Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56281
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Den beskrevne RNA i situ hybridisering protokol giver mulighed for påvisning af RNA i hele Drosophila embryoner eller dissekeret væv. Brug 96-brønd mikrotiter plader og tyramide signal forstærkning, kan udskrifter blive opdaget på høj opløsning, følsomhed og overførselshastighed, og en forholdsvis lav pris.

Abstract

I vores bestræbelser på at fastlægge mønstre af udtryk og subcellulært lokalisering af Drosophila RNA'er på grundlag af genome-wide, og i en række forskellige væv, har vi udviklet mange ændringer og forbedringer til vores oprindelige fluorescerende in situ hybridisering (FISH) protokol. For at lette overførselshastighed og omkostninger effektivitet, udføres alle trin, fra sonden generation til signal detection, ved hjælp af exon 96-brønd mikrotiter plader. Digoxygenin (grave)-mærket antisensstoffer RNA-sonder er fremstillet ved hjælp af enten cDNA kloner eller genomisk DNA som skabeloner. Efter væv fiksering og permeabilization, sonder er hybridiseret at udskrifter af interesse og derefter blev fundet ved hjælp af en række anti-grave antistof konjugeret med biotin, streptavidin, konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) og fluorescently konjugeret tyramide, som i HRP, producerer en meget reaktive mellemprodukt, der binder til elektron tætte områder af umiddelbart tilstødende proteiner. Disse forstærkning og lokalisering trin producerer en robust og meget lokaliserede signal, der letter både cellulært og subcellulært udskrift lokalisering. De protokoller findes er blevet optimeret til at producere meget specifikke signaler i en række væv og udviklingsstadier. Referencer er også fastsat yderligere variationer, der giver mulighed for samtidige påvisning af flere udskrifter, eller udskrifter og proteiner, på samme tid.

Introduction

Nye genome-wide RNA påvisningsmetoder såsom RNA-seq har stærkt udvidet vores viden om hvor og Hvornår generne udtrykkes, og på hvad niveauer1. Men disse giver relativt dårlig tidsmæssige og rumlige opløsning. RNA i situ hybridisering gør det muligt for den geografiske fordeling af udskrifter skal overholdes visuelt i faste væv, dermed afsløre detaljer af cellulært og subcellulært lokalisering2. Brug af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) giver endnu flere rumlige opløsning som det tillader brug af magtfulde mikroskopi-teknikker, såsom Konfokal og lys ark mikroskopi3. Fluorescerende markører som DAPI kan også bruges til at etablere subcellulært relationer4. FISK letter også observation af flere RNA'er og proteiner samtidig med klare angivelser af overlapning på subcellulært niveau. Unikke reagenser og trin, der kræves for dobbelt-mærkning kan findes i følgende referencer3,5.

De procedurer, der beskrives her udnytte 96-brønd mikrotiter plader til alle foranstaltninger, herunder cDNA skabelon produktion (koloni PCR), RNA sonde produktion (transskription T7, T3 eller SP6 polymerase-afhængige afstrømning), in situ hybridisering, og fluorescerende signal udvikling. Tilstrækkeligt antal embryoner eller væv er tilføjet til hver godt af 96-brønd pladen til at muliggøre evaluering af konsistens og variabilitet. Hver modtager så en anden sonde. Efter signal udvikling klædt embryoner eller væv fra hver godt på individuelle objektglas til mikroskopisk analyse.

Brug af tyramide signal forstærkning (TSA) til registrering af sonden producerer robuste signaler med ekstraordinære subcellulært opløsning 5,6,7,8. Subcellulært lokaliseringen af RNA'er er en vigtig regulerende mekanisme 9 , der synes at forekomme med stort set alle RNA'er 4,10,11. Disse analyser har også vist, at mange udskrifter, der ikke er registreret af RNA-seq opdages let ved fisk 8. Tilpasning af RNA i situ hybridisering til 96-brønd plader giver mulighed for analyse af op til 96 gener af interesse på et tidspunkt (mere, hvis flere plader anvendes), muliggjort analyse af store datasæt. Ved at skære pladerne i mindre sektioner, er metoden også let tilpasses til blot et par prøver. Protokollen i henhold er velegnet til analyse af RNA udlodninger i de fleste typer af væv. Selv om ikke vist, er det kan tilpasses til ikke -Drosophila væv så godt.

Protocol

1. PCR-amplifikation af cDNA skabeloner fra plasmider

Bemærk: bruge høj kvalitet plasmid eller PCR-genererede DNA skabeloner til RNA sonde syntese. Drosophila gen samling (DGC) biblioteker genereret af Berkeley Drosophila genom projekt giver dækning af de fleste kodning gener fundet i Drosophila genom (se tabel 1a). Disse også tillade brug af universal primere til forstærkningen af nogen cDNA Indsæt. Disse PCR klarlægger udføres på plasmidet udpegede nationale myndigheder i lysates af plasmid-holdige bakteriel kulturer. DNA-produkter bruges derefter som skabeloner til in vitro- transskription til at generere antisense RNA-sonder (se tabel 1b).

  1. Design primere til at forstærke en specifik exon region i et gen af interesse ved PCR (fx. fra genomisk DNA), helst med T7 polymerase anerkendelse websted på antisense slutningen.
  2. For eksperimenter med færre end 96 prøver, afbrød unødvendige dele af 96-brønd plader. Dække plader med forsegling tape (Se materialer) for alle inkubationer og opbevaring. Hvis microcentrifuge rør bruges, justerer mængder tilsvarende.
    NOTE: 96-brønd plader tillade brug af multikanals pipetter for øget overførselshastighed, samt mindre enheder for besparelse.
tabel 1a

vektor		 Antibiotika
arbejder koncentration 1:1000
Primere		 RNA polymerase
for
antisensstoffer		 RNA polymerase.
for
sans
pFLC-jeg forstærker pBst_SK (-) _F/R T3 T7
pBSt(-) Amp pBSt_SK(-) T7 T3
pOT2 Chlor pOT2_F/R SP6 T7
pOTB7 Chlor pOT2_F/R T7 SP6
Tabel 1b
Primer sekvens
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Vend 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

tabel 1: A) General DGC klon information til forstærke cDNA indsætter i plasmider. B) sekvenser af Universal primere for DGC plasmider.

  1. vokse 250 µL plasmid-holdige bakteriekulturen i 96-og kultur plader ved at tilføje 240 µL af LB media pr. brønd med korrekt antibiotika udvælgelse (1:1000 fortynding af en 1000 X antibiotika bestand) og 10 µL af oprindelige plasmid-holdige bakterier (fra en glycerol bestand). Tætning med forseglingstape.
  2. Incubate ved omrystning ved 215 rpm ved 37 ° C natten over (O/N).
    Bemærk: Lave en ny kopi af bakteriel glycerol cDNA plasmid klon materiel til at erstatte oprindelige. Ikke genfryses oprindelige bakteriel materiel, da dette kan dræbe bakterier.
  3. Til at producere PCR skabeloner, fortyndet 10 µL af O/N bakteriekulturen i 90 µL autoklaveres ddH 2 O i hvert hul i en ny 96-brønd PCR plade. Denaturere DNA i 5 min. ved 95 ° C i thermocycler. Pladen anbringes umiddelbart på køl i mindst 5 min.
  4. Forberede PCR reaktioner ved hjælp af passende universel primere ifølge tabel 2.
< /TR >
reagenser 50 μl prøve reaktion 96 godt mix
(112 x reaktion)		 endelige koncentration
2 X PCR polymerase Mix 25 μl 2800 μl 1 X
Primer_For (25 pmol/µl) 0,5 μl 5 6 μl 0,25 pmol/µl
Primer_Rev (25 pmol/µl) 0,5 μl 56 μl 0,25 pmol/µl
ddH2O 22 μl 2464 μl
samlede 48 μl 5376 μl

tabel 2: PCR Master Mix.

  1. ved hjælp af en pipette, alikvot 48 µL PCR master mix i hver brønd af et nye 96-brønd PCR plade. Tilføj 2 µL af hver denatureret plasmid DNA skabelon pr. brønd.
    Bemærk: Brug mellem 1 pikogram (pg) til 1 nanogram (ng) af plasmid DNA. Overdreven DNA skabelon reducerer PCR udbytte og specificitet.
  2. Program 96-brønd PCR maskine ifølge tabel 3 og udføre forstærkningen.
    Bemærk: Forlængelse tid ved 72° C bestemmes af størrelsen af PCR produkt (45 s for ≤ 2.0 kb, 1,5 min for ≤ 3.0 kb, 3 min for ≤ 4.0 kb og 3,5 min. til 4.0-5.0 kb). Den udgloedning temperatur (Tm) bestemmes rækkefølgen af primere. Når en primer er lig med eller længere end 20 nt, Tm beregnes som:
    Tm (° C) = (4 X antallet af CG) + (2 X antallet af AT) -4.
< td række span = "3" > 30 cykler
trin temperatur tid cyklusser
Første denaturering 95 ° C 3 min. 1 cyklus
forstærkning
denaturering, udglødning og udvidelse		 95 ° C 45 sek
54-58 ° C 45 sek
72 ° C 45 sek-3,5 min
Endelige udvidelse 72 ° C 7 min. 1 cyklus
Opbevaring 4 ° C hold

tabel 3: anbefalet PCR Program.

  1. PCR produkt nedbør med Ethanol (EtOH) og natrium acetat (NaOAC) (se tabel 4).
    Bemærk: Hvis PCR reaktion volumen er mindre end 50 µL, fyld til 50 µL med ddH 2 O.
    1. Udfældes DNA, blande komponenterne fra tabel 4 og store prøver O/N ved-20 ° C eller for 30 min på-80 °C.Centrifuge 96 brønde plade til 45-60 min. ved 2.250 x g på 4 ° C. Brug en 8-kanal mangfoldige pipette til carefully Fjern supernatanten. Vask en gang med 160 µL koldt 70% EtOH (RNase-fri) i 30 min på 2.250 x g ved 4 ° C.
      Bemærk: De udfældede DNA kan ses i bunden af brønde. Kortere PCR produkter kræver længere centrifugations.
    2. Vendes forsigtigt 96-brønd pladen på et stykke køkkenrulle til at fjerne de sidste dråber af flydende i hver brønd (så meget som muligt). Luft tørre DNA pellet i 1 time ved stuetemperatur (RT). Resuspend udfældet DNA i 25 µL RNase gratis vand.
      Bemærk: 1 h luften tør vil tillade alle spor af EtOH til at fordampe. Dog bør en meget lille mængde væske (ca. 1 µL) forblive i hver brønd at forhindre DNA toerstoffet fra helt tørring. Bruge 25 µL til en 50 µL PCR reaktionen. Brug ikke DEPC behandlet vand på dette stadium for at undgå interferens med in vitro- transskription i følgende trin.
komponent volumen del
PCR 50 μl
100% ethanol 125 μl 2,5 X vol. af PCR
3 M NaOAc (pH = 5.2, RNase gratis) 5 µl 10% af vol. af PCR
samlede 180 μl

tabel 4: eksempel på en 50 µL PCR reaktionen.

  1. kontrollere størrelse og udbytte af PCR-produkter ved at køre 5 µL af den resuspenderede DNA løsning på en 1%-agarosegel i 1 X TAE buffer.
    Bemærk: Ialt 250-500 ng af DNA skabelon er nødvendig for 15 µL i vitro transskription reaktion. Prøver med højere udbytter kan fortyndes yderligere. RNA udbytte afhænger også af den sekvens og længden af DNA-template. Ifølge den generelle vejledning for grave-RNA mærkning med T7 RNA-polymerase, ca. 10 µg af grave-mærket RNA er fremstillet af 1 µg lineariseret skabelon.

2. In vitro transskription til at generere antisense sonder.

Bemærk: det er afgørende at arbejde i et miljø, RNase-fri. Skal alle reagenser og lab-ware RNase gratis (såsom certificeret DNase/RNase gratis plast-ware).

komponent Stock koncentration bind Endelig koncentration
ATP 100 mM 7 μl 10 mM
CTP 100 mM 7 μl 10 mM
GTP 100 mM 7 & # 956; l 10 mM
UTP 100 mM 4,5 μl 6.5 mM
Grave-11-UTP 10 mM 25 μl 3,5 mM
RNase gratis vand < /td > 19,5 μl
samlede 70 μl

tabel 5: grave-NTP Mix forberedelse.

< tabel Border = "1" fo:keep-together.within-side = "1" fo:keep-med-next.within-side = "altid" > komponent 15 µl reaktion 96 godt mix
(112 x reaktion) Endelige koncentreret 5 X transskription Buffer 3.00 μl 3.00 μl 1 x grave-NTP mix (10 mM) 0,75 μl 0,75 μl 0,5 mM RNase hæmmer 0,25 μl 0,25 μl 0,67 U / μl RNA polymerase (T7 eller T3 eller SP6) 2.00 μl 2,00 μl 2,67 U / μl RNase gratis vand 1,50 μl 1,50 μl Samlede 7,50 μl 7,50 μl

tabel 6:2 X transskription Master Mix.

  1. Forbered grave-NTP mix pr. tabel 5.
    Bemærk: For at undgå fejl, altid justere pladen A1 i øverste venstre hjørne af pladen findes.
  2. Tilføj komponenter beskrevet i tabel 6 i hver brønd i en ny 96-brønd PCR plade (sonde plade). Tilføje 7,5 µL PCR produkt (DNA skabelon) til hver svarer godt, ved hjælp af en multikanalpipette. Dække pladen med forseglingstape.
    Bemærk: Den optimale mængde af PCR produkt tilsat pr transskription reaktion bør være mellem 0,5 og 1 µg. Hvis bands på gelen er betydeligt svagere eller mere intens, kan mængden af DNA føjet til reaktionen justeres i overensstemmelse hermed. Det nøjagtige beløb er ikke kritisk.
  3. Ruger sonde pladen ved 37 ° C for 3,5-4 h. Mix 15 µL af syntetiserede sonde med 35 µL af DEPC behandlet ddH 2 O, 125 µL af 100% EtOH og 5 µL af 3 M NaOAC (pH = 5.2, RNase gratis). Opbevares ved-80 ° C i mindst 30 min. Centrifuge og vask som beskrevet i trin 1.10.2 og 1.10.3.
  4. Resuspend udfældet sonden i 25 µL af DEPC behandlet ddH 2 O. køre 5 µL på en 1%-agarosegel (køretid < 20 min) til at kontrollere integriteten og udbytte af sonde ( figur 2).
    Bemærk: Agarosegel skal foretages med DEPC behandlet ddH 2 O og TAE buffer. Gel elektroforese apparater bør tildeles til RNA arbejde kun. Længere gel kører tid ved lav hastighed kan føre til RNA nedbrydning under elektroforese.
  5. Bland de resterende 20 µL af den syntetiserede sonde med 100 µL hybridisering løsning (tabel 7) og opbevares ved-80 ° C indtil behov.
    Bemærk: Sonden koncentration kan fortyndes mere hvis bands er særdeles robust (Se figur 2 eksempler). Hybridisering løsning er meget effektiv til at forebygge RNase forurening. Straks tilføje hybridisering løsning til den resuspenderede sonde til at undgå RNA nedbrydning. Hybridisering løsning har at blive filtreret gennem en 0,2 µm filter. For vævsprøver, øge koncentrationen af vaskemiddel i hybridisering løsning ved at føje Triton-X-100 til en endelig koncentration på 0,3%.
komponent volumen endelige koncentration
DEPC behandlet ddH2O 11.85 ml 23,7%
20 X SSC 12,5 ml 25% (5 X)
Formamid 25 ml 50%
Heparin (50 mg/ml) 0,1 ml 0. 2% (0,1 mg/ml)
Laks sperm enkelt strandede DNA 0,5 ml 1,0%
Tween-20 0,05 ml 0,1%
Samlede 50.00 ml 100%
< p class = "jove_content"fo:keep-together.within-side ="1"> tabel 7: hybridisering løsning.

3. drosophila opdræt og embryo, larve og voksen væv samling.

Bemærk: For både lille skala (flasker) og masse (kasser) flyve opdræt, bruge standard flyve lab protokoller på cornmeal baseret mad på 25 ° C. holde ordentlig voksen og larver tæthed og give ekstra aktive gær pulver på mad overflader.

  1. Indsamle embryoner efter standardprotokoller. De vigtigste trin indsamlingsstedet er illustreret i figur 3.
    Bemærk: Efter skylning devitillinized embryoner i methanol, de faste embryoner kan opbevares ved-20 ° C i op til et år. Embryo permeabilization og efter fiksering udføres på dag 1 i protokollen om fisk.
  2. Forbered frisk 40% PFA stamopløsning.
    1. Forbered en frisklavet stamopløsning af 40% PARAFORMALDEHYD (PFA) ved at blande 10 mL af DEPC behandlet ddH 2 O 3.68 g PFA og 70 µL af 2N KOH i en 20 mL glas scintillation hætteglas indeholdende et lille rør bar
      Forsigtig: PFA er meget giftigt med potentielle akutte og kroniske sundhedsmæssige virkninger. Læs muskel-og Skeletbesvær (sikkerhedsdatablade) og brug med passende beskyttelse for øjne, hud og luftveje.
    2. i et stinkskab, varme og rør hætteglas til 3-5 min. på en varme plade ved 200 ° C, indtil PFA er helt opløst. Fjerne PFA stamopløsningen fra varmen, så snart PFA er opløst (ikke overophede).
    3. Cool den opløste 40% PFA stamopløsning i isbad i 5 min, og filtrere med en 0,2 µm filter og 10 mL sprøjte.
  3. Tredje instar larver (L3) eller voksen væv fiksering, dæmper og permeabilization
    Bemærk: denne protokol skal være færdig på én dag. Det omfatter væv dissektion, fiksering, quenching endogene HRP, permeabilization og efter fiksering.
    1. Forbered fastsættelse løsninger (Fix-jeg og Fix-II) ifølge tabel 8.
      Bemærk: picrinsyre syre anvendes som en supplerende fiksativ, når væv har en delikat struktur, der skal bevares. Det er ikke en god fiksativ når væv ultrastruktur skal bevares for elektronmikroskopi (EM).
      Advarsel: picrinsyre syre er ustabil og har evnen til at reagere med andre materialer og skabe eksplosive stoffer. Bruge og gemme efter sikkerhedsretningslinjer.
    2. Sted larver eller voksne fluer i et 50 mL plastikrør, som indeholder 10 mL koldt 1 X PBS og 100 µL af Fix-jeg løsning. Chill i isbad i 2 min til at reducere larve eller voksne flyve motilitet.
    3. Cut off spidsen af en 1 mL plastik tip til at oprette en 2-3 mm åbning. Overfør 10-30 larver eller voksen flyver med 1 mL spidsen ind i en petriskål (9 cm i diameter) med en lavvandet lag af 1 X PBS fra 50 mL tube (trin 3.3.2). Tilføje en smule af PBTT kan formindske overfladespænding. Omhyggeligt dissekere larve (åben fra forreste og klemme væv fra posteriort for forreste) eller voksen væv af interesse med et par skarpe pincet under et dissekere muligheder.
      Bemærk: Omkring 200-300 larver eller voksen testiklerne kan dissekeret og fast i en dag af erfarne personer.
    4. Overførsel dissekeret væv med en 200 µL pipette (med spidsen afskåret til at oprette en diameter på 2 mm åbning) i en 1,5 mL tube og opbevares på is. Fuldføre hver runde af dissektion indenfor 10-15 min før du går videre til næste trin.
      Bemærk: Fortsætte med yderligere runder (inden for en 2 h tidsvindue) som skal generere tilstrækkelig materiale.
    5. Fix væv med 800 µL af Fix-jeg løsning for 30 min på en bænk top mixer. Skyl væv når med 800 µL 1 X PBTT og holde rør på is i højst 2,5 h. på grund af 30 min begrænse, dette skal udføres batch-wise, indtil tilstrækkeligt væv er blevet indsamlet.
    6. Pool alle dissekeret og faste væv ind i en enkelt 15 mL plastik rør indeholdende mesh i låget (Se fig. 4 for tube design). Suges overskydende væske gennem trådnet i tube låget. Vask 3 X 5 min hver med 10 mL af 1 X PBTT. Skylles to gange med 10 mL 1 X PBS fjerne vaskemiddel. Dette forhindrer overskydende bobler i næste trin.
      Bemærk: Hvis dissekeret væv synker til bunden af røret, trin kan udføres i regelmæssig mikrotiter plader eller 0,5-1,5 mL microcentrifuge rør (300-800 µL volumen pr tube).
    7. Dæmpning endogene HRP aktivitet med 5 mL 0,3% H 2 O 2 i PBS for 15 min på RT. gentage endnu en gang. Hold låget åbent under dette trin uden blanding. Skylles to gange med 10 mL af 1 X PBTT. Vaskes to gange for 5 min med 10 mL af 1 X PBTT.
    8. Permeabilize væv med 10 mL 80% acetone (-20 ° C, før kølet) ved-20 ° C i 10 min. inverter røret to gange under inkubationstiden. Vaskes to gange i 10 min med 10 mL af 1 X PBTT at rehydrere væv.
    9. Skylles med 10 mL blanding af 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisering løsning (1:1). kassér mix og erstatte med 10 ml hybridisering løsning. Prøver kan opbevares ved-20 ° C indtil det skal bruges. For de bedste resultater, må ikke opbevares prøver for mere end en uge.
Fix jeg (10 ml) komponent Fix II (10 ml)
40% PFA stock 1 ml 1 ml
PBTT 8.99 ml 9 ml
picrinsyre syre løsning 10 μl -
< p class = "jove_conte NT"fo:keep-together.within-side ="1"> tabel 8: fastsættelse af løsninger for væv.

4. in situ hybridisering

Bemærk: denne del af protokollen kræver et minimum af 2 dage, med prøveforberedelsen, før hybridisering og hybridisering tager sted på dag 1 og sonde afsløring på dag 2. Hvis antallet af prøver er relativt høj, hvis bekendt med protokollen, eller en hel dag er ikke muligt, skal protokollen udføres i 3 dage med trin af sonden påvisning og signal forstærkning opdelt i 2 dage. Stort antal embryoner eller dissekeret vævsprøver kan også kræve ekstra dage til at behandle. Erstatte 1 X PBT med 1 X PBTT i alle trin, for dissekeret vævsprøver, medmindre andet er angivet. Den ekstra vaskemiddel er nødvendig for penetration af mange larve og voksen væv, såsom hjerne og testiklerne. Selv om ikke testet, 1 kan X PBTT også bruges til embryoner. Bruge 100 µL pr. brønd til 96-brønd plader og 800 µL til 1,5 mL rør.

  1. Pre hybridisering og hybridisering
    Bemærk: trin 4.1.1-4.1.6.2 er for embryo i situ hybridisering. Larve eller voksen væv i situ hybridizations, springe disse trin.
    1. Fjerne 2 mL af faste embryoner (gemt i methanol ved-20 ° C) til en ny 15 mL tube. Vask embryoner to gange i 7 min med 10 mL methanol i hver vask. WAsh embryoner i 7 min med 10 mL blanding af metanol og 1 X PBTT (1:1). Vaske embryoner to gange i 7 min med 10 mL af 1 X PBTT at rehydrere.
    2. For embryoner permeabilization, udarbejder en mellemliggende proteinase K løsning (40 µL/mL) ved fortynding 1: 500 fra stamopløsningen (20 mg/mL). Opbevares ved -20 ° C. gør en brugsopløsning på proteinase K ved at fortynde den mellemliggende proteinase K løsning 1/15 i 1 X PBTT for en endelig arbejder koncentration af 2.667 ug/mL.
    3. Permeabilize embryoner med 10 mL arbejder proteinase K løsning (Brug mindre for et mindre antal embryoner). Inkuber tube på RT for 13 min. blidt vende røret 4 gange under inkubation. Inkuber prøver i proteinase K løsning på køl i 1 time uden blanding.
      Bemærk: Denne forholdsvis lang inkubationstid med fortyndet proteinase K sikrer reproducerbar ensartet permeabilization og efterfølgende farvning.
    4. Mens embryoner permeabilize, gør en 2 mg/mL glycin løsning fra 10 X lager (20 mg/mL) i 1 X PBTT for en samlet maengde paa 30 mL.
    5. Fjern proteinase K løsning, skylles med 10 mL af glycin løsning (2 mg/mL) og vaskes to gange i 2 min. Skylles tre gange med 10 mL af 1 X PBTT til at fjerne glycin.
    6. Efter fiksering af embryoner.
      1. Forberede 10 mL 4% PFA (1 mL 40% PFA i 9 mL PBTT, filtreret gennem 0,45 µm filter).
      2. Ruger prøver i 4% PFA i 20 min. vask 3 X i 2 min. med PBTT.
      3. At forberede denatureret hybridisering opløsning, kog hybridisering løsning i 5 min. For en fuld 96-brønd plade, bruge tre rør af 12 mL. Cool på is straks i 5 min.
      4. Skylles embryoner engang med 10 mL af 1 X PBTT: hybridisering løsning (1:1). Skylles to gange med 5 mL af hybridisering løsning. Alikvot ~ 20 µL pr. brønd af afgjort embryoner (30-40 embryoner) eller fast væv i en 96-brønd PCR plade på is. Fjerne hybridisering løsning fra væv eller embryoner ved hjælp af en 8-kanal mangfoldige pipette ( figur 1 / video).
        Bemærk: Den mangfoldige pipette har en ‘ stoppe ’ der forhindrer tips fra går til bunden af brøndene og fjerne udsnit. For eksperimenter ved hjælp af væv, der flyder, fjerne væsken omhyggeligt med 100 µL pipette oppefra.
    7. Tilsættes 100 µL af opløsningen denatureret hybridisering til hver brønd. Pre krydse embryoner i minimum 2,5-3 h ved 56 ° C ved hjælp af en tør bad opvarmning enhed der indeholder metal perler (Se materialer og figur 1).
    8. Denaturere 100 µL af den forberedte sonden i en 96-brønd PCR plade ved hjælp af en thermocycler i 5 min på 80 ° C. straks cool i isbad i 5 min. Fjerne præ hybridisering løsning fra embryoner eller væv. Tilføje denatureret gen-specifikke sonder til hver prøve, dække med forseglingstape og krydse ved 56 ° C i 16-18 h O/N, under metal perler i tørre bad opvarmning unit.

5. Probe opdagelse

  1. pre varm løsninger i tabel 9 i 56 ° C varme enhed. Fjerne sonder fra pladen.
    Bemærk: Sonder kan genbruges mellem 2 - 3 gange hvis opbevares ved-80 ° C (aldrig store enhver RNA prøver i-20 ° C). Efter hybridisering, dobbelt strandede RNA er mere stabile end enkelt streng RNA, og er mindre modtagelige for nedbrydning forårsaget af RNase kontaminering.
    Hvis du bruger en en multi godt plade vakuum vandfiltrering system for væv, der skal medtages en indsamling plade under filterplade til at indsamle de sonder (Se video montage oplysninger). Hybridiserede væv bliver nødt til at blive overført fra den regelmæssige 96-brønd mikrotiter plade anvendes til hybridisering til én med 1,2 µm pore størrelse PVDF membraner i bunden af hver brønd.
< t r >
trin pre varmede løsning (56 ° C) tid Volumen pr. brønd
1 Hybridisering løsning: PBTT (3:1) 15 min. 100 μl
2 Hybridisering løsning: PBTT (3:1) 15 min. 100 μl
3 Hybridisering løsning: PBTT (1:1) 15 min. 100 μl
4 Hybridisering løsning: PBTT (1:3) 15 min. 100 μl
5 PBTT 3 vasker 5 min. 100 μl

tabel 9: vask sonder efter hybridisering.

  1. Hvis ved hjælp af normale plader, vask prøver pr. tabel 9 i en varmeenhed på 56 ° C. Hvis ved hjælp af vakuum mangfoldige system, bruger opvarmet løsninger med vakuum system på bænken og fjerne løsninger straks fra nedenfor ved vaccuum. Efter den 3. vask med 1 X PBTT, normal pladen kan fjernes fra varmen unit.
  2. Forbered antistoffer.
    1. Forberede 11 mL af primære antistof (2,5 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) ved fortynding biotin-konjugeret mus monoklonalt anti-grave antistof (Se materiale liste) i PBTTB (1: 400). Hvis behandling færre prøver, justerer mængder tilsvarende.
    2. Forberede 11 mL streptavidin-HRP opløsning (1 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) ved at fortynde 1:1000 streptavidin-HRP konjugat (Se materiale liste) i PBTTB. Hvis du bruger færre prøver, justerer mængder tilsvarende.
  3. Blokere embryoner eller væv med PBTTB (1% skummetmælk i 1 X PBTT) i 20 min. på en bænk top mixer på RT.
    Bemærk: Filteret PBTTB ved hjælp af filtrerpapir (lønklasse 3, 6 µm) før du bruger det på 96-brønd filter plader til at undgå tilstopning af filtre. I stedet for PBTB, PBTTB (PBTB med yderligere 0,3% Triton-X-100) bruges til alt væv under protokollen.
  4. Incubate embryoner eller væv i antistof løsning (100 µL/brønd) i 2 timer på bænken-top prøve mixer. Skylles to gange med 1 x PBTTB. Vask 3 X til 5 min og 5 X til 10 min med PBTTB. Inkuber embryoner eller væv med streptavidin-HRP løsning (100 µL/brønd) for 1,5 h ved hjælp af en bænk-top prøve mixer. Vask 2 X til 5 min med PBTTB. Holde prøver i mørke fra dette punkt.
    Bemærk: under alle antistof vasker, hvis væv er tabt på grund af opaciteten produceret af mælken, prøv vask uden mælk (PBTT i stedet for PBTTB).
  5. Forbered en DAPI løsning ved at fortynde 100 X DAPI i PBTTB (1: 100).
  6. Incubate embryoner eller væv med DAPI løsning (100 µL/brønd) for 15 min på en bænk-top prøve mixer. Vaske 4 X til 10 min med PBTT. Gemme 96-brønd pladen med prøverne O/N ved 4 ° C eller gå videre til næste trin.
    Bemærk: Proceduren kan blive afbrudt her.

6. Påvisning af antistof ved hjælp af tyramide (Se figur 5)

NOTE: her hjemmelavet cyanine 3-konjugeret tyramide blev brugt, som blev udarbejdet i henhold til protokollen, beskrevet i 12 . Hvis udfører mange eksperimenter eller teste mange prøver, det sparer en betydelig mængde af penge og er effektiv i forhold til kommercielle reagenser (af erfaring). Færre eksperimenter og eksempler, der kan bruges kommercielt tilgængelig cyanine 3-tyramide (Se materialer).

  1. Vask prøve plader 3 X i 5 min. med 1 X PBTT.
  2. Forbered tyramide aktivering buffer (aktivering buffer) indeholdt 0,006% H 2 O 2 i PBTT (fortyndet 30% (w/w) H 2 O-2 stock 1:5000).
    3. < lJeg > skyl plader med aktivering buffer.
  3. Forbered cyanine 3-tyramide løsning ved at fortynde det i aktivering buffer i en 15 mL tube.
    1. For embryoner, brug 1:80 fortynding (137 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). Larve væv, brug 1:150 fortynding (73 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). Voksen testiklerne, brug 1:200 fortynding (55 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer). For voksne æggestokke, bruge 1: 300 fortynding (36 µL af cyanine 3-tyramide i 11 mL af aktivering buffer).
  4. Inkuberes prøver med cyanine 3-tyramide løsning for 2 h på bænken-top prøve mixer. Skylles fire gange med PBTT. Vaske 6 X til 10 min med PBTT. Vask 3 X for 5 min med PBS fjerne vaskemidlet.
  5. Tilføj 150 µL/brønd af anti-fade montering medier. Holde prøver O/N ved 4 ° C tillade væv eller embryoner til at synke til bunden af røret. Montere prøver på objektglas (under dissekere muligheder for væv) og dække med coverslip. Forsegle kanterne af coverslip med gennemsigtig neglelak.
  6. Billedet ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
    Bemærk: analysere negativ kontrol først for at få en idé om ‘ uspecifikke ’ baggrund.

Representative Results

Figur 6 viser eksempler på resultater, der opnås ved hjælp af denne procedure. De top 3 paneler viser eksempler på tidlig Drosophila embryoner (figur 6, bedømmelseskomite A-C), de næste 3 paneler viser eksempler for sent Drosophila embryoner med signaler i forskellige væv (amnioserosa, muskler og centrale nervesystem, henholdsvis (figur 6, paneler D-F). Næste er eksempler fra 3rd instar larve væv (figur 6, bedømmelseskomite G-J). Paneler K og L Vis repræsentative billeder fra voksen gonaderne (æggestokkene og testiklerne, henholdsvis). Hundredvis af billeder er blevet uploadet og kommenteret i vores søgbare 'fluorescerende i situ bananfluen database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

Figure 1
Figur 1. Skitse af fluorescerende i situ hybridisering (FISH) protokol og nøglen udstyr. (A) PCR-amplifikation af cDNA. (B) In vitro transskription til at generere gen-specifikke antisense grave - mærket RNA-sonder i en 96-brønd plade (foto af pladen vist i b). (C) og (D): voksne (kvindelig: mandlige forholdet 2:1. 300-400 fluer/flaske) fluer er tilladt at parre i 3-4 dage. Embryoner fra en overnight samling på standard cornmeal mad ved 25 ° C er overført til et velventileret plastik kasse (1 L af cornmeal mad i en container, størrelse: 8 "X 8" X 3" LWH) eller til nye flasker at holde en ordentlig larve Tæthed. For væv samling, bør aktive gær pulver drysses på maden på 24, 48 timer efter æglægning (AEL). (E h): Fluorescerende i situ hybridisering eksperimenter udført mere end 3 på hinanden følgende dage. For embryoner eller væv, der ikke flyder, bruge en 96-brønd PCR plade som vist på foto b med 8-kanals indsugningsventil (fotografi c). Væv, der flyder, ligesom de fleste larve væv, bruge en filter-bund plade (fotografi i d) og fjerne væsken fra bunden med en manifold indsugningsventil ved hjælp af lavtryk (fotografi i e). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Bestemmelse af RNA sonde udbytte. Nyligt syntetiserede antisensstoffer RNA-sonder observeret på en 1%-agarosegel (5 µL/lane). Udbyttet kan kategoriseres (baseret på intensiteten af bandet) som lavt udbytte i baner 3 og 10, typisk udbytte i baner 1, 4, 5, 6 og 8, eller højtydende i baner 2, 7, 9, 11 og 12. For prøver med typisk udbytter, bruge 10-15 µL af sonden fortyndet i 100 µL af hybridisering løsning for hver i situ -forsøget. Fortynd prøver med 'høje udbytter' af sonde med yderligere hybridisering løsning ifølge bandet intensitet i forhold til en 'typisk sonde' intensitet. Formålet med at have nogenlunde lige endelige sonde koncentrationer i hver brønd. Pilen peger på et af 'RNA-sonder', den højere band på hver lane er den oprindelige DNA-skabelon. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Store skridt for en storstilet indsamlingsstedet og fiksering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Hjemmelavet rør til at fjerne væske fra larve eller flydende væv. Nogle larve og voksen væv flyde i løsning under fiksering. Dette enkle værktøj består af en nylon mesh indehaves af en 200 µL skåret spidsen, efterfulgt af en 1 mL tip som en adapter til at forbinde til en betjent sug. Væske kan fjernes sikkert uden at miste nogen væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Tyramide Signal forstærkning. (1) grave-mærket antisense RNA sonde hybridiserer med endogene følelse RNA. (2) Immuno-affinitet bindingen mellem biotin-konjugeret primære antistof og grave-UTP. (3) HRP konjugerede streptavidin bindes biotin. (4) HRP katalyserer cyanine 3-tyramide og hydrogenperoxid reaktion for at danne kortlivede cyanine 3-tyramide radikaler. (5) cyanine 3-tyramide radikaler binde sig til tyrosin rester på nærliggende proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Repræsentant i situ hybridisering billeder. Hvert panel viser et eksempel på en forskellige RNA (vist i Cyan) og cellekerner farves med DAPI (vist med rødt). (A-C) Eksempler på tidlig Drosophila embryoner. (D, F) Eksempler på sene Drosophila embryoner. (G-J) Eksempler på 3rd instar Drosophila larve væv (malphigian tubuli, midgut, spytkirtel og muskel henholdsvis). (K) voksen æggestokken. L voksen testis. Hvert panel viser navnet på det gen, der sonden hybridizing til. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den beskrevne protokol giver en meget reproducerbar, følsomme og økonomisk metode til påvisning af de fleste RNA'er i faste Drosophila embryoner eller væv. Selv om lidt mere kompliceret end mere traditionelt brugt alkalisk fosfatase metode til registrering af sonde, opløsning fremstillet ved fisk er langt større og følsomhed er sammenlignelige eller forbedret 7,8. Ved hjælp af hele eller delvise mikrotiter plader, kan protokollerne, der bruges til storstilet eller begrænset analyser af gener af interesse. Det skal bemærkes, at sonder genereret kan registrere alle eller flere udskrift splice danner medmindre sonder er mere specifikt designet (dvs., enkelt exons). Selv om vi har testet sonder så lille som 200 nucleotider med rimelig succes, mindre sonder har tendens til at være mindre effektiv og kan være mindre specifik. Klart, denne protokol er ikke egnet til påvisning af små introns, exons, eller forarbejdede MicroRNA.

Selv om denne fremgangsmåde bruger en enzymatisk skridt til at øge styrken af signaler, synes signal intensitet at være proportional med target genekspression i en forholdsvis lineær og bred vifte af udtryk niveauer. Ved højere forstørrelse, signalet er set som puncta eller pletter i celler og væv. For relativt sjældne udskrifter er kun et par små puncta set. Som udskrift overflod stiger, vokser disse i antal og størrelse. Som med enkelt molekyle fisk (smFISH), enkelt lille puncta kan også svare til enkelt RNA'er og bør også umiddelbart kvantificeres ved hjælp af billedbehandling og informatik software. Sammenligninger af offentliggjorte billeder opnået med smFISH med billeder, som vi har kurateret for de samme mål foreslår at samlet, følsomhed og løsning af de to metoder er forholdsvis ens, selv om dette bør testes af strengere sammenligninger. I betragtning af den meget højere udgift af smFISH, bør metoden her give lignende resultater på en brøkdel af prisen. Hvis målet er at opdage små udskrifter eller adskilte dele af udskrifter, anbefaler vi dog smFISH.

På grund af den mindre størrelse af nogle fisk sonder, kan denne metode også være bedre på gennemtrængende væv, der er store eller har betydelige hindringer. Vores brug af højere vaskemiddel niveauer og væv fiksering og permeabilization tweaks synes imidlertid at have løst dette problem. Endelig, selvom udviklet til Drosophila væv, de høje vaskemiddel buffere beskrevet her for dissekeret væv bør også arbejde for Drosophila embryoner som de fleste andre organismer og væv.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansiering støtte til dette projekt blev leveret af et tilskud til HMK af den canadiske institutter for sundhedsforskning (Giv MOPPE 133473).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
Agarose Bioshop AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide Bioshop FOR001.500
Glycerol Bioshop GLY002.4
Glycine Bioshop GLN001.500
Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
Name Company Catalog Number Comments
Solutions Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

Tags

Genetik spørgsmålet 128 RNA subcellulært lokalisering fluorescerende in situ hybridisering fisk Drosophila høj overførselshastighed tyramide signal forstærkning embryo væv.
Høj opløsning fluorescerende <em>In Situ</em> hybridisering i <em>Drosophila</em> fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R.,… More

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter