המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.
המאמצים שלנו כדי לקבוע דפוסי ביטוי ולוקליזציה subcellular של דרוזופילה RNAs על בסיס הגנום כולו, ו במגוון של רקמות, פיתחנו שינויים ושיפורים רבים כדי שלנו המקורי פלורסנט סיטו פרוטוקול הכלאה (דגים). כדי להקל על התפוקה ויחס עלות-תועלת, כל השלבים, מדור בדיקה לאיתור אות, מבוצעות באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter אקסון. Digoxygenin (מחדירים)-הגששים שכותרתה antisense RNA מיוצרים באמצעות שיבוטים cDNA או דנ א גנומי כתבניות. לאחר קיבוע הרקמה, permeabilization, הגששים הם hybridized כדי תעתיקים של הריבית, אז שזוהו באמצעות רצף של נוגדן אנטי החפירה מצומדת כדי ביוטין, streptavidin מצומדת כדי חזרת peroxidase (HRP) ו fluorescently מצומדת . tyramide, המייצרת בנוכחות HRP, בינוני מאוד תגובתי המאגד לאזורים צפופים אלקטרונים של חלבונים סמוכים מיידית. השלבים הגברה ולוקליזציה לייצר אות מקומי מאוד ועמיד המקל על שני לוקליזציה התעתיק סלולרית ו- subcellular. הפרוטוקולים סיפק מוטבו להפקת אותות ספציפי מאוד במגוון רחב של רקמות, שלבים התפתחותיים. הפניות ניתנים גם וריאציות נוספות המאפשרות זיהוי בו זמנית מספר תעתיקים, או תעתיקים, חלבונים, באותו זמן.
שיטות זיהוי RNA של הגנום כולו חדשות כגון ה-RNA-seq הרחיבו מאוד את הידע שלנו של מתי ואיפה באים לידי ביטוי של גנים, ועל איזה רמות1. עם זאת, אלה מספקים טמפורלית הדלה יחסית ופתרון מרחבית. רנ א בהכלאה באתרו מאפשר את התפוצה המרחבית של תעתיקים חזותית שחלים ברקמות קבוע, ובכך לחשוף את הפרטים של לוקליזציה הסלולר, subcellular2. שימוש פלורסנט היברידיזציה (דגים) מאפשר רזולוציה מרחבית יותר שכן היא מאפשרת את השימוש בטכניקות מיקרוסקופ רב עוצמה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי וגיליון אור3. סמני פלורסנט כגון דאפי יכול לשמש גם כדי ליצור קשרים subcellular4. דגים מקלה גם על התצפית של RNAs וחלבונים מרובים בו זמנית עם סימנים ברורים של חפיפה ברמת subcellular. ניתן למצוא ב-3,הפניות הבאות5ריאגנטים ייחודי השלבים הנדרשים עבור תיוג-כפול.
ההליכים המתוארים כאן לנצל microtiter 96-ובכן לוחות עבור כל השלבים, כולל ייצור תבנית cDNA (המושבה PCR), ייצור בדיקה RNA (באמצעות שעתוק תלויי-פולימראז הגשמים T7, T3 או SP6) באתרו בתוך הכלאה, ו פיתוח אות ניאון. מספר מספיק של העוברים או רקמות נוספות כל טוב של צלחת 96-ובכן כדי לאפשר הערכה של עקביות ולשינויים. כל אחד מקבל אז בדיקה שונים. לאחר פיתוח אות, העוברים או רקמות מכל קידוח נערכים בשקופיות בודדות מיקרוסקופ לבדיקה מיקרוסקופית.
השימוש tyramide אות הגברה (TSA) לצורך זיהוי המכשיר מייצר אותות חזקים עם רזולוציה יוצאת דופן subcellular 5,6,7,8. לוקליזציה subcellular של RNAs הוא מנגנון רגולטורי חשוב 9 שמופיע אצל כמעט כל RNAs 4,10,11. ניתוחים אלה הראו גם כי העותק רבים לא מזוהים על ידי RNA-seq מאותרים בקלות על ידי דגים 8. העיבוד של RNA בחיי עיר הכלאה ללוחות 96-ובכן מאפשר ניתוח של הגנים עד 96 של עניין בכל פעם (צלחות יותר אם נוספים משמשים), ביצוע ניתוח של אלגוריתמית אפשרי. על ידי חיתוך הלוחות למקטעים קטנים יותר, השיטה מותאם בקלות גם רק כמה דוגמאות. פרוטוקול סיפק מתאימה לניתוח של RNA התפלגויות של רוב סוגי רקמות. אמנם לא מוצג, זה וישימה הלא –דרוזופילה רקמות גם כן.
טבלה 7: פתרון הכלאה. 3. אוסף רקמת גידול של העובר, זחל, מבוגר דרוזופילה. הערה: בקנה מידה קטן (בקבוקים) והן מסה (תיבות) לטוס לגידול, להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה לעוף על מזון קמח תירס מבוסס על 25 מעלות צלזיוס לשמור מתאים למבוגרים, זחל צפיפות, מספקים אבקת שמרים פעילים נוספים על מזון משטחים. לאסוף העוברים בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. הצעדים העיקריים של העובר אוסף מומחשים איור 3- הערה: לאחר שטיפה devitillinized עוברי, מתנול, העוברים קבוע ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת. העובר permeabilization, קיבוע שאחרי המבוצעות היום 1 של פרוטוקול דגים. הכן טרי 40% PFA מניות פתרון. הכן טרי פתרון מניות של 40% paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב 10 מ”ל של DEPC התייחסו ddH 2 O ל- 3.68 g של כדורגלן, µL 70 של 2N KOH בבקבוקון זכוכית 20 מ”ל נצנוץ המכיל אנחנו חיים מערבבים קטן התראה: PFA רעיל מאוד עם פוטנציאל השפעות בריאותיות כרוניות וחמורות. לקרוא MSDS (חומר בטיחות גליונות נתונים) ולהשתמש עם הגנה ראויה על העיניים, העור, מערכת הנשימה- בשכונה fume, מחממים ומערבבים את המבחנה למשך 3-5 דקות על צלחת חימום ב 200 ° C עד התפרקה לחלוטין מחברים. להסיר הפתרון מניות PFA מהאש ברגע מחברים מפורקת (לא לחמם יותר מדי). מגניב את הפתרון מניות של כדורגלן 40% מומס על קרח למשך 5 דקות, ולסנן עם מזרק מסנן ו 10 מ ל 0.2 µm. Instar השלישי הזחלים (L3) או קיבוע הרקמה למבוגרים, מרווה, permeabilization הערה: פרוטוקול זה אמור להסתיים ביום אחד. הוא כולל רקמות לנתיחה, קיבוע, להרוות HRP אנדוגני, permeabilization, קיבוע שאחרי. פתרונות תיקון הכן (תיקון-I ו- II-תיקון) לפי טבלה 8. הערה: חומצה Picric משמש לשבועיים נוספים כאשר רקמות יש מבנה עדין שחייבים להשמר. זה לא מקבע טוב כאשר רקמת ultrastructure חייב להישמר עבור מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). אזהרה: חומצה Picric לא יציב ויש לו את היכולת להגיב עם חומרים אחרים וליצור תרכובות חומר נפץ. השתמש ואחסן לפי הנחיות בטיחות. המקום הזחלים או הזבוב הבוגר של צינור פלסטיק 50 מל המכילה 10 מ”ל של קר 1 X PBS ו 100 µL של תיקון-אני הפתרון. הרגעה על קרח למשך 2 דקות להפחית את תנועתיות לטוס זחל או למבוגרים- לחתוך את הקצה של טיפ 1 מ”ל פלסטיק כדי ליצור פתח 2-3 מ מ. להעביר 10-30 הזחלים או מבוגר טס עם קצה 1 מ”ל לתוך צלחת פטרי (קוטר 9 ס מ) עם שכבה שטחית של 1 X PBS מהצינור 50 מ ל (שלב 3.3.2). הוספת קצת PBTT יכול להפחית מתח. בזהירות לנתח זחל (פתח קדמי וסוחטים רקמות מן האחוריים כדי קדמית) או רקמות בוגרות עניין עם זוג מלקחיים חדה תחת טווח ויבתר. הערה: בערך 200-300 הזחלים או האשכים למבוגרים יכולים להיות גזור ותוקנו ביום אחד על ידי אנשים מנוסים. העברת גזור רקמות עם פיפטה 200 µL (עם קצה מנותקים כדי ליצור בקוטר 2 מ מ פתיחה) לתוך צינור 1.5 mL החנות על קרח. להשלים את כל הסיבוב של ביתור בתוך 10-15 דקות לפני מתקדם לשלב הבא. הערה: המשך עם סיבובים נוספים (בתוך חלון הזמן 2 h) כפי הנדרש להפקת חומר מספיק. תיקון רקמות עם 800 µL של תיקון-אני פתרון במשך 30 דקות על הספסל מערבל העליון. רקמות שטיפה פעם עם 800 µL 1 X PBTT ולשמור צינורות בקרח לתקופה מקסימלית של 2.5 ח’ עקב 30 דקות להגביל, צריך להתבצע batch-wise עד רקמה מספקת נאסף. מאגר לכל רקמות ביתור וקבוע לתוך צינור פלסטיק 15 מ”ל יחיד המכיל רשת במכסה (ראה איור 4 לעיצוב tube). האחות עודף נוזל מבעד לרשת במכסה שפופרת. רחץ 3 X 5 דקות כל אחד עם 10 מ”ל של 1 X PBTT. לשטוף פעמיים עם 10 מ”ל של PBS 1 X כדי להסיר דטרגנט. הדבר מונע בועות העודפים בשלב הבא. הערה: אם רקמות ביתור לשקוע לתחתית הצינור, השלבים ניתן לבצע גם צלחות microtiter רגיל או 0.5-1.5 mL microcentrifuge צינורות (300-800 µL נפח למחזור). להרוות אנדוגני HRP פעילות עם 5 מ של 0.3% H 2 O 2 ב- PBS למשך 15 דקות ב- RT. אני חוזר עוד פעם. להשאיר את המכסה פתוח במהלך שלב זה ללא ערבוב. יש לשטוף פעמיים באמצעות 10 מ”ל של 1 X PBTT. תשטוף פעמיים במשך חמש דקות עם 10 מ של 1 X PBTT. Permeabilize רקמות עם 10 מ”ל של 80% אצטון (-20 ° C, טרום מקורר) ב-20 ° C עבור 10 דק ‘ היפוך ‘ הצינור פעמיים במהלך תקופת הדגירה. תשטוף פעמיים במשך 10 דקות עם 10 מ”ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים ברקמות. פתרון שטיפה עם 10 מ”ל תערובת של הכלאה PBTT פלוס 5 מ ל מ ל (1:1). למחוק את תמהיל ולהחליף עם פתרון הכלאה 10 מ”ל. דוגמאות ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש. לקבלת תוצאות מיטביות, אל תאחסן דגימות יותר משבוע. רכיב לתקן לי (10 מ”ל) לתקן את השני (10 מ”ל) מניות PFA 40% 1 מ”ל 1 מ”ל PBTT מ”ל 8.99 9 מ ל חומצה Picric פתרון 10 μl –
טבלה 8: פתרונות לתיקון רקמות. 4. הכלאה בחיי עיר הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש מינימום של 2 ימים, עם הכנת הדוגמא, הכלאה קדם הכלאה לוקח מקום על זיהוי 1, בדיקה היום על יום 2. אם מספר דוגמאות הוא גבוה יחסית, אם לא מוכר עם הפרוטוקול, או יום שלם אינה אפשרית, הפרוטוקול צריכה להתבצע תוך שלושה ימים עם השלבים של בדיקה וזיהוי אותות הגברה מחולק ל 2 ימים. מספרים גדולים של העוברים או דגימות רקמה ביתור עשויים גם לדרוש ימים נוספים כדי לעבד. עבור דגימות רקמה גזור, להחליף 1 X PBT 1 X PBTT של כל השלבים, אלא אם צוין אחרת. ? הנוזל נוסף נדרש עבור חדירה של רקמות זחל ומבוגרים רבים, כגון המוח ואת testis. אף 1 לא נבדק, ניתן להשתמש X PBTT גם עבור עוברי. השתמש 100 µL לכל טוב צלחות 96-ובכן, µL 800 עבור צינורות 1.5 mL- הכלאה קדם, הכלאה הערה: השלבים 4.1.1-4.1.6.2 הן עבור העובר בחיי עיר הכלאה. עבור רקמות זחל או למבוגרים בחיי עיר hybridizations, דלג על שלבים אלה. להסיר 2 מ”ל של העוברים קבוע (המאוחסן מתנול ב-20 ° C) אל צינור 15 מ”ל. רחץ עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ”ל של מתנול לשטוף כל. ווהsh העוברים על 7 דקות עם 10 מ”ל תערובת של מתנול X 1 PBTT (1:1). לשטוף את עוברי פעמיים במשך 7 דקות עם 10 מ”ל של PBTT X 1 כדי להחזיר נוזלים. עבור העובר permeabilization, להכין פתרון ביניים proteinase K (40 µL/mL) על ידי דילול שבערך מהפתרון מניות (20 מ”ג/מ”ל). חנות ב-20 ° C. הופכים את הפתרון proteinase K עובד על ידי דילול הפתרון ביניים proteinase K-1/15 ב PBTT X 1 עבור ריכוז העבודה הסופית של ug 2.667/mL. Permeabilize עוברי עם 10 מ”ל של עובד פתרון proteinase K (שימוש פחות עבור מספר קטן יחסית של העוברים). דגירה הצינור ב RT עבור 13 מינימלית בעדינות היפוך הצינור 4 פעמים במהלך הדגירה. דגירה הדגימות בפתרון proteinase K על קרח לשעה ללא ערבוב. הערה: זו דגירה ארוך יחסית עם שתדללו proteinase K מבטיחה permeabilization reproducibly אחיד ולא מכתים עוקבות. בעוד עוברי permeabilize, להפוך 2 מ”ג/מ”ל גליצין פתרון מ X 10 מניות (20 מ”ג/מ”ל) ב 1 PBTT X עבור הנפח הכולל של 30 מ ל- פתרון הסר proteinase K, לשטוף עם 10 מ”ל של גליצין פתרון (2 מ”ג/מ”ל) ולשטוף פעמיים למשך 2 דקות כל אחד. לשטוף שלוש פעמים עם 10 מ”ל של PBTT 1 X כדי להסיר את גליצין. קיבוע שאחרי של העוברים. להכין 10 מ”ל של 4% מחברים (1 מ”ל של 40% מחברים ב 9 מ של PBTT, מסונן דרך מסנן מיקרומטר 0.45). דגירה בדגימות ב 4% מחברים עבור מינימלית 20 X 3 שטיפת למשך 2 דקות עם PBTT. להכין פתרון שפגע בסימני הכלאה, מרתיחים את הפתרון הכלאה במשך 5 דקות. לשימוש צלחת מלאה 96-ובכן, שלושה צינורות של 12 מ. מגניב על הקרח מיד עבור 5 דק שטיפה עוברי פעם אחת עם 10 מ”ל של 1 X PBTT: הכלאה פתרון (1:1). לשטוף פעמיים עם 5 מ של הכלאה פתרון. Aliquot µL ~ 20 לכל טוב של התיישבו עוברי (30-40 עוברי) או קבוע רקמות לתוך צלחת PCR 96-ובכן על קרח. הסרת פתרון הכלאה רקמות או עוברי באמצעות פיפטה סעפת של ערוץ 8 ( איור 1 / וידאו). הערה: יש פיפטה סעפת ‘ להפסיק ’ שמונע את הטיפים מ שוקעים הבארות והסרה של הדגימה. לניסויים באמצעות רקמות שצפים, להסיר את נוזלי בזהירות עם פיפטה 100 µL מלמעלה. µL להוסיף 100 של הכלאה שפגע בסימני לפתרון כל טוב. מראש hybridize עוברי למשך תקופה מינימלית של 2.5-3 h ב 56 ° C באמצעות יחידת חימום לאמבטיה יבשה המכיל חרוזי מתכת (ראה חומרים, איור 1). . בדיקת denature 100 µL של התוכנית בצלחת PCR 96-ובכן באמצעות thermocycler עבור 5 דקות-80 ° C. מיד מגניב על קרח למשך 5 דקות הסרת פתרון הכלאה קדם עוברי או רקמות. להוסיף שפגע בסימני הגששים גנים ספציפיים לכל אחד לטעום, לכסות עם דבק סלוטייפ לסתימה, hybridize ב 56 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h O/N, תחת חרוזי מתכת באמבט יבש חימום ההוראה 5. בדיקה לזיהוי לחמם את הפתרונות טבלה 9 ביחידת חימום 56 ° C. להסיר את הגששים מהצלחת. הערה: רגשים יכול לעשות שימוש חוזר בין 2 – 3 פעמים אם מאוחסנים ב- 80 ° C (לא החנות RNA כל דגימות ב-20 ° C). לאחר הכלאה, הרנ א נטושים זוגי יציב יותר סטרנד יחיד RNA, ויש פחות רגישים השפלה הנגרמת על ידי זיהום RNase. אם משתמש מערכת סינון ואקום צלחת רב טוב בשביל לרקמות, יש לכלול צלחת אוסף כתשר מסנן כדי לאסוף את הגששים (ראה וידאו עבור מכלול הפרטים). רקמות hybridized יהיה צורך ניתן להעביר את הצלחת microtiter 96-ובכן קבוע המשמש הכלאה אחת עם 1.2 מיקרומטר נקבובית גודל PVDF ממברנות על החלק התחתון של כל טוב. שלב טרום חימם פתרון (56 ° C) זמן נפח לכל טוב הכלאה פתרון: PBTT (3:1) 1 15 דקות 100 μl 2 הכלאה פתרון: PBTT (3:1) 15 דקות 100 μl הכלאה פתרון: PBTT (1:1) 3 15 דקות 100 μl 4 הכלאה פתרון: PBTT (1:3) 15 דקות 100 μl 5 שוטף PBTT 3 5 דקות 100 μl טבלה 9: שטיפת הגששים לאחר הכלאה. , אם באמצעות לוחות נורמלי, שטיפת דוגמאות לפי טבלה 9 ביחידת חימום-56 ° C. אם באמצעות מערכת סעפת ואקום, להשתמש בפתרונות מחוממת עם מערכת ואקום על הספסל ולהסיר את הפתרונות מיד מהנשיאות מתחת על-ידי vaccuum. לאחר לשטוף את השלישי עם 1 X PBTT, ניתן להסיר את הצלחת נורמלי מן החימום ההוראה הכנת נוגדנים. 11 להכין מ”ל של נוגדן ראשוני פתרון (2.5 µg/mL) במלאי (1 מ”ג/מ”ל) על ידי דילול נוגדן אנטי החפירה monoclonal העכבר מצומדת ביוטין (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB (1:400). אם עיבוד הדגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם. 11 להכין מ”ל של streptavidin-HRP פתרון (1 µg/mL) במלאי (1 מ”ג/מ”ל) על ידי דילול 1:1000 streptavidin-HRP נזווג (ראה רשימת חומרים) ב- PBTTB. אם באמצעות דגימות פחות, התאמת אמצעי אחסון בהתאם. לחסום עוברי או רקמות עם PBTTB (חלב רזה 1% 1 X PBTT) במשך 20 דקות על הספסל העליון מיקסר-RT. הערה: מסנן PBTTB באמצעות נייר סינון (כיתה 3, 6 מיקרומטר) לפני השימוש בו על צלחות 96-ובכן מסנן כדי למנוע סתימת מסנני ‘ ‘. במקום PBTB, PBTTB (PBTB עם נוספים 0.3% טריטון-X-100) משמש לרקמות כל במהלך הפרוטוקול. Incubate עוברי או רקמות בפתרון נוגדנים (100 µL טוב) כבר שעתיים על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף פעמיים עם 1 x PBTTB. לשטוף 3 X עבור 5 דקות ו- 5 X 10 דקות עם PBTTB. דגירה עוברי או רקמות עם streptavidin-HRP פתרון (100 µL טוב) h 1.5 באמצעות מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 2 X עבור 5 דקות עם PBTTB. לשמור דגימות בחושך מנקודה זו על. הערה: במהלך כל נוגדן שוטף, אם הרקמה הוא אובדן עקב אטימות המיוצר על ידי החלב, נסה כביסה בלי החלב (PBTT במקום PBTTB). להכין פתרון דאפי-100 המדללת X DAPI ב PBTTB (1: 100). Incubate עוברי או רקמות עם פתרון דאפי (100 µL טוב) למשך 15 דקות על מערבל מדגם ספסל-העליון. לשטוף 4 X 10 דקות עם PBTT. לאחסן את הצלחת 96-ובכן עם דגימות O/N ב 4 ° C או להמשיך לשלב הבא. הערה: ההליך אפשר לעצור כאן. 6. זיהוי נוגדנים באמצעות tyramide (ראה איור 5) הערה: כאן תוצרת בית cyanine מצומדת 3 tyramide שימש, אשר הוכן לפי הפרוטוקול המתואר 12 . אם ביצוע ניסויים רבים או בדיקות דגימות רבות, פעולה זו שומרת את כמות משמעותית של כסף יעיל לעומת ריאגנטים מסחרי (מניסיון). עבור פחות ניסויים ודוגמאות, ניתן להשתמש cyanine זמינים מסחרית 3-tyramide (ראה חומרים). לדוגמה שטיפת צלחות 3 X עבור 5 דקות עם 1 X PBTT. הכנת tyramide הפעלת מאגר (הפעלת מאגר) המכיל 0.006% 2 O H 2 ב- PBTT (שתדללו 30% (w/w) H 2 O 2 מניות 1:5000). לשטוף הצלחות עם מאגר הפעלה. הכנת cyanine 3-tyramide פתרון על ידי דילול זה הפעלת מאגר בשפופרת 15 מ”ל. לשימוש העוברים, דילול 1:80 (137 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). בשביל לרקמות זחל, להשתמש 1:150 דילול (73 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים האשכים, דילול 1:200 (55 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). לשימוש למבוגרים שחלות, 1:300 דילול (36 µL של cyanine 3-tyramide ב- 11 מ של הפעלת מאגר). דגירה דגימות עם cyanine 3-tyramide פתרון 2 h על הספסל-העליון מדגם מיקסר. לשטוף ארבע פעמים עם PBTT. לשטוף 6 X 10 דקות עם PBTT. לשטוף X 3 עבור 5 דקות עם PBS להסיר את הנוזל. µL להוסיף 150/טוב של אנטי-עמעום הרכבה מדיה. לשמור דגימות O/N ב 4 ° C כדי לאפשר לרקמות או עוברי לשקוע לתחתית הצינור. הר דוגמאות על שקופיות מיקרוסקופ (תחת לנתח טווח לרקמות) ולכסות עם coverslip. לאטום את הקצוות של coverslip עם לק שקוף. התמונה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. הערה: לנתח שליטה שלילי קודם כדי לקבל מושג על ‘ שאינם ספציפיים ’ רקע.
פרוטוקול המתואר מספק שיטה לשחזור מאוד, רגישה, וחסכוני עבור הגילוי של RNAs רוב קבוע עוברי דרוזופילה או רקמות. למרות מעט יותר מסובך ממה יותר השתמשו באופן מסורתי phosphatase אלקליין בשיטה של בדיקה לזיהוי, הרזולוציה מתקבל על ידי דג גדול בהרבה, והוא הרגישות דומות או משופרת 7,8. באמצעות לוחות שלמים או חלקיים microtiter, הפרוטוקולים יכול לשמש עבור ניתוחים בקנה מידה גדול או מוגבלת של הגנים של עניין. יצוין כי הגששים שנוצר עשוי לזהות את כל או אחוי התעתיק מספר טפסים אלא אם הגששים נועדו יותר במיוחד (קרי, exons יחיד). למרות בדקנו הגששים קטן כמו נוקלאוטידים 200 עם הצלחה סבירים, הגששים קטנים נוטים להיות פחות יעיל, וייתכן שהוא פחות ספציפי. . בבירור, פרוטוקול זה אינו מתאים עבור זיהוי אינטרונים קטן, exons, או מעובד מיקרו Rna.
למרות גישה זו משתמשת צעד אנזימטי כדי להגביר את עוצמת האותות, עוצמת אות מופיעה כדי להיות פרופורציונלי היעד גנים במגוון יחסית לינארית ורחב של רמות הביטוי. בהגדלה גבוהה יותר, האות נתפסת puncta או ספאקלס בתוך תאים ורקמות. עבור תעתיקים נדירים יחסית נראים רק כמה puncta זעירים. התעתיק שפע גודלת, אלה גדלים מספר וגודל. כמו עם מולקולה בודדת דגים (smFISH), puncta קטן יחיד יתאימו גם ל- RNAs יחיד, צריך גם להיות ברצון לכמת באמצעות תוכנת הדמיה ואינפורמטיקה. השוואות של תמונות שפורסמו שהושג באמצעות smFISH עם תמונות כי לנו יש מספר פעמים עבור המטרות אותן מציע כי בסך הכל, רגישות ורזולוציה של שתי השיטות דומים יחסית, למרות זה צריך להיבדק על ידי השוואות קפדנית יותר. בהתחשב את חשבון גבוה יותר של smFISH, פעולת השירות שסופק כאן צריך לתת תוצאות דומות בכל חלק של העלות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות תעתיקים קטן, או חלקים ברורים של הפרוטוקולים, מומלץ smFISH.
בשל גודל קטן יותר של הגששים דגים מסוימים, שיטה זו עשויה גם להיות יותר החודר לרקמות גדולים, או מכשולים משמעותיים. עם זאת, השימוש רמות גבוהות דטרגנט וצובטת רקמות קיבוע ו permeabilization מופיעים פתר בעיה זו. בסופו של דבר, למרות שפותח דרוזופילה לרקמות, המאגרים דטרגנט גבוהה המתוארים כאן בשביל לרקמות ביתור צריך גם לעבוד עבור עוברי דרוזופילה וכן רוב אחרים אורגניזמים ורקמות.
The authors have nothing to disclose.
תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על ידי מענק כדי HMK על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק 133473 סמרטוט).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |