Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo’s of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.
In onze inspanningen om de patronen van meningsuiting en subcellular localisatie van Drosophila RNAs op basis van de genoom-brede en in een verscheidenheid van weefsels, hebben we talloze aanpassingen en verbeteringen aan onze oorspronkelijke TL in situ protocol van hybridisatie (FISH). Ter vergemakkelijking van doorvoer en kosteneffectiviteit, zijn alle stappen, van sonde generatie op signaal detectie, uitgevoerd met behulp van de exon 96-wells microtiterplaat platen. Digoxygenin (DIG)-gelabelde antisense RNA sondes worden geproduceerd met behulp van cDNA klonen of genomic DNA als sjablonen. Na weefsel fixatie en permeabilization, sondes worden gekruist om afschriften van belang en vervolgens gevonden met behulp van een opeenvolging van anti-DIG antilichaam geconjugeerd met biotine, daar geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) en fluorescently geconjugeerd tyramide, die in het bijzijn van HRP, produceert een zeer reactief intermediair dat zich bindt aan elektron dichte regio’s van de onmiddellijk aangrenzende eiwitten. Versterking en localisatie volgt produceren een robuust en sterk gelokaliseerde signaal dat beide transcript van cellulaire en subcellular localisatie wordt vergemakkelijkt. De protocollen die zijn geoptimaliseerd voor de productie van zeer specifieke signalen in een verscheidenheid van weefsels en ontwikkelingsstadia. Verwijzingen zijn ook voorzien van extra variaties waarmee de simultane detectie van meerdere afschriften, of afschriften en eiwitten, op hetzelfde moment.
Nieuwe genoom-brede RNA detectiemethoden zoals RNA-seq hebben onze kennis van wanneer en waar de genen worden uitgedrukt, en op welke niveaus1sterk uitgebreid. Deze bieden echter relatief lage temporele en ruimtelijke resolutie. RNA in situ hybridisatie kunt de ruimtelijke spreiding van afschriften worden visueel waargenomen in vaste weefsels, aldus onthullen de details van cellulaire en subcellular localisatie2. Gebruikt Fluorescente kruising in situ (vissen), kunt zelfs meer ruimtelijke resolutie als daarmee het gebruik van krachtige microscopie technieken, zoals confocale en lichte blad microscopie3. Fluorescente markeringen zoals DAPI kunnen ook worden gebruikt om vast te stellen subcellular relaties4. VIS vergemakkelijkt ook de observatie van meerdere RNAs en eiwitten gelijktijdig met duidelijke aanwijzingen van overlap op het subcellular niveau. Unieke reagentia en stappen die nodig zijn voor het labelen van dubbele kunnen worden gevonden in de volgende verwijzingen3,5.
De hier beschreven procedures gebruiken 96-wells microtiterplaat platen voor alle maatregelen, met inbegrip van cDNA sjabloon productie (PCR van de kolonie), RNA sonde productie (met T7, T3 of SP6 polymerase-afhankelijke run-off transcriptie), in situ hybridisatie, en fluorescent signaal ontwikkeling. Voldoende aantal embryo’s of weefsels worden toegevoegd aan elk van de 96-wells-plaat om evaluatie van de consistentie en veranderlijkheid. Nou dan ontvangt elk een verschillende sonde. Na signaal ontwikkeling, zijn embryo’s of weefsels van elk putje gekleed op individuele Microscoop dia’s voor microscopische analyse.
Het gebruik van tyramide signaal versterking (TSA) voor de detectie van de sonde produceert robuuste signalen met uitzonderlijke subcellular resolutie 5,,6,,7,8. De subcellular localisatie van RNAs is een belangrijke regelgevende mechanisme 9 die verschijnt optreden bij vrijwel alle RNAs 4,10,11. Deze analyses hebben ook aangetoond dat veel afschriften die niet worden gedetecteerd door RNA-seq gemakkelijk worden gedetecteerd door vis 8. De aanpassing van RNA in situ hybridisatie aan 96-wells-platen kunt analyse van maximaal 96 genen van belang op een moment (meer als extra platen worden gebruikt), analyse van grote datasets mogelijk te maken. Door het snijden van de platen in kleinere delen, is de methode ook gemakkelijk aangepast aan een paar monsters. Het protocol geboden is geschikt voor analyse van RNA distributies in de meeste soorten weefsels. Hoewel niet wordt weergegeven, is het aan te passen aan niet –Drosophila weefsels zo goed.
tabel 7: kruising oplossing. 3. drosophila fokken en embryo, larve en volwassen weefsel collectie. Opmerking: voor zowel kleinschalige (flessen) en massa (dozen) fokken vliegen, standaard vliegen lab protocollen op maïsmeel gebaseerd voedsel bij 25 ° C. Houd goede volwassen en larvale dichtheid gebruiken en extra actieve gist poeder voor de menselijke voeding bieden oppervlakken. Collect embryo’s na standaardprotocollen. De hoofdstappen van het embryo worden geïllustreerd in Figuur 3. Opmerking: Na het spoelen devitillinized embryo’s in methanol, de vaste embryo’s kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende maximaal één jaar. Embryo permeabilization en na fixatie worden uitgevoerd op dag 1 van het protocol van de vis. Voorbereiden vers 40% PFA stamoplossing. Voorbereiden een versgemaakte stockoplossing van 40% paraformaldehyde (PFA) door het mengen van 10 mL DEPC behandeld ddH 2 O 3.68 g PFA en 70 µL van 2N KOH in een 20 mL glas Scintillatie flesje met een klein roer bar. Let op: PFA is zeer giftig met potentiële acute en chronische gezondheidseffecten. MSDS (Veiligheidskaarten materiaal) te lezen en te gebruiken met goede bescherming voor de ogen, huid en luchtwegen. In een zuurkast, warmte en roer de flacon voor 3-5 min op een verwarmingsplaat bij 200 ° C tot de PFA is volledig opgelost. De stockoplossing PFA Haal van het vuur zodra de PFA wordt ontbonden (doen niet oververhit). De opgeloste 40% PFA stockoplossing op ijs gedurende 5 minuten afkoelen, en filteren met een 0,2 µm filter en 10 mL spuit. Derde instar larven (L3) of volwassen weefsel fixatie, blussen en permeabilization Opmerking: dit protocol moet worden afgewerkt in een dag. Het omvat weefsel dissectie, fixatie, blussen van endogene HRP, permeabilization en na fixatie. Voorbereiden fixing oplossingen (Fix-I en Fix-II) volgens tabel 8. Opmerking: pikrinezuur wordt gebruikt als een extra fixeerspray als weefsel heeft een fijne structuur dat moet worden behouden. Het is niet een goed fixatief als weefsel ultrastructuur moet worden bewaard voor elektronenmicroscopie (EM). Waarschuwing: pikrinezuur is onstabiel en heeft de mogelijkheid om te reageren met andere stoffen en ontplofbare verbindingen maken. Gebruik en sla volgens veiligheidsrichtlijnen. Plaats larven of volwassen vliegen in een plastic buis van 50 mL, met 10 mL koude 1 X PBS en 100 µL van Fix-ik oplossing. Chill op het ijs gedurende 2 minuten om larvale of volwassen vliegen motiliteit. Knippen uit het topje van een plastic tip van 1 mL maken een opening van 2-3 mm. Overdracht van 10-30 larven of volwassene vliegt met de tip 1 mL in een petrischaal (diameter 9 cm) met een ondiepe laag van 1 X PBS van de tube van 50 mL (stap 3.3.2). Het toevoegen van een beetje PBTT kan verminderen oppervlaktespanning. Zorgvuldig ontleden larvale (openen vanuit anterior en knijp weefsels van posterieure aan anterior) of volwassen weefsels van belang met een paar scherpe pincet onder een ontleden. Opmerking: Ongeveer 200-300 larven of volwassen testes kunnen worden ontleed en in één dag opgelost door ervaren personen. Overdracht ontleed weefsels met een 200 µL Pipet (met het puntje afgesneden maken een 2 mm diameter openen) in een tube 1,5 mL en winkel op ijs. Elke ronde van dissectie binnen 10-15 min voordat vooruit naar de volgende stap voltooien. Opmerking: Ga verder met extra rondes (binnen een venster van tijd van 2 h) zoals vereist voor het genereren van voldoende materiaal. Fix weefsels met 800 µL van Fix-ik oplossing voor 30 min op een bankje top mixer. Spoelen weefsels zodra met 800 µL 1 X PBTT en houden van buizen op ijs voor een maximum van 2,5 h. vanwege de 30 min beperken, dit moet batchgewijs worden uitgevoerd totdat voldoende weefsel is geïnd. Bundelen alle ontleed en vaste weefsels in een enkele 15 mL kunststof buis met gaas in het deksel (Zie Figuur 4 voor buis ontwerp). Gecombineerd overtollige vocht via de mazen in het deksel van de buis. Wassen van 3 X 5 minuten elk met 10 mL van de 1 X PBTT. Spoel tweemaal met 10 mL 1 X PBS afwasmiddel te verwijderen. Hiermee voorkomt u dat overtollige luchtbellen in de volgende stap. Opmerking: Als ontleed weefsels naar de bodem van de buis zinken, kunnen de stappen worden uitgevoerd in normale microtiterplaat platen of 0,5-1,5 mL microcentrifuge buizen (300-800 µL volume per buis). Quench endogene HRP activiteit met 5 mL 0,3% H 2 O 2 in PBS voor 15 min op RT. Herhaal nogmaals. Houd het deksel open tijdens deze stap zonder mengen. Spoel tweemaal met 10 mL 1 X PBTT. Wassen tweemaal voor 5 min met 10 mL van de 1 X PBTT. Permeabilize weefsels met 10 mL van 80% aceton (-20 ° C, vooraf gekoeld) op-20 ° C gedurende 10 minuten omkeren de buis tweemaal tijdens de incubatieperiode. Wassen tweemaal voor 10 min met 10 mL van de 1 X PBTT naar de weefsels hydrateren. Spoelen met 10 mL van een mengsel van 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisatie oplossing (1:1). negeren mix en vervangen met 10 ml hybridisatie. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C totdat het nodig is. Voor de beste resultaten, Sla geen monsters voor meer dan een week. component Fix ik (10 ml) Fix II (10 ml) 40% PFA voorraad 1 ml 1 ml PBTT 8,99 ml 9 ml pikrinezuur oplossing 10 μl –
tabel 8: vaststelling van oplossingen voor weefsels. 4. in situ hybridisatie Opmerking: dit gedeelte van het protocol vereist een minimum van 2 dagen, met de bereiding van de monsters, pre kruising en kruising nemen plaats op dag 1 en sonde detectie op dag 2. Als het aantal monsters is relatief hoog, als niet vertrouwd zijn met het protocol, of een volledige dag niet mogelijk is, moet het protocol worden uitgevoerd in 3 dagen met de stappen van de sonde opsporen en signaal versterking in 2 dagen verdeeld. Grote aantallen embryo’s of ontleed weefselsteekproeven mogelijk ook extra dagen te verwerken. Voor ontleed weefselsteekproeven, vervangen door 1 X PBT 1 X PBTT in alle stappen, tenzij anders aangegeven. Het extra wasmiddel is vereist voor de penetratie van vele larvale en volwassen weefsel, zoals de hersenen en de testis. Hoewel nog niet getest, 1 kan X PBTT ook worden gebruikt voor embryo’s. Gebruik 100 µL per putje voor 96-wells-platen en 800 µL voor 1,5 mL tubes. Pre kruising en kruising Opmerking: stappen 4.1.1-4.1.6.2 zijn voor embryo in situ hybridisatie. Voor larvale of volwassen weefsel in situ kruisingen, moet u deze stappen overslaan. Verwijderen 2 mL van vaste embryo’s (opgeslagen in methanol bij-20 ° C) om een nieuwe tube van 15 mL. Wassen embryo’s tweemaal voor 7 min met 10 mL van methanol in elke wasbeurt. WAsh embryo’s voor 7 min met 10 mL van het mengsel van methanol en 1 X PBTT (1:1). Wassen van embryo’s tweemaal voor 7 min met 10 mL van de 1 X PBTT te rehydrateren. Voor embryo permeabilization, bereid een tussenliggende proteïnase K-oplossing (40 µL/mL) door verdunning van de 1:500 van de stockoplossing (20 mg/mL). Opslag bij -20 ° C. Maak een werkoplossing proteïnase K door verdunning van de tussenliggende proteïnase K-oplossing 1/15 in 1 X PBTT voor een eindconcentratie van de werken van 2.667 mg/mL. Permeabilize embryo’s met 10 mL van de werkoplossing proteïnase K (gebruik minder voor kleinere aantallen embryo’s). Incubeer de buis op RT voor 13 min. omkeren de tube zachtjes 4 keer tijdens de incubatie. Incubeer de monsters in de oplossing van het proteïnase K op ijs voor 1 h zonder mengen. Opmerking: Deze relatief lange incubatie met verdunde proteïnase K zorgt voor reproducibly uniforme permeabilization en latere kleuring. Terwijl embryo’s permeabilize, maak een 2 mg/mL glycine oplossing uit 10 X voorraad (20 mg/mL) in 1 X PBTT voor een totaal volume van 30 mL. Verwijderen proteïnase K-oplossing, met 10 mL van oplossing (2 mg/mL) van de glycine afspoelen en wassen tweemaal voor elke 2 min. Spoel driemaal met 10 mL 1 X PBTT te verwijderen van de glycine. Na fixatie van embryo’s. 10 mL 4% bereiden PFA (1 mL van 40% PFA in 9 mL PBTT, gefilterd door 0,45 µm filter). Broeden de monsters in 4% PFA voor 20 min. Wash 3 X voor elke 2 min met PBTT. Te bereiden gedenatureerde hybridisatie oplossing, kook de kruising oplossing voor 5 min. Gebruik voor een volledige 96-wells-plaat, de drie tubes van 12 mL. Cool op ijs onmiddellijk voor 5 min. Rinse embryo’s keer met 10 mL 1 X PBTT: kruising oplossing (1:1). Spoel tweemaal met 5 mL van de oplossing van de kruising. Aliquot ~ 20 µL per putje van geregeld embryo’s (30-40 embryo’s) of vaste weefsels in een 96-Wells PCR plaat op ijs. Hybridisatie oplossing verwijderen uit weefsels of embryo’s met behulp van een 8-kanaals spruitstuk precisiepipet ( Figuur 1 / video). Opmerking: De spruitstuk pipet heeft een ‘ stoppen ’ die voorkomt dat de tips gaan naar de onderkant van de putten en verwijderen van monster. Voor experimenten met behulp van weefsels die zweven, verwijderen vloeistof zorgvuldig met een pipet 100 µL van bovenaf. Voeg 100 µL van de gedenatureerde hybridisatie oplossing aan elk putje. Vooraf het vermengen van embryo’s voor een minimum van 2,5-3 h bij 56 ° C met behulp van een droge bad Verwarming eenheid bevattende metalen bolletjes (Zie materialen en Figuur 1). Denatureren 100 µL van de voorbereide sonde in een 96-Wells PCR plaat met behulp van een thermocycler voor 5 min op 80 ° C. onmiddellijk koel op ijs gedurende 5 minuten. Pre kruising oplossing verwijderen van embryo’s of weefsels. Gedenatureerde gen-specifieke sondes aan elk monster, dek af met tape afdichten en kruisen op 56 ° C gedurende 16-18 h, O/N, onder metalen kralen in droge bad Verwarming apparaat toevoegen 5. Sonde detectie vooraf de oplossingen in tabel 9 in de eenheid van de verwarming 56 ° C warm. Sondes uit de plaat verwijderen. Opmerking: Sondes opnieuw kunnen worden gebruikt tussen 2 – 3 keer als opgeslagen bij-80 ° C (nooit winkel een RNA samples in-20 ° C). Na de kruising, de dubbele gestrande RNA is stabieler dan enkele streng RNA, en is minder gevoelig voor aantasting veroorzaakt door RNase besmetting. Als met behulp van een een multi goed vacuüm filtratie-plaatsysteem voor weefsels, een collectie plaat onder de plaat van de filter voor het verzamelen van de sondes (zie video voor details van de vergadering) moet worden opgenomen. Gehybridiseerde weefsels zal moeten worden overgedragen van de regelmatige 96-wells microtiterplaat plaat gebruikt voor hybridisatie aan één met 1,2 µm porie grootte PVDF membranen op de bodem van elk putje. stap vooraf opgewarmd oplossing (56 ° C) tijd Volume per putje 1 Kruising oplossing: PBTT (3:1) 15 min 100 µl 2 Hybridisatie oplossing: PBTT (3:1) 15 min 100 µl 3 Hybridisatie oplossing: PBTT (1:1) 15 min 100 µl 4 Hybridisatie oplossing: PBTT (1:3) 15 min 100 µl 5 PBTT 3 wast 5 min 100 µl tabel 9: het wassen van sondes na hybridisatie. als normale platen, wassen monsters per tabel 9 in een verwarming unit van 56 ° C. als met behulp van het spruitstuk vacuümsysteem, gebruiken verwarmde oplossingen met vacuümsysteem op Bank en oplossingen onmiddellijk uit hieronder door vaccuum verwijderen. Na de 3e wash met 1 X PBTT, de normale plaat kan worden verwijderd uit de verwarming apparaat Voorbereiden antilichamen. Bereiden 11 mL primair antilichaam-oplossing (2,5 µg/mL) uit voorraad (1 mg/mL) door verder verdunnen van biotine-geconjugeerde muis monoklonaal anti-DIG antilichaam (Zie materiële lijst) in PBTTB (1:400). Als de verwerking minder monsters, dienovereenkomstig aan te passen volumes. Bereiden 11 mL streptavidine-HRP-oplossing (1 µg/mL) uit voorraad (1 mg/mL) door verder verdunnen van 1:1000 daar-HRP conjugaat (Zie materiële lijst) in PBTTB. Als u minder monsters, dienovereenkomstig aan te passen volumes. Blokkeren van embryo’s of weefsels met PBTTB (1% magere melk in 1 X PBTT) gedurende 20 minuten op een bankje top mixer op RT. Opmerking: Filter PBTTB met filtreerpapier (grade 3, 6 µm) alvorens het te gebruiken op filter van de 96-wells-platen om verstopping van de filters. In plaats van PBTB, PBTTB (PBTB met extra 0,3% Triton-X-100) wordt gebruikt voor alle weefsels tijdens het protocol. Incubate embryo’s of weefsels in antilichaam oplossing (100 µL per putje) voor 2 h op Bank-top monster mixer. Spoel tweemaal met 1 x PBTTB. Wassen van 3 X 5 minuten en 5 X voor 10 min met PBTTB. Incubeer embryo’s of weefsels met daar-HRP-oplossing (100 µL per putje) voor 1,5 h met gebruikmaking van een bank-top monster mixer. Wassen 2 X voor 5 min met PBTTB. Monsters in het donker te houden vanaf dit punt op. Opmerking: tijdens alle antilichaam wast, als weefsel verloren als gevolg van de dekking die geproduceerd door de melk gaat is, probeer wassen zonder de melk (PBTT in plaats van PBTTB). Bereid een DAPI oplossing door verdunnen 100 X DAPI in PBTTB (1:100). Incubate embryo’s of weefsels met DAPI oplossing (100 µL per putje) gedurende 15 minuten op een bank-top monster mixer. Wassen van 4 X voor 10 min met PBTT. Opslaan van de 96-wells-plaat met steekproeven O/N bij 4 ° C of ga naar de volgende stap. Opmerking: De procedure kan hier worden gepauzeerd. 6. Opsporing van antilichamen met behulp van tyramide (Zie Figuur 5) Opmerking: hier zelfgemaakte cyanine 3-geconjugeerde tyramide werd gebruikt, die is opgesteld volgens het protocol beschreven 12 . Als vele experimenten uitvoeren of het testen van vele monsters, dit een aanzienlijke hoeveelheid geld bespaart en effectief met commerciële reagentia (uit ervaring vergeleken is). Voor minder experimenten en voorbeelden, commercieel verkrijgbare cyanine 3-tyramide kan worden gebruikt (Zie materiaal). Wash monster platen 3 X voor 5 min met 1 X PBTT. Voorbereiden tyramide activering buffer (activering buffer) met 0.006% van H 2 O 2 in PBTT (verdund 30% (w/w) H 2 O 2 voorraad 1:5000). spoel de platen met de activering buffer. Voorbereiden cyanine 3-tyramide oplossing door verdunning van het in activering buffer in een tube van 15 mL. Voor embryo’s, gebruiken 1:80 verdunning (137 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Gebruik voor larvale weefsels, 1:150 verdunning (73 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Voor volwassen testes, gebruikt u 1:200 verdunning (55 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Voor volwassen eierstokken, gebruiken 1:300 verdunning (36 µL van cyanine 3-tyramide in 11 mL activering buffer). Broeden van monsters met cyanine 3-tyramide oplossing voor 2 h op Bank-top monster mixer. Viermaal spoelen met PBTT. Wassen van 6 X voor 10 min met PBTT. Wassen 3 X voor 5 min met PBS te verwijderen van het wasmiddel. Toevoegen 150 µL per putje van anti-fade montage media. Houd de monsters O/N bij 4 ° C om weefsels of embryo’s te zinken naar de bodem van de buis. Monsters op Microscoop dia’s (onder de ontrafeling van ruimte voor weefsels) monteren en dek af met een dekglaasje aan. Zegel van de randen van het dekglaasje aan met doorzichtige nagellak. Beeld met behulp van een fluorescentie Microscoop. Opmerking: analyseren negatieve controle eerst krijgt u een indruk van ‘ niet-specifieke ’ achtergrond.
Het beschreven protocol biedt een zeer reproduceerbaar, gevoelige en economische methode voor de detectie van de meeste RNAs in vaste Drosophila embryo’s of weefsels. Hoewel iets ingewikkelder dan de meer traditioneel alkalische fosfatase methode voor de detectie van de sonde gebruikt, de resolutie verkregen door vis is veel groter en de gevoeligheid is vergelijkbare of betere 7,8. Met behulp van gehele of gedeeltelijke microtiterplaat platen, kunnen de protocollen worden gebruikt voor grootschalige of beperkte analyses van genen van belang. Opgemerkt moet worden dat de sondes gegenereerd kunnen alle gedetecteerd of meerdere transcript splice vormt tenzij sondes zijn meer specifiek ontworpen (dat wil zeggen, één exons). Hoewel we hebben getest sondes zo klein als 200 nucleotiden met redelijk succes, kleinere sondes zijn meestal minder effectief en kunnen wel minder specifiek zijn. Duidelijk, is dit protocol is niet geschikt voor het opsporen van kleine introns, exons, of microRNAs verwerkt.
Hoewel deze aanpak een enzymatische stap gebruikt voor het stimuleren van de sterkte van de signalen, lijkt signaalsterkte te zijn in verhouding tot doel genexpressie in een relatief lineaire en brede waaier van expressie niveaus. Op hogere vergroting, het signaal wordt gezien als puncta of spikkels binnen cellen en weefsels. Alleen een paar kleine puncta zijn relatief zeldzaam afschriften beschouwd. Zoals transcript overvloed toeneemt, groeien deze in aantal en de grootte. Zoals met enkel molecuul vis (smFISH), enkele kleine puncta mogelijk ook overeen met één RNAs en moet ook worden gemakkelijk gekwantificeerd aan de hand beeldvorming en informatica software. Vergelijkingen van gepubliceerde beelden verkregen met behulp van smFISH met beelden die we hebben samengesteld voor dezelfde doelstellingen suggereren dat de overall, de gevoeligheid en de resolutie van de twee methoden relatief vergelijkbaar, zijn maar dit moet worden getest door strengere vergelijkingen. Gezien de veel hogere kosten van smFISH, moet de methode die hier geven vergelijkbare resultaten tegen een fractie van de kosten. Maar als het doel is om het detecteren van kleine afschriften of afzonderlijke delen van afschriften, wordt smFISH aangeraden.
Vanwege de kleinere omvang van sommige vis sondes, kan deze methode ook worden beter op indringende weefsels die zijn grote of belangrijke belemmeringen. Echter, het gebruik van hogere niveaus van wasmiddel en weefsel fixatie en permeabilization tweaks lijken te hebben dit probleem opgelost. Tot slot, hoewel ontwikkeld voor Drosophila weefsels, de hoge wasmiddel buffers hier beschreven voor ontleed weefsels zou ook moeten werken voor Drosophila embryo’s, evenals de meeste andere organismen en weefsels.
The authors have nothing to disclose.
Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door een subsidie aan HMK door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen MOP 133473).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |