Den beskrevne RNA i situ hybridisering protokol giver mulighed for påvisning af RNA i hele Drosophila embryoner eller dissekeret væv. Brug 96-brønd mikrotiter plader og tyramide signal forstærkning, kan udskrifter blive opdaget på høj opløsning, følsomhed og overførselshastighed, og en forholdsvis lav pris.
I vores bestræbelser på at fastlægge mønstre af udtryk og subcellulært lokalisering af Drosophila RNA’er på grundlag af genome-wide, og i en række forskellige væv, har vi udviklet mange ændringer og forbedringer til vores oprindelige fluorescerende in situ hybridisering (FISH) protokol. For at lette overførselshastighed og omkostninger effektivitet, udføres alle trin, fra sonden generation til signal detection, ved hjælp af exon 96-brønd mikrotiter plader. Digoxygenin (grave)-mærket antisensstoffer RNA-sonder er fremstillet ved hjælp af enten cDNA kloner eller genomisk DNA som skabeloner. Efter væv fiksering og permeabilization, sonder er hybridiseret at udskrifter af interesse og derefter blev fundet ved hjælp af en række anti-grave antistof konjugeret med biotin, streptavidin, konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) og fluorescently konjugeret tyramide, som i HRP, producerer en meget reaktive mellemprodukt, der binder til elektron tætte områder af umiddelbart tilstødende proteiner. Disse forstærkning og lokalisering trin producerer en robust og meget lokaliserede signal, der letter både cellulært og subcellulært udskrift lokalisering. De protokoller findes er blevet optimeret til at producere meget specifikke signaler i en række væv og udviklingsstadier. Referencer er også fastsat yderligere variationer, der giver mulighed for samtidige påvisning af flere udskrifter, eller udskrifter og proteiner, på samme tid.
Nye genome-wide RNA påvisningsmetoder såsom RNA-seq har stærkt udvidet vores viden om hvor og Hvornår generne udtrykkes, og på hvad niveauer1. Men disse giver relativt dårlig tidsmæssige og rumlige opløsning. RNA i situ hybridisering gør det muligt for den geografiske fordeling af udskrifter skal overholdes visuelt i faste væv, dermed afsløre detaljer af cellulært og subcellulært lokalisering2. Brug af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) giver endnu flere rumlige opløsning som det tillader brug af magtfulde mikroskopi-teknikker, såsom Konfokal og lys ark mikroskopi3. Fluorescerende markører som DAPI kan også bruges til at etablere subcellulært relationer4. FISK letter også observation af flere RNA’er og proteiner samtidig med klare angivelser af overlapning på subcellulært niveau. Unikke reagenser og trin, der kræves for dobbelt-mærkning kan findes i følgende referencer3,5.
De procedurer, der beskrives her udnytte 96-brønd mikrotiter plader til alle foranstaltninger, herunder cDNA skabelon produktion (koloni PCR), RNA sonde produktion (transskription T7, T3 eller SP6 polymerase-afhængige afstrømning), in situ hybridisering, og fluorescerende signal udvikling. Tilstrækkeligt antal embryoner eller væv er tilføjet til hver godt af 96-brønd pladen til at muliggøre evaluering af konsistens og variabilitet. Hver modtager så en anden sonde. Efter signal udvikling klædt embryoner eller væv fra hver godt på individuelle objektglas til mikroskopisk analyse.
Brug af tyramide signal forstærkning (TSA) til registrering af sonden producerer robuste signaler med ekstraordinære subcellulært opløsning 5,6,7,8. Subcellulært lokaliseringen af RNA’er er en vigtig regulerende mekanisme 9 , der synes at forekomme med stort set alle RNA’er 4,10,11. Disse analyser har også vist, at mange udskrifter, der ikke er registreret af RNA-seq opdages let ved fisk 8. Tilpasning af RNA i situ hybridisering til 96-brønd plader giver mulighed for analyse af op til 96 gener af interesse på et tidspunkt (mere, hvis flere plader anvendes), muliggjort analyse af store datasæt. Ved at skære pladerne i mindre sektioner, er metoden også let tilpasses til blot et par prøver. Protokollen i henhold er velegnet til analyse af RNA udlodninger i de fleste typer af væv. Selv om ikke vist, er det kan tilpasses til ikke –Drosophila væv så godt.
tabel 7: hybridisering løsning. 3. drosophila opdræt og embryo, larve og voksen væv samling. Bemærk: For både lille skala (flasker) og masse (kasser) flyve opdræt, bruge standard flyve lab protokoller på cornmeal baseret mad på 25 ° C. holde ordentlig voksen og larver tæthed og give ekstra aktive gær pulver på mad overflader. Indsamle embryoner efter standardprotokoller. De vigtigste trin indsamlingsstedet er illustreret i figur 3. Bemærk: Efter skylning devitillinized embryoner i methanol, de faste embryoner kan opbevares ved-20 ° C i op til et år. Embryo permeabilization og efter fiksering udføres på dag 1 i protokollen om fisk. Forbered frisk 40% PFA stamopløsning. Forbered en frisklavet stamopløsning af 40% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved at blande 10 mL af DEPC behandlet ddH 2 O 3.68 g PFA og 70 µL af 2N KOH i en 20 mL glas scintillation hætteglas indeholdende et lille rør bar Forsigtig: PFA er meget giftigt med potentielle akutte og kroniske sundhedsmæssige virkninger. Læs muskel-og Skeletbesvær (sikkerhedsdatablade) og brug med passende beskyttelse for øjne, hud og luftveje. i et stinkskab, varme og rør hætteglas til 3-5 min. på en varme plade ved 200 ° C, indtil PFA er helt opløst. Fjerne PFA stamopløsningen fra varmen, så snart PFA er opløst (ikke overophede). Cool den opløste 40% PFA stamopløsning i isbad i 5 min, og filtrere med en 0,2 µm filter og 10 mL sprøjte. Tredje instar larver (L3) eller voksen væv fiksering, dæmper og permeabilization Bemærk: denne protokol skal være færdig på én dag. Det omfatter væv dissektion, fiksering, quenching endogene HRP, permeabilization og efter fiksering. Forbered fastsættelse løsninger (Fix-jeg og Fix-II) ifølge tabel 8. Bemærk: picrinsyre syre anvendes som en supplerende fiksativ, når væv har en delikat struktur, der skal bevares. Det er ikke en god fiksativ når væv ultrastruktur skal bevares for elektronmikroskopi (EM). Advarsel: picrinsyre syre er ustabil og har evnen til at reagere med andre materialer og skabe eksplosive stoffer. Bruge og gemme efter sikkerhedsretningslinjer. Sted larver eller voksne fluer i et 50 mL plastikrør, som indeholder 10 mL koldt 1 X PBS og 100 µL af Fix-jeg løsning. Chill i isbad i 2 min til at reducere larve eller voksne flyve motilitet. Cut off spidsen af en 1 mL plastik tip til at oprette en 2-3 mm åbning. Overfør 10-30 larver eller voksen flyver med 1 mL spidsen ind i en petriskål (9 cm i diameter) med en lavvandet lag af 1 X PBS fra 50 mL tube (trin 3.3.2). Tilføje en smule af PBTT kan formindske overfladespænding. Omhyggeligt dissekere larve (åben fra forreste og klemme væv fra posteriort for forreste) eller voksen væv af interesse med et par skarpe pincet under et dissekere muligheder. Bemærk: Omkring 200-300 larver eller voksen testiklerne kan dissekeret og fast i en dag af erfarne personer. Overførsel dissekeret væv med en 200 µL pipette (med spidsen afskåret til at oprette en diameter på 2 mm åbning) i en 1,5 mL tube og opbevares på is. Fuldføre hver runde af dissektion indenfor 10-15 min før du går videre til næste trin. Bemærk: Fortsætte med yderligere runder (inden for en 2 h tidsvindue) som skal generere tilstrækkelig materiale. Fix væv med 800 µL af Fix-jeg løsning for 30 min på en bænk top mixer. Skyl væv når med 800 µL 1 X PBTT og holde rør på is i højst 2,5 h. på grund af 30 min begrænse, dette skal udføres batch-wise, indtil tilstrækkeligt væv er blevet indsamlet. Pool alle dissekeret og faste væv ind i en enkelt 15 mL plastik rør indeholdende mesh i låget (Se fig. 4 for tube design). Suges overskydende væske gennem trådnet i tube låget. Vask 3 X 5 min hver med 10 mL af 1 X PBTT. Skylles to gange med 10 mL 1 X PBS fjerne vaskemiddel. Dette forhindrer overskydende bobler i næste trin. Bemærk: Hvis dissekeret væv synker til bunden af røret, trin kan udføres i regelmæssig mikrotiter plader eller 0,5-1,5 mL microcentrifuge rør (300-800 µL volumen pr tube). Dæmpning endogene HRP aktivitet med 5 mL 0,3% H 2 O 2 i PBS for 15 min på RT. gentage endnu en gang. Hold låget åbent under dette trin uden blanding. Skylles to gange med 10 mL af 1 X PBTT. Vaskes to gange for 5 min med 10 mL af 1 X PBTT. Permeabilize væv med 10 mL 80% acetone (-20 ° C, før kølet) ved-20 ° C i 10 min. inverter røret to gange under inkubationstiden. Vaskes to gange i 10 min med 10 mL af 1 X PBTT at rehydrere væv. Skylles med 10 mL blanding af 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisering løsning (1:1). kassér mix og erstatte med 10 ml hybridisering løsning. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil det skal bruges. For de bedste resultater, må ikke opbevares prøver for mere end en uge. Fix jeg (10 ml) komponent Fix II (10 ml) 40% PFA stock 1 ml 1 ml PBTT 8.99 ml 9 ml picrinsyre syre løsning 10 μl –
tabel 8: fastsættelse af løsninger for væv. 4. in situ hybridisering Bemærk: denne del af protokollen kræver et minimum af 2 dage, med prøveforberedelsen, før hybridisering og hybridisering tager sted på dag 1 og sonde afsløring på dag 2. Hvis antallet af prøver er relativt høj, hvis bekendt med protokollen, eller en hel dag er ikke muligt, skal protokollen udføres i 3 dage med trin af sonden påvisning og signal forstærkning opdelt i 2 dage. Stort antal embryoner eller dissekeret vævsprøver kan også kræve ekstra dage til at behandle. Erstatte 1 X PBT med 1 X PBTT i alle trin, for dissekeret vævsprøver, medmindre andet er angivet. Den ekstra vaskemiddel er nødvendig for penetration af mange larve og voksen væv, såsom hjerne og testiklerne. Selv om ikke testet, 1 kan X PBTT også bruges til embryoner. Bruge 100 µL pr. brønd til 96-brønd plader og 800 µL til 1,5 mL rør. Pre hybridisering og hybridisering Bemærk: trin 4.1.1-4.1.6.2 er for embryo i situ hybridisering. Larve eller voksen væv i situ hybridizations, springe disse trin. Fjerne 2 mL af faste embryoner (gemt i methanol ved-20 ° C) til en ny 15 mL tube. Vask embryoner to gange i 7 min med 10 mL methanol i hver vask. WAsh embryoner i 7 min med 10 mL blanding af metanol og 1 X PBTT (1:1). Vaske embryoner to gange i 7 min med 10 mL af 1 X PBTT at rehydrere. For embryoner permeabilization, udarbejder en mellemliggende proteinase K løsning (40 µL/mL) ved fortynding 1: 500 fra stamopløsningen (20 mg/mL). Opbevares ved -20 ° C. gør en brugsopløsning på proteinase K ved at fortynde den mellemliggende proteinase K løsning 1/15 i 1 X PBTT for en endelig arbejder koncentration af 2.667 ug/mL. Permeabilize embryoner med 10 mL arbejder proteinase K løsning (Brug mindre for et mindre antal embryoner). Inkuber tube på RT for 13 min. blidt vende røret 4 gange under inkubation. Inkuber prøver i proteinase K løsning på køl i 1 time uden blanding. Bemærk: Denne forholdsvis lang inkubationstid med fortyndet proteinase K sikrer reproducerbar ensartet permeabilization og efterfølgende farvning. Mens embryoner permeabilize, gør en 2 mg/mL glycin løsning fra 10 X lager (20 mg/mL) i 1 X PBTT for en samlet maengde paa 30 mL. Fjern proteinase K løsning, skylles med 10 mL af glycin løsning (2 mg/mL) og vaskes to gange i 2 min. Skylles tre gange med 10 mL af 1 X PBTT til at fjerne glycin. Efter fiksering af embryoner. Forberede 10 mL 4% PFA (1 mL 40% PFA i 9 mL PBTT, filtreret gennem 0,45 µm filter). Ruger prøver i 4% PFA i 20 min. vask 3 X i 2 min. med PBTT. At forberede denatureret hybridisering opløsning, kog hybridisering løsning i 5 min. For en fuld 96-brønd plade, bruge tre rør af 12 mL. Cool på is straks i 5 min. Skylles embryoner engang med 10 mL af 1 X PBTT: hybridisering løsning (1:1). Skylles to gange med 5 mL af hybridisering løsning. Alikvot ~ 20 µL pr. brønd af afgjort embryoner (30-40 embryoner) eller fast væv i en 96-brønd PCR plade på is. Fjerne hybridisering løsning fra væv eller embryoner ved hjælp af en 8-kanal mangfoldige pipette ( figur 1 / video). Bemærk: Den mangfoldige pipette har en ‘ stoppe ’ der forhindrer tips fra går til bunden af brøndene og fjerne udsnit. For eksperimenter ved hjælp af væv, der flyder, fjerne væsken omhyggeligt med 100 µL pipette oppefra. Tilsættes 100 µL af opløsningen denatureret hybridisering til hver brønd. Pre krydse embryoner i minimum 2,5-3 h ved 56 ° C ved hjælp af en tør bad opvarmning enhed der indeholder metal perler (Se materialer og figur 1). Denaturere 100 µL af den forberedte sonden i en 96-brønd PCR plade ved hjælp af en thermocycler i 5 min på 80 ° C. straks cool i isbad i 5 min. Fjerne præ hybridisering løsning fra embryoner eller væv. Tilføje denatureret gen-specifikke sonder til hver prøve, dække med forseglingstape og krydse ved 56 ° C i 16-18 h O/N, under metal perler i tørre bad opvarmning unit. 5. Probe opdagelse pre varm løsninger i tabel 9 i 56 ° C varme enhed. Fjerne sonder fra pladen. Bemærk: Sonder kan genbruges mellem 2 – 3 gange hvis opbevares ved-80 ° C (aldrig store enhver RNA prøver i-20 ° C). Efter hybridisering, dobbelt strandede RNA er mere stabile end enkelt streng RNA, og er mindre modtagelige for nedbrydning forårsaget af RNase kontaminering. Hvis du bruger en en multi godt plade vakuum vandfiltrering system for væv, der skal medtages en indsamling plade under filterplade til at indsamle de sonder (Se video montage oplysninger). Hybridiserede væv bliver nødt til at blive overført fra den regelmæssige 96-brønd mikrotiter plade anvendes til hybridisering til én med 1,2 µm pore størrelse PVDF membraner i bunden af hver brønd. trin pre varmede løsning (56 ° C) tid Volumen pr. brønd 1 Hybridisering løsning: PBTT (3:1) 15 min. 100 μl 2 Hybridisering løsning: PBTT (3:1) 15 min. 100 μl 3 Hybridisering løsning: PBTT (1:1) 15 min. 100 μl 4 Hybridisering løsning: PBTT (1:3) 15 min. 100 μl 5 PBTT 3 vasker 5 min. 100 μl tabel 9: vask sonder efter hybridisering. Hvis ved hjælp af normale plader, vask prøver pr. tabel 9 i en varmeenhed på 56 ° C. Hvis ved hjælp af vakuum mangfoldige system, bruger opvarmet løsninger med vakuum system på bænken og fjerne løsninger straks fra nedenfor ved vaccuum. Efter den 3. vask med 1 X PBTT, normal pladen kan fjernes fra varmen unit. Forbered antistoffer. Forberede 11 mL af primære antistof (2,5 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) ved fortynding biotin-konjugeret mus monoklonalt anti-grave antistof (Se materiale liste) i PBTTB (1: 400). Hvis behandling færre prøver, justerer mængder tilsvarende. Forberede 11 mL streptavidin-HRP opløsning (1 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) ved at fortynde 1:1000 streptavidin-HRP konjugat (Se materiale liste) i PBTTB. Hvis du bruger færre prøver, justerer mængder tilsvarende. Blokere embryoner eller væv med PBTTB (1% skummetmælk i 1 X PBTT) i 20 min. på en bænk top mixer på RT. Bemærk: Filteret PBTTB ved hjælp af filtrerpapir (lønklasse 3, 6 µm) før du bruger det på 96-brønd filter plader til at undgå tilstopning af filtre. I stedet for PBTB, PBTTB (PBTB med yderligere 0,3% Triton-X-100) bruges til alt væv under protokollen. Incubate embryoner eller væv i antistof løsning (100 µL/brønd) i 2 timer på bænken-top prøve mixer. Skylles to gange med 1 x PBTTB. Vask 3 X til 5 min og 5 X til 10 min med PBTTB. Inkuber embryoner eller væv med streptavidin-HRP løsning (100 µL/brønd) for 1,5 h ved hjælp af en bænk-top prøve mixer. Vask 2 X til 5 min med PBTTB. Holde prøver i mørke fra dette punkt. Bemærk: under alle antistof vasker, hvis væv er tabt på grund af opaciteten produceret af mælken, prøv vask uden mælk (PBTT i stedet for PBTTB). Forbered en DAPI løsning ved at fortynde 100 X DAPI i PBTTB (1: 100). Incubate embryoner eller væv med DAPI løsning (100 µL/brønd) for 15 min på en bænk-top prøve mixer. Vaske 4 X til 10 min med PBTT. Gemme 96-brønd pladen med prøverne O/N ved 4 ° C eller gå videre til næste trin. Bemærk: Proceduren kan blive afbrudt her. 6. Påvisning af antistof ved hjælp af tyramide (Se figur 5) NOTE: her hjemmelavet cyanine 3-konjugeret tyramide blev brugt, som blev udarbejdet i henhold til protokollen, beskrevet i 12 . Hvis udfører mange eksperimenter eller teste mange prøver, det sparer en betydelig mængde af penge og er effektiv i forhold til kommercielle reagenser (af erfaring). Færre eksperimenter og eksempler, der kan bruges kommercielt tilgængelig cyanine 3-tyramide (Se materialer). Vask prøve plader 3 X i 5 min. med 1 X PBTT. Forbered tyramide aktivering buffer (aktivering buffer) indeholdt 0,006% H 2 O 2 i PBTT (fortyndet 30% (w/w) H 2 O-2 stock 1:5000). skyl plader med aktivering buffer. Forbered cyanine 3-tyramide løsning ved at fortynde det i aktivering buffer i en 15 mL tube. For embryoner, brug 1:80 fortynding (137 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). Larve væv, brug 1:150 fortynding (73 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). Voksen testiklerne, brug 1:200 fortynding (55 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). For voksne æggestokke, bruge 1: 300 fortynding (36 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). Inkuberes prøver med cyanine 3-tyramide løsning for 2 h på bænken-top prøve mixer. Skylles fire gange med PBTT. Vaske 6 X til 10 min med PBTT. Vask 3 X for 5 min med PBS fjerne vaskemidlet. Tilføj 150 µL/brønd af anti-fade montering medier. Holde prøver O/N ved 4 ° C tillade væv eller embryoner til at synke til bunden af røret. Montere prøver på objektglas (under dissekere muligheder for væv) og dække med coverslip. Forsegle kanterne af coverslip med gennemsigtig neglelak. Billedet ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Bemærk: analysere negativ kontrol først for at få en idé om ‘ uspecifikke ’ baggrund.
Den beskrevne protokol giver en meget reproducerbar, følsomme og økonomisk metode til påvisning af de fleste RNA’er i faste Drosophila embryoner eller væv. Selv om lidt mere kompliceret end mere traditionelt brugt alkalisk fosfatase metode til registrering af sonde, opløsning fremstillet ved fisk er langt større og følsomhed er sammenlignelige eller forbedret 7,8. Ved hjælp af hele eller delvise mikrotiter plader, kan protokollerne, der bruges til storstilet eller begrænset analyser af gener af interesse. Det skal bemærkes, at sonder genereret kan registrere alle eller flere udskrift splice danner medmindre sonder er mere specifikt designet (dvs., enkelt exons). Selv om vi har testet sonder så lille som 200 nucleotider med rimelig succes, mindre sonder har tendens til at være mindre effektiv og kan være mindre specifik. Klart, denne protokol er ikke egnet til påvisning af små introns, exons, eller forarbejdede MicroRNA.
Selv om denne fremgangsmåde bruger en enzymatisk skridt til at øge styrken af signaler, synes signal intensitet at være proportional med target genekspression i en forholdsvis lineær og bred vifte af udtryk niveauer. Ved højere forstørrelse, signalet er set som puncta eller pletter i celler og væv. For relativt sjældne udskrifter er kun et par små puncta set. Som udskrift overflod stiger, vokser disse i antal og størrelse. Som med enkelt molekyle fisk (smFISH), enkelt lille puncta kan også svare til enkelt RNA’er og bør også umiddelbart kvantificeres ved hjælp af billedbehandling og informatik software. Sammenligninger af offentliggjorte billeder opnået med smFISH med billeder, som vi har kurateret for de samme mål foreslår at samlet, følsomhed og løsning af de to metoder er forholdsvis ens, selv om dette bør testes af strengere sammenligninger. I betragtning af den meget højere udgift af smFISH, bør metoden her give lignende resultater på en brøkdel af prisen. Hvis målet er at opdage små udskrifter eller adskilte dele af udskrifter, anbefaler vi dog smFISH.
På grund af den mindre størrelse af nogle fisk sonder, kan denne metode også være bedre på gennemtrængende væv, der er store eller har betydelige hindringer. Vores brug af højere vaskemiddel niveauer og væv fiksering og permeabilization tweaks synes imidlertid at have løst dette problem. Endelig, selvom udviklet til Drosophila væv, de høje vaskemiddel buffere beskrevet her for dissekeret væv bør også arbejde for Drosophila embryoner som de fleste andre organismer og væv.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering støtte til dette projekt blev leveret af et tilskud til HMK af den canadiske institutter for sundhedsforskning (Giv MOPPE 133473).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |