta üreten HRP, huzurunda. Amplifikasyon ve yerelleştirme adımları her iki hücre ve hücre altı transkript yerelleştirme kolaylaştıran güçlü ve son derece lokalize sinyal üretirler. Sağlanan protokoller doku ve gelişim aşamalarında, çeşitli çok özel sinyalleri üretmek için optimize edilmiştir. Başvurular da aynı anda birden fazla Tutanaklar, veya transkript ve proteinler, algılama aynı anda izin daha fazla varyasyon için sağlanır.
Yeni genom çapında RNA algılama yöntemleri RNA-seq gibi büyük ölçüde bizim bilgi ne zaman ve nerede genlerin ifade edilir ve ne1düzeyleri genişletmiştir. Ancak, bunlar nispeten yoksul zamansal ve mekansal çözünürlüğü sağlar. İn situ hibridizasyon RNA transkript görsel olarak sabit dokularda uyması gereken kayma dağılımını böylece hücresel ve hücre altı Yerelleştirme2bilgilerinizi ortaya çıkarmak sağlar. Floresan In situ hibridizasyon (balık) kullanarak sayfayı confocal ve ışık mikroskobu3gibi güçlü mikroskobu tekniklerin kullanılması verdiğinden daha fazla Uzaysal çözünürlük sağlar. Floresan işaretleri DAPI gibi hücre altı ilişkileri4kurmak için de kullanılabilir. Balık aynı zamanda birden çok RNA ve proteinler gözlem örtüşme hücre altı düzeyde net göstergeler ile aynı anda kolaylaştırır. Benzersiz reaktifler ve çift etiketleme için gereken adımları aşağıdaki başvuruları3,5‘ te bulunabilir.
Burada açıklanan yordamları 96-de microtiter plakaları cDNA şablon üretim (koloni PCR), RNA sonda üretim (T7, T3 veya SP6 polimeraz bağımlı axım transkripsiyon kullanarak), içinde in situ hibridizasyon, dahil olmak üzere tüm adımları için kullanmak ve Floresan sinyal geliştirme. Yeterli sayıda embriyo veya doku her eklenir tutarlılık ve değişkenlik değerlendirilmesi izin vermek için de 96-şey plaka. Her bir farklı sonda o zaman alır. Sonra sinyal geliştirme, embriyo ya da her şey dokulardan mikroskobik analizlerin yapıldığı için bireysel mikroskop slaytlarda dizilmiş.
Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) kullanım sonda algılama için olağanüstü hücre altı çözünürlük 5,6,7,8ile sağlam sinyalleri üretir. RNA’ların hücre altı lokalizasyonu hemen hemen tüm RNA’ların 4,10,11ile gerçekleşmesi için görünür bir önemli yasal mekanizma 9 ‘ dur. Bu analizler da RNA-seq tarafından algılanmaz birçok transkript balık 8tarafından kolayca algılanır göstermiştir. RNA in situ hibridizasyon 96-şey plakaları için uyum analiz ilgi 96 genlerin büyük veri analizini mümkün hale (tabak daha ek izin verirseniz kullanılır) bir anda, sağlar. Plakayı daha küçük bölümler halinde keserek, yöntemi de kolayca sadece birkaç örnekleri için uyarlanmıştır. Gelen doğrulama doku türlerinin çoğu RNA dağıtımları çözümlenmesi için uygundur. Her ne kadar gösterilmez, non –Drosophila dokulara de uyarlanabilir.
Tablo 7: hibridizasyon çözüm. 3. drosophila yetiştirme ve embriyo, larva ve Ergin doku koleksiyonu. Not: küçük ölçekli (şişe) ve kütle (kutu) yetiştirme sinek, 25 ° C. tutmak doğru yetişkin ve larva yoğunluk dayalı Mısır unu gıda üzerinde standart sinek laboratuvar protokolleri kullanır ve ek aktif Maya toz gıda sağlamak için yüzeyler. Standart protokolleri takip toplamak embriyo. Embriyo koleksiyonunun önemli adımlar şekil 3 ‘ te gösterilmiştir. Not: devitillinized embriyo metanol içinde sonra durulama, sabit embriyo-20 ° C’de bir yıl süreyle saklanır. Embriyo permeabilization ve sonrası fiksasyon balık Protokolü’nün 1 gün gerçekleştirilir. Hazırlama taze % 40 PFA hisse senedi çözüm. DEPC 10 mL karıştırma tarafından % 40 paraformaldehyde (PFA) hazırla taze yapılmış stok çözüm tedavi GKD 2 O İngiltere’de yılın ve 2N KOH küçük heyecan bara içeren 20 mL cam mercek şişe içinde 70 µL 3.68 g için Dikkat: PFA potansiyel akut ve kronik sağlık etkileri ile son derece zehirlidir. MSDS (malzeme güvenlik bilgi formları) okuyup göz, cilt ve solunum yolları için uygun koruma kullanma. Bir duman Hood, ısı ve şişeyi 3-5 dk ısıtma yüzeyi 200 ° c üzerinde ise tamamen eriyene kadar karıştırın. PFA çözünmüş olarak İngiltere’de yılın hisse senedi çözüm ısı kaldırmak (değil aşırı ısınma). Çözünmüş % 40 PFA hisse senedi çözüm on Ice 5 min için serin ve filtre filtre ve 10 mL 0.2 µm şırıngayla. Üçüncü larva (L3) veya yetişkin doku fiksasyon, Şoklama ve permeabilization biçim Not: Bu protokol bir gün içinde bitmiş olmalıdır. Doku içerir diseksiyon, fiksasyon, endojen HRP, permeabilization ve sonrası fiksasyon Şoklama. Hazırla sabitleme Çözümleri (saptamak-ı ve düzeltme-II) göre Tablo 8. Not: doku korunmuş olmalıdır hassas bir yapıya sahip Pikrik asit ek bir sabitleştirici kullanılır. Doku ultrastructure elektron mikroskobu (EM) korunmuş olmalıdır ne zaman iyi bir sabitleştirici değil. Uyarı: Pikrik asit kararsız ve diğer malzemeler ile tepki ve patlayıcı bileşikler oluşturmak için yeteneğine sahiptir. Kullanın ve güvenlik kurallarına göre mağaza. Yer larva veya soğuk 1 PBS X 10 mL ve 100 µL düzeltme içeren bir 50 mL plastik tüp yetişkin uçar-ben çözüm. Soğuk buz larva veya yetişkin sinek hareketliliği azaltmak 2 dk için. Kesme 2-3 mm açılış oluşturmak için 1 mL plastik ucu ucu kapalı. 10-30 larva transferi veya yetişkin 1 mL ucu ile bir Petri kabına (9 cm Çap) 1 X PBS sığ bir tabaka ile 50 mL tüp (Adım 3.3.2) uçar. PBTT biraz ekleme yüzey gerilimi düşürebilir. Dikkatle larva teşrih (ön üzerinden açın ve posterior anterior için dokulardan sıkmak) veya bir çifti bir diseksiyon kapsamı altında keskin Forseps ile ilgi yetişkin dokularda. Not: Yaklaşık 200-300 larva veya yetişkin testislerde tanısal yaklaşım olabilir disseke ve deneyimli kişiler tarafından bir gün içinde sabit. Transfer 1,5 mL tüp ve buz üzerinde mağaza içine (açılış 2 mm çapında oluşturmak için kesilmiş ucu ile) 200 µL pipet kurcalayarak kesmiştim. Kandan sonraki adıma ilerliyor önce 10-15 dk içinde her turu. Not: yeterli malzemesi oluşturmak için gerektiği şekilde (içinde 2 h zaman penceresi) ek mermi devam. 800 kurcalayarak düzeltme µL düzeltme-ben bir tezgah üst Mikser üzerinde 30 dk için çözüm. Bir kez 800 µL ile 1 X PBTT ve tüpler en fazla 30 dk nedeniyle 2.5 h. buz üzerinde tutmak durulama doku sınırlamak, yeterli doku toplanan kadar batch-wise yapılması gereken bu. Kafes kapağı içeren bir tek 15 mL plastik tüp içine tüm disseke ve sabit dokular havuz (bkz. şekil 4 tüp çizmek için). Kafes tüp kapağı ile aşırı sıvı Aspire edin. 3 X 5 dk her ile 10 mL 1 X PBTT yıkayın. Deterjan kaldırmak için 1 X PBS iki kez 10 mL ile yıkayın. Bu fazla sırada kabarcıkları önler. Not: disseke doku tüpün dibine batar, adımları düzenli microtiter plakaları veya 0,5-1,5 yapılabilir mL microcentrifuge tüpler (300-800 µL birim başına tüp). Endojen HRP aktivite ile 5 mL % 0,3 H 2 O 2 ‘ PBS RT. tekrar 15 dakika için de bir kez daha gidermek. Kapağı olmadan bu adımı sırasında açık tutun. Durulama iki kez 10 mL 1 X PBTT kullanarak. 1 X PBTT 10 mL ile 5 min için iki kez yıkayın. 10 mL % 80 aseton (-20 ° C, önceden soğutulmuş) kurcalayarak 10 dk. ters çevir’i-20 ° C’de tüp iki kez kuluçka döneminde permeabilize. Dokular suyla temasa 1 X PBTT 10 mL ile 10 min için iki kez yıkayın. Durulama 10 mL 5 ml PBTT artı 5 ml hibridizasyon karışımı ile çözümü (1:1). atma mix ve 10 ml hibridizasyon solüsyon ile değiştirin. Örnekleri-20 ° C de ihtiyaç kadar saklanabilir. En iyi sonuçlar için daha–dan a hafta için örnekleri depolamayın. düzeltmek ben (10 ml) bileşeni düzeltmek II (10 ml) % 40 PFA hisse senedi 1 ml 1 ml PBTT 8,99 ml 9 ml Pikrik asit çözüm 10 μl –
Tablo 8: sabitleme çözümleri dokular için. 4. in situ hibridizasyon Not: protokol bu bölümünü en az 2 gün örnek hazırlık gerektirir, ön hibridizasyon Hibridizasyon alarak yer ve gün 1 ve yoklama algılamayı üzerinde 2. gün. Örnekleri sayısı nispeten yüksek, yabancı Eğer protokolü ile ya da bir gün mümkün değildir Eğer protokol ile 2 gün bölünmüş sonda algılama ve sinyal amplifikasyon adımlarla 3 gün içinde yapılmalıdır. Çok sayıda embriyo veya disseke doku örnekleri de işlemek için ek gün gerektirebilir. Disseke doku örnekleri için 1 X PBT 1 X PBTT her adımda, aksi belirtilmedikçe değiştirin. İlave deterjan beyin ve testis gibi birçok larva ve yetişkin dokulara nüfuz için gereklidir. Değil test, 1, ancak X PBTT embriyo için de kullanılabilir. 96-şey plakaları ve 1,5 mL tüpler için 800 µL için iyi 100 µL kullanın. Öncesi hibridizasyon ve hibridizasyon Not: adımları 4.1.1-4.1.6.2 embriyo in situ hibridizasyon için vardır. Larva veya yetişkin doku in situ hybridizations için bu adımları atlayın. (Metanol-20 ° C’de depolanan) sabit embriyolar için yeni bir 15 mL tüp kaldırmak 2 mL. İki kere metanol 7 min 10 mL ile için embriyo her makinaya yıkayın. WAsh 7 min 10 mL metanol ve 1 X PBTT (1:1) karışımı ile için embriyo. Suyla temasa 1 X PBTT 7 min 10 mL ile iki kez için embriyo yıkayın. 1:500 (20 mg/mL) hisse senedi çözümden sulandrarak bir ara İndinavir K çözüm (40 µL/mL) embriyo permeabilization için hazırlanın. -20 mağazada ° C. yapmak için son bir çalışma konsantrasyonu 2.667 ug/mL 1 X PBTT ara İndinavir K çözümde 1/15 sulandrarak tarafından çalışan bir İndinavir K çözüm. Permeabilize embriyo ile İndinavir K çözüm (embriyolar daha küçük sayılar için daha az kullanım) çalışma 10 mL. Kuluçkaya RT at tüp için kuluçka sırasında 4 kez tüp 13 dk. yavaşça tersine çevirin. Olmadan İndinavir K çözüm 1 h için buz örneklerinde kuluçkaya. Not: Bu nispeten uzun bir kuluçka seyreltik İndinavir K ile tekrarlanarak üniforma permeabilization ve sonraki boyama sağlar. Embriyo permeabilize iken, 2 mg/mL 1 X PBTT için toplam hacmi 30 mL içinde glisin çözüm 10 X stoktan (20 mg/mL) olun. Kaldır İndinavir K çözüm, 10 mL glisin çözeltisi (2 mg/mL) ile durulayın ve 2 dk her iki kez yıkayın. Durulama ile üç kez glisin kaldırmak için 1 X PBTT 10 mL. Sonrası embriyo fiksasyonu. 10 mL % 4’lük hazırlamak PFA ( 1 mL PFA 9 ml PBTT, filtre 0,45 µm filtreden). % 4 örneklerinde kuluçkaya PBTT ile 20 dakika yıkama 3 X 2 dakika süreyle PFA. Denatüre hibridizasyon çözüm, hazırlamak için hibridizasyon çözüm 5 dakika kaynatın. Tam 96-şey plaka için 12 mL üç tüp kullanın. Serin buz hemen 5 dakika süreyle Durulama embriyo bir kez ile 10 mL 1 X PBTT: hibridizasyon çözümü (1:1). İki kez 5 mL hibridizasyon çözeltisi durulayın. Aliquot ~ 20 µL kuyu başına embriyo (30-40 embriyo) yerleşmiş veya doku içine buz 96-şey PCR tabağa sabit. Doku veya bir 8-kanal manifold pipet ( şekil 1 / video) kullanarak embriyo hibridizasyon çözüm kaldırma. Not: Manifold pipet vardır bir ‘ dur ’ kuyu alt kısmında ve örnek çıkarma ipuçları engeller. Float dokuları kullanarak deneyler için sıvı dikkatlice 100 µL pipet ile en baştan çıkarmak. Ekle 100 µL denatüre hibridizasyon çözüm her şey için. Embriyo en az 2,5-3 h 56 ° c metal boncuk (malzeme ve şekil 1 bakınız) içeren bir kuru banyo Isıtma birimi kullanarak önceden melezlemek. Bir thermocycler için 5 dk 80 ° C. hemen serin 5 min için buz üzerinde kullanarak bir 96-şey PCR plaka denatüre 100 µL hazırlanmış, sonda. Öncesi hibridizasyon çözüm embriyo veya doku çıkarın. Denatüre gene özgü probları her örnek, kapak bant mühürleme ile ve 16-18 h O/N, altında kuru banyo birimini Isıtma metal boncuklar için 56 ° C’de melezlemek ekleyin 5. Algılama sonda öncesi 56 ° C Isıtma birimi çözümlerinde Tablo 9’sıcak. Probları plaka kaldırmak. Not: Problar arasında yeniden kullanılabilir-80 ° c (asla mağaza herhangi bir RNA örnekleri-20 ° C’de) 2 – 3 kez depolanmış olsa. Hibridizasyon sonra çift iplikçikli RNA tek iplikçik RNA daha istikrarlı ve daha az RNase kirlenme tarafından neden bozulma maruz kalabilir. Eğer kullanarak bir çok iyi plaka vakum filtrasyon sistemi dokular için (bkz: derleme ayrıntıları için video) probları toplamak için filtre plaka altında bir koleksiyon plaka dahil edilmelidir. Melezleşmiştir dokular bir 1.2 µm gözenek boyutu PVDF membranlar her kuyunun ile hibridizasyon için kullanılan normal 96-şey microtiter plaka transfer gerekir. adım önceden çözüm (56 ° C) sıcak zaman Birim başına iyi 1 Hibridizasyon çözüm: PBTT (3:1) 15 dk 100 μl 2 Hibridizasyon çözüm: PBTT (3:1) 15 dk 100 μl 3 Hibridizasyon çözüm: PBTT (1:1) 15 dk 100 μl 4 Hibridizasyon çözüm: PBTT (1:3) 15 dk 100 μl 5 5 dk 100 μl yıkar PBTT 3 Tablo 9: probları hibridizasyon sonra yıkama. normal plakalar, 56 Isıtma birim olarak başına tablo 9 yıkama örnekleri kullanıyorsanız ° C. manifold vakum sistemi kullanarak Eğer bankta vakum sistemi ile ısıtmalı çözümleri kullanır ve vakum tarafından çözümlerinden hemen aşağıda kaldırın. 1 X PBTT ile 3 yıkama sonra normal plaka üzerinden Isıtma kaldırılabilmesi için Gordon Hazırlama antikorlar. Hazırlamak 11 mL biotin Birleşik fare monoklonal Anti-KAZMAK antikor sulandrarak tarafından (1 mg/mL) stoktan birincil antikor çözeltisi (2,5 µg/mL) (bkz: malzeme listesi) PBTTB (1: 400) içinde. Eğer daha az örnekleri işleme, birimler buna göre ayarlayın. Hazırlamak 11 mL streptavidin-HRP çözeltisi (1 µg/mL) 1: 1000 streptavidin-HRP sulandrarak tarafından (1 mg/mL) stoktan (malzeme listesi bkz:) PBTTB içinde çekimlerine. Eğer daha az örnekleri kullanarak, birimleri buna göre ayarlayın. Engellemek embriyo veya PBTTB (1 X PBTT % 1 yağsız süt) kurcalayarak RT. adlı bir tezgah üst Mikser üzerinde 20 dk için Not: Filtre PBTTB 96-iyi filtre Tabaklarda filtreleri tıkanmasını önlemek için kullanmadan önce filtre kağıdı (grade 3, 6 µm) kullanarak. PBTB, PBTTB yerine (PBTB ek % 0,3 ile Triton-X-100) tüm dokular için iletişim kuralı sırasında kullanılır. Incubate embriyo veya tezgah üstü örnek karıştırıcı 2 h için antikor çözüm (100 µL/de) dokularda. Durulama iki kez 1 ile x PBTTB. 3 yıkama X 5 min ve 5 X 10 min için PBTTB ile. Embriyo veya streptavidin-HRP çözüm (100 µL/de) 1,5 saat bir tezgah üstü örnek Mikser kullanarak için kurcalayarak kuluçkaya. 2 yıkama X 5 min için PBTTB ile. Bu noktadan sonra örnekleri karanlıkta devam. Not: Eğer doku süt tarafından üretilen opaklık nedeniyle kayıp tüm antikor yıkama sırasında yıkama (PBTT PBTTB yerine) süt olmadan deneyin. DAPI çözüm sulandrarak 100 ile hazırlamak X DAPI PBTTB (1: 100). Incubate embriyo veya DAPI çözüm (100 µL/de) bir tezgah üstü örnek Mikser üzerinde 15 dakika kurcalayarak. 4 yıkama X 10 min için PBTT ile. 96-şey plaka ile örnekleri O/N 4 ° C’de depolayın veya sonraki adıma geçin. Not: Burada yordamı duraklatılmış. 6. Tyramide antikor algılama (bkz şekil 5) Not: burada ev yapımı siyanür 3-Birleşik tyramide, hangi içinde açıklanan protokolüne göre hazırlanan kullanılan 12 . Eğer birçok deney gerçekleştirmek veya pek çok örnekleri test, bu para önemli miktarda tasarruf ve etkili için ticari reaktifler (deneyim) karşılaştırılır. Daha az deneyler ve örnekler için piyasada bulunan siyanür 3-tyramide-ebilmek var olmak kullanılmış (malzemeleri görmek). Yıkama örnek tabaklar 3 X 5 min için 1 X PBTT. %0,006 H 2 O 2 PBTT (seyreltik (w/w) H 2 O 2 hisse senedi 1: 5000) içeren hazırla tyramide harekete geçirmek arabellek (harekete geçirmek arabellek). harekete geçirmek arabellek pilakalar durulayın. Hazırlama siyanür 3-tyramide çözüm 15 mL tüp içinde harekete geçirmek arabellekte sulandrarak tarafından. İçin embriyo, 1:80 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 137 µL) kullanın. Larva dokular için 1:150 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 73 µL) kullanın. Yetişkin testis için 1: 200 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 55 µL) kullanın. Yetişkin yumurtalık için 1:300 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 36 µL) kullanın. Kuluçkaya siyanür 3-tyramide çözümü için tezgah üstü örnek karıştırıcı 2 h ile örnekleri. Dört kez PBTT ile yıkayın. 6 yıkama X 10 min için PBTT ile. 3 X 5 min için deterjan kaldırmak için PBS ile yıkayın. Ekleyin 150 µL/iyi anti-fade in montaj medya. Örnekleri O/N 4 ° C’de dokular veya embriyo tüp altına lavabo izin vermek için devam edin. Örnekleri (altında dokular için kapsam anatomi) mikroskop slaytlar bağlama ve coverslip ile kaplayın. Coverslip şeffaf oje ile kenarlarını kapatın. Bir floresan mikroskop kullanarak görüntü. Not: ilk önce bir fikir edinmek için negatif kontrol analiz ‘ belirsiz ’ arka plan.
Açıklanan protokol sabit Drosophila embriyo veya doku çoğu RNA’ların tespiti için son derece hassas, tekrarlanabilir ve ekonomik bir yöntemdir. Her ne kadar daha geleneksel alkalin fosfataz yöntemi sonda algılama eskisinden biraz daha karmaşık, balık tarafından elde edilen çözünürlük çok daha büyük ve duyarlılık karşılaştırılabilir veya geliştirilmiş 7,8. Tamamını veya bir kısmını microtiter plakaları kullanarak, iletişim kurallarını genler ilgi büyük ölçekli veya sınırlı analizleri için kullanılabilir. Oluşturulan probları tüm algılayabilir veya sondalar özellikle tasarlanmıştır sürece birden fazla transkript splice oluşturur unutulmamalıdır (yani, tek ekzonlar). Probları makul başarı ile 200 nükleotit olabildiğince küçük test ettik rağmen daha küçük sondalar daha az etkili olma eğilimindedir ve daha az belirgin olabilir. Açıkça, bu protokol küçük intron, ekzonlar, tespiti için uygun değildir ya da mikroRNA’lar işlenir.
Sinyal gücünü artırmak için enzimatik bir adım bu yaklaşım kullanır, ancak sinyal yoğunluğu hedef gen ifadesinin ifade düzeyleri nispeten doğrusal ve geniş bir yelpazesi ile orantılı olarak düşünülür. Yüksek büyütme oranında sinyal puncta veya speckles olarak görülüyor hücre ve dokuların içinde. Nispeten nadir transkript için sadece birkaç küçük puncta görülür. Transkript bereket arttıkça, bunlar sayı ve boyutu büyür. Tek molekül olarak balık (smFISH) ile tek küçük puncta için tek RNA’ların da karşılık ve aynı zamanda kolayca görüntüleme ve Bilişim yazılım kullanarak sayısal. Karşılaştırmalar Yayınlanan görüntülerin smFISH biz küratörlüğünü görüntülerle aynı hedefler için kullanılarak elde her ne kadar bu-meli var olmak sınav daha titiz karşılaştırmalar tarafından genel, duyarlılık ve kararlılık-in iki yöntem nispeten benzer olduğunu göstermektedir. SmFISH çok daha yüksek masrafına göz önüne alındığında, burada sağlanan yöntem maliyetinin bir kısmını benzer sonuçlar verecektir. Ancak, Eğer amaç küçük transkript veya transkript farklı yerlerini tespit etmek, smFISH önerilir.
Bazı balık probları daha küçük boyutu nedeniyle, bu yöntem aynı zamanda büyük veya önemli engelleri delici doku daha iyi olabilir. Ancak, bizim kullanımı daha yüksek deterjan düzeyleri ve doku fiksasyon ve permeabilization tweaks bu sorunu çözmüş görünüyor. Son olarak, Drosophila dokular için geliştirilen rağmen burada açıklanan disseke dokular için yüksek deterjan arabellekleri da Drosophila embriyo yanı sıra diğer çoğu organizmalar ve dokular için çalışması gerekir.
The authors have nothing to disclose.
Destek bu proje için finansman bir grant tarafından HMK Kanada kurumları, Sağlık (paspas 133473 vermek) araştırma tarafından sağlandı.
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |