記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ プレートとパスチラミドシグナル信号増幅を使用して、高解像度、感度、および、スループットと比較的低コストで成績証明書が検出できます。
当社オリジナル蛍光原に数多くの修正および改善を開発した式のパターンとショウジョウバエゲノムに基づいて Rna の細胞内の局在を決定するための努力と様々 な組織では、の交配 (魚) のプロトコル。スループットと費用対効果を容易にするには、プローブ信号検出、世代から、すべての手順は、エクソンの 96 ウェル マイクロ プレートを使用して実行されます。Digoxygenin (掘る)-ラベル アンチセンス RNA プローブは、テンプレートとして cdna やゲノム DNA を使用して生成されます。ティッシュの固定、透過後興味のトラン スクリプトにプローブを交配し、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に共役し、蛍光標識ストレプトアビジンに共役抗 DIG 抗体の連続を使用して検出されました。パスチラミドシグナル、HRP の存在下ですぐに隣接する蛋白質の電子密度の高い領域に結合する反応性の高い中間体を生成します。増幅およびローカリゼーション手順は、両方の細胞および細胞内局在のトラン スクリプトのローカライズを容易にする堅牢で非常にローカライズされた信号を生成します。提供されるプロトコルは、さまざまな組織や発達段階に特異性の高い信号を生成する最適化されています。参照は同時に複数の成績証明書または成績証明書と蛋白質の同時検出を許可する追加のバリエーションもあります。
RNA シーケンスなど新たなゲノム RNA 検出方法は大きく何レベル1いつ、どこの遺伝子の表現の知識を拡大しています。ただし、これらは時間的・空間的解像度が比較的低いを提供します。In situ ハイブリダイゼーション RNA は、こうして細胞および細胞レベル下のローカリゼーション2の詳細を明らか固定組織で観察される視覚的に成績の分布をことができます。蛍光そのままの交配 (魚) を使用すると、さらに多くの空間分解能共焦点と光シート顕微鏡3などの強力な顕微鏡の技術の使用をことができます。4細胞の関係を確立するなど DAPI の蛍光マーカーが使えます。魚も細胞レベルで重複の明確な兆候と同時に複数の Rna とタンパク質の観察が容易になります。ユニークな試薬および二重分類に必要な手順は、次の参照3,5で見つけることが。
ここで説明する手順は、cDNA テンプレート制作 (コロニー PCR)、RNA プローブ生産 (T7、T3 または SP6 ポリメラーゼ依存流出転写を使用して)、 in situハイブリダイゼーションを含むすべての手順については、96 ウェル マイクロ プレートを利用し、蛍光信号開発。胚または組織の十分な数がそれぞれに追加されます一貫性そして可変性の評価を許可する 96 ウェル プレートのも。それぞれはそれでは異なるプローブを受け取ります。信号開発後胚または各ウェルから組織を顕微鏡分析のための個々 の顕微鏡スライドで配列します。
プローブ検出のためのパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) の使用は、細胞内に優れた分解能5,6,7,8堅牢な信号を生成します。Rna の細胞内の局在が事実上すべて Rna 4,,1011で発生することが表示されます重要な規制メカニズム9 。これらの解析では、RNA シーケンスで検出されない多くの転写産物が魚8によって容易に検出されたことが示されています。96 ウェル プレートに交配その場でRNA の適応一度に興味の最大 96 遺伝子の解析 (出来れ追加プレート使用)、大規模なデータセットの分析を可能します。小さいセクションにプレートを切断することによってメソッドも簡単にいくつかのサンプルに適応されます。提供されるプロトコルは、組織のほとんどの種類の RNA の分布の解析に適しています。示されていませんが、非 –ショウジョウバエのティッシュと同様に適応されます。
表 7: 交配ソリューション。 3. ショウジョウバエ 飼育し胚, 幼虫および成虫の組織コレクション。 注: 小規模 (ボトル)、質量 (ボックス) 飼育を飛ぶ、25 ° C を維持適切な成虫・幼虫密度で基づくコーンミール料理に飛ぶ実験室の標準のプロトコルを使用して、食品に追加アクティブな酵母粉末を提供サーフェス。 収集胚次の標準的なプロトコル。胚のコレクションの主な手順は、 図 3 に示す. 注: devitillinized 胚をメタノールで洗浄後、固定胚保存できます-20 ° C で 1 年間。魚のプロトコルの 1 日目に胚の透過とポスト固定が実行されます。 PFA 準備新鮮な 40% 原液。 DEPC の 10 mL を混合することによって 40% パラホルムアルデヒド (PFA) の をたて準備原液処理 ddH 2 O PFA と小さな攪拌バーを含む 20 mL バイアル シンチレーションで 2 n 島の 70 μ の 3.68 g 注意: PFA は潜在的な急性および慢性の健康への影響と毒性の高いです。MSDS (安全データシート) を読むし、目、皮膚、気道に適切な保護を使用します。 ヒューム フード熱し、PFA は完全に溶解するまで、200 ° C で加熱プレート上で 3-5 分間バイアルをかき混ぜます。PFA は解散し同時に暑さから PFA 原液を削除 (過熱しない). 40 %pfa の原液の氷上で 5 分間溶解を冷却し、0.2 μ m フィルターと 10 mL の注射器にフィルターを適用します。 3 令幼虫 (L3) または大人のティッシュの固定、焼入れ、透過 注: このプロトコルは 1 日で完了する必要があります。それはティッシュを含んでいる解剖、固定、内因性の HRP、透過およびポスト固定の焼入します。 準備の固定解決 (修正-私は、修正プログラム II) 表 8 に従って 。 注: 組織が保持する必要がある繊細な構造を持つ場合、ピクリン酸が追加の定着剤として使用をされます。組織の微細構造は、電子顕微鏡検査 (EM) のために保持する必要がある場合よい定着剤ではありません 。 警告: ピクリン酸は不安定なので、他の材料と反応して爆発性化合物を作成する機能があります。使用し、安全性のガイドラインに従って格納します。 場所の幼虫や成虫 10 mL の PBS X 冷 1 と修正プログラムの 100 μ L を含む 50 mL プラスチック チューブに-私のソリューションです。チル幼虫や大人のフライ運動を減らすために 2 分間氷の上。 2-3 mm の開口部を作成する 1 mL プラスチック チップの先端をカットします。10-30 幼虫を転送したり、大人は 50 mL のチューブ (ステップ 3.3.2) から 1 × PBS の浅い層でシャーレ (直径 9 cm) に 1 mL 先端で飛ぶ。PBTT のビットを追加すると、表面張力を減らすことができます。慎重に解剖幼虫 (前方から開き、前方に後方からのティッシュを絞る) または切り裂くスコープ下でシャープな鉗子のペアと利子の成体 。 注: 約 200-300 の幼虫または成人精巣解剖でき経験豊富な個人によって 1 日で固定します。 転送 1.5 mL チューブに氷上店 (開く直径 2 mm を作成するカットの先端) を 200 μ L ピペットを持つ組織を解剖しました。次のステップに進む前に 10-15 分以内の郭清の各ラウンドを完了します 。 メモ: は十分な材料を生成するために必要 (2 h 時間ウィンドウ) 内の追加のラウンドに進みます。 修正プログラムの 修正組織 800 μ L-私ベンチ トップ ミキサー上で 30 分のためのソリューション。リンス組織 800 μ L で 1 PBTT を X し、2.5 h の 30 分のための最大の氷の上の管を保つ制限、このニーズに十分な組織が収集されるまで、batch-wise になります。 ふたにメッシュを含む単一の 15 mL プラスチック チューブにすべて解体、固定組織のプール (管の設計は、 図 4 を参照)。チューブのふたにメッシュを通して余分な液体を吸引します。3 X 5 分各 10 mL で 1 X PBTT を洗ってください。1x PBS 洗浄剤 10 mL で 2 回すすぎます。これは次のステップでの過剰な泡を防ぐことができます 。 注: 切り裂かれたティッシュは、管の底に沈む場合の手順で行えるように正規のマイクロタイター プレートまたは 0.5 1.5 mL 容マイクロ チューブ (管あたり 300 800 μ L のボリューム). は、もう一度 0.3% H 2 O 2 PBS で RT。 の繰り返しで 15 分間 5 mL で内因性の HRP 活性をクエンチします。混合せずこのステップの間に開く蓋をしてください。1 X PBTT の 10 mL を 2 回使用してリンスします。1 X PBTT の 10 mL で 5 分間 2 回洗って。 は潜伏期間中に 2 回 10 分反転-20 ° C で 10 ml のアセトン 80% (-20 ° C、中古冷蔵) の組織をチューブを permeabilize します。組織の水分補給を 1 X PBTT の 10 mL で 10 分を 2 回洗浄します。 ソリューション 5 ml PBTT プラス 5 ml 交配の 10 mL の混合物 リンス (1:1). ミックスを破棄し、10 ml の交配によるソリューションに置き換え。サンプルは、必要になるまでの-20 ° C で保存できます。最高の結果を得るには、1 週間以上のサンプルを保存しない。 コンポーネント は、II (10 ml) を修正 する 私 (10 ml) を修正 PFA 株式 40 %1 ml 1 ml PBTT 8.99 ml 9 ml ピクリン酸溶液 10 μ l –
テーブル 8: 組織のソリューションを修正します。 4 in situ ハイブリダイゼーション 注: プロトコルのこの部分サンプル準備と 2 日の最小値が必要です、前の雑種と交配を取って日 1 とプローブの検出に。2 日目。サンプル数は、プロトコルに不慣れな場合、比較的高い場合、丸一日では不可能なプロトコルはプローブ検出と信号増幅の 2 日間に分かれての手順を 3 日以内に行わなければなりません。多数の胚または解剖組織サンプルを処理する追加の日もあります。切り裂かれたティッシュのサンプル、特に明記しない限りすべての手順で 1 X PBTT と 1 X PBT を置き換えます。余分な洗剤が、脳や精巣など多くの幼生及び成体組織の浸透のため必要です。ただし未テスト、1 X PBTT も胚の使用可能性があります。96 ウェル プレート、1.5 mL チューブ用 800 μ L/ウェル 100 μ L を使用します。 前の雑種と交配 注: 手順 4.1.1-4.1.6.2 は、胚 の in situ ハイブリダイゼーション。交配 その場で 幼虫や大人のティッシュのこれらの手順をスキップします。 新しい 15 mL チューブに固定胚 (-20 ° C でメタノールに格納) の削除 2 mL。洗うたびにメタノール 10 mL で 7 分のため 2 回の胚を洗います。ワシントン州sh 7 分 10 mL メタノールと 1 X PBTT (1:1) の混合物のための胚。水分補給を 1 X PBTT の 10 mL で 7 分のため 2 回の胚を洗うです。 胚の透過性、希釈原液 (20 mg/mL) から 1: 500 で中間プロティナーゼ K 液 (40 μ L/mL) を準備します。-20 で店 ° C. 作る中間プロティナーゼ K ソリューション 1/15 2.667 ug/mL の濃度に最終的な作業のための 1 X PBTT で希釈することによって作業プロティナーゼ K ソリューションです。 作業プロティナーゼ K ソリューション (以下、胚数の少ない使用) 10 mL を Permeabilize 胚。13 分軽く反転チューブ 4 回孵化中の RT でチューブを孵化させなさい。混合せず 1 時間氷上プロティナーゼ K ソリューションのサンプルをインキュベートします 。 注: 希薄プロティナーゼ K のこの比較的長い孵化により再現性をもって均一透過しその後染色します。 胚を permeabilize 中に、は、2 mg/mL 10 X の在庫 (20 mg/mL) からグリシン ソリューション 30 mL の容量の 1 X PBTT. 削除, プロテイナーゼ K ソリューションはグリシン溶液 (2 mg/mL) 10 mL で洗い、2 分を 2 回洗浄します。グリシンを削除する 1 X PBTT 10 mL で 3 回すすぎ。 胚のポスト固定。 10 ml 4% の PFA (40 %1 mL PBTT、9 mL に PFA を 0.45 μ m のフィルターを通してフィルター). 4% のサンプルをインキュベート PBTT と 2 分 20 分洗浄 3 X PFA。 変性交配ソリューションを準備する は、ハイブリダイゼーション溶液 5 分間ゆでます。全 96 ウェル プレート 12 mL の 3 本のチューブを使用します。すぐに 5 分間氷の上クールな 1 X PBTT 10 mL で一度 リンス胚: 交配ソリューション (1:1)。ハイブリダイゼーション溶液 5 mL で 2 回すすぎます。Μ L 〜 20 分注の井戸あたり胚 (胚 30-40) を解決または氷の上 96 ウェル PCR プレートに組織を固定します。組織または 8 チャネル マニホールド ピペット ( 図 1 /ビデオ) を用いた胚から交配ソリューションを削除します 。 注: マニホールドのピペットは、‘ 停止 ’ 井戸の底に行くと削除のサンプルからヒントを防止します。フロート部組織を用いた実験、上から 100 μ L ピペットと慎重に液体を削除します。 各ウェルに変性交配ソリューションの追加 100 μ L。金属ビーズ (材料と 図 1 を参照) を含む乾燥浴室暖房ユニットを使用して 56 ° C で 2.5-3 h の最小値のための胚を交配済み。 変性 100 μ L 準備の 5 分間 5 分間氷の上の 80 ° c. すぐにクールで、たちを使用して 96 ウェル PCR プレートにプローブ。胚または組織から事前交配ソリューションを削除します。変性遺伝子特異的プローブ各サンプル、シーリング テープでカバーし、ユニットを加熱乾燥風呂に金属ビーズの下で 16-18 h O/N、56 ° C で交配を追加 5。プローブの検出 前暖かい 56 ° C 加熱装置に表 9 のソリューション。プレートからプローブを削除します 。 注: と、プローブは間再利用することができます 2 〜 3 回-80 ° C (-20 ° C の任意の RNA のサンプル ストア決して) で格納されている場合。交配後二重鎖 RNA は一本鎖 RNA より安定して、RNase の混入による劣化を受けにくいします 。 使用して場合、ウェル プレート真空ろ過システム プローブ (アセンブリの詳細については、ビデオを参照してください) を収集するためにフィルター プレートの下の組織までコレクション プレートを含める必要があります。交配させられた組織は、各井戸の底に 1.2 μ m 孔サイズ PVDF 膜に交配に使用通常 96 ウェル マイクロ プレートから転送する必要があります。 ステップ ソリューション (56 ° C) で加温 時間 井戸あたり量 1 交配ソリューション: PBTT (3:1) 15 分 100 μ l 2 交配ソリューション: PBTT (3:1) 15 分 100 μ l 3 交配ソリューション: PBTT (1:1) 15 分 100 μ l 4 交配ソリューション: PBTT (1:3) 15 分 100 μ l
記述のプロトコルは、固定のショウジョウバエの胚または組織のほとんどの Rna の検出のための再現性、高感度、・経済的な方法を提供します。もっと昔からアルカリホスファターゼ プローブ検出法より少し複雑、魚によって得られる解像度がはるかに大きいと感度が同等または強化された7,8。全体または部分的なマイクロタイター プレートを使用して、プロトコルは、大規模なまたは限られた興味の遺伝子解析に使えます。生成されたプローブで検出可能性があります、複数のトラン スクリプト スプライス フォーム プローブは具体的には設計されていない限り、それは注意してください (すなわち、単一エクソン)。我々 は合理的な成功を収めて 200 ヌクレオチドのような小さなプローブをテストしている、小さいプローブをより少なく有効にする傾向がある、特定性の低い可能性があります。明らかに、このプロトコルは、エクソン、小さなイントロンの検出には適していませんまたはマイクロ Rna を処理します。
このアプローチでは、酵素のステップを使用して、信号の強度を高めるが、ターゲット遺伝子の発現発現レベルの比較的線形および広い範囲に比例すると信号強度が表示されます。高倍率で信号が涙点や斑点として見られている細胞や組織内。比較的まれな成績のためだけにいくつかの小さな涙点が見られています。トラン スクリプト豊富なるにつれて、これらは、数とサイズに成長します。単一分子魚 (smFISH) と同様単一の小さな涙点は単一の Rna に対応するものがまた容易に定量化するイメージングおよび情報ソフトウェアを使用しています。同じターゲットのキュレーションが我々 の画像と smFISH を使用して得られる公開された画像の比較では、これはより厳密な比較によってテストされる必要がありますが全体的に、感度と解像度の 2 つのメソッドは比較的同様に、示唆しています。SmFISH の非常に高い出費を考えると、ここで用意されているメソッドは、コストのほんの一部で同様の結果を与える必要があります。しかし、目標を小さな成績証明書または成績証明書の異なる部分を検出する場合は、smFISH をお勧めします。
いくつかの魚のプローブの小さなサイズのため、このメソッドは大規模なまたは重要な障壁貫通の組織の方もあります。ただし、高い洗剤レベルと組織の固定・透過の引っ張ることの私達の使用はこの問題を解決しているに表示されます。最後に、ショウジョウバエのティッシュの開発が、切り裂かれたティッシュのここで説明した高洗浄バッファーもショウジョウバエの胚と同様に他のほとんどの生物や組織のために動作するはず。
The authors have nothing to disclose.
HMK (モップ 133473 付与) 健康研究のカナダの協会に助成金によって提供されたサポートはこのプロジェクトのための資金調達。
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |