सीटू संकरण प्रोटोकॉल में वर्णित आरएनए पूरे Drosophila भ्रूण या विच्छेदित ऊतकों में आरएनए का पता लगाने की अनुमति देता है । ९६-अच्छी तरह से microtiter प्लेटों और tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग करना, टेप उच्च संकल्प, संवेदनशीलता, और प्रवाह में पता लगाया जा सकता है, और एक अपेक्षाकृत कम कीमत पर ।
हमारे प्रयासों में एक जीनोम-व्यापक आधार पर अभिव्यक्ति और Drosophila RNAs के सेलुलर स्थानीयकरण के पैटर्न का निर्धारण करने के लिए, और ऊतकों की एक किस्म में, हम कई संशोधनों और सीटू में हमारे मूल फ्लोरोसेंट में सुधार विकसित किया है संकरण (मछली) प्रोटोकॉल । प्रवाह और लागत प्रभावशीलता की सुविधा के लिए, जांच पीढ़ी से सभी कदम, संकेत पता लगाने के लिए, एक्सॉन ९६-well microtiter प्लेट्स का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं । Digoxygenin (डीआईजी)-बला antisense आरएनए जांच टेम्पलेट्स के रूप में या तो सीडीएनए क्लोन या जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं । ऊतक निर्धारण और permeabilization के बाद, जांच हित के टेप करने के लिए संकरे है और फिर विरोधी की एक उत्तराधिकार का उपयोग कर पाया-खोदो एंटीबॉडी संयुग्मित करने के लिए बायोटिन, streptavidin संयुग्मित को सहिजन peroxidase (एचआरपी) और फ्लोरोसेंट संयुग्मित tyramide, जो एचआरपी की उपस्थिति में, एक उच्च प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती है कि तुरंत आसंन प्रोटीन के इलेक्ट्रॉन घने क्षेत्रों को बांधने का उत्पादन । ये प्रवर्धन और स्थानीयकरण कदम एक मजबूत और उच्च स्थानीयकृत संकेत है कि दोनों सेलुलर और सेलुलर प्रतिलिपि स्थानीयकरण की सुविधा का उत्पादन । प्रदान की गई प्रोटोकॉल के ऊतकों और विकास के चरणों की एक किस्म में अत्यधिक विशिष्ट संकेतों का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया गया है । संदर्भ भी अतिरिक्त बदलाव है कि एकाधिक टेप, या टेप और प्रोटीन, एक ही समय में एक साथ पता लगाने की अनुमति के लिए प्रदान की जाती हैं ।
आरएनए-seq जैसे नए जीनोम-वाइड आरएनए डिटेक्शन तरीकों ने हमारे ज्ञान को कब और कहाँ जीन व्यक्त किया है, और किस स्तर पर1का विस्तार किया है । हालांकि, इन अपेक्षाकृत गरीब लौकिक और स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं । सीटू संकरण में आरएनए के स्थानिक वितरण की अनुमति देता नेत्रहीन निश्चित ऊतकों में मनाया जा करने के लिए, इस प्रकार सेलुलर और उपसेलुलर स्थानीयकरण के विवरण का खुलासा2. सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट का प्रयोग भी अधिक स्थानिक संकल्प की अनुमति देता है क्योंकि यह इस तरह के फोकल और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के रूप में शक्तिशाली माइक्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग की अनुमति देता है3. ऐसे DAPI के रूप में फ्लोरोसेंट मार्कर भी सेलुलर संबंध4स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मछली भी कई RNAs और प्रोटीन के अवलोकन के साथ ही उपसेलुलर स्तर पर ओवरलैप के स्पष्ट संकेत के साथ की सुविधा । अद्वितीय रिएजेंट और दोहरे लेबलिंग के लिए आवश्यक चरणों को निंन संदर्भ में3,5में ढूंढा जा सकता है ।
यहां वर्णित प्रक्रियाओं ९६-सीडीएनए टेम्पलेट उत्पादन (कॉलोनी पीसीआर) सहित सभी चरणों के लिए अच्छी तरह से microtiter प्लेटों का उपयोग, आरएनए जांच उत्पादन (T7, T3 या SP6 पोलीमरेज़-निर्भर रन-ऑफ प्रतिलेखन का उपयोग करते हुए), सीटू संकरण में , और फ्लोरोसेंट संकेत विकास । भ्रूण या ऊतकों की पर्याप्त संख्या ९६ की एक अच्छी तरह से थाली में जोड़ रहे है के लिए स्थिरता और परिवर्तनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं । एक अच्छी तरह से तो एक अलग जांच प्राप्त करता है । संकेत विकास के बाद, भ्रूण या ऊतकों को एक अच्छी तरह से सूक्ष्म विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सरणी रहे हैं ।
जांच का पता लगाने के लिए tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) का उपयोग असाधारण उपसेलुलर संकल्प के साथ मजबूत संकेतों का उत्पादन 5,6,7,8. RNAs का उपसेलुलर स्थानीयकरण एक महत्वपूर्ण विनियामक तंत्र 9 है जो लगभग सभी RNAs 4,10,11के साथ घटित होता प्रतीत होता है । इन विश्लेषणों से यह भी पता चला है कि आरएनए-seq द्वारा पहचाने नहीं गए कई टेप मछली 8से आसानी से पाए जाते हैं । सीटू में संकरण के लिए ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में आरएनए के अनुकूलन एक समय में ब्याज की ९६ जीन के विश्लेषण की अनुमति देता है (अधिक यदि अतिरिक्त प्लेट का उपयोग किया जाता है), बड़े डेटासेट का विश्लेषण संभव बनाना. छोटे वर्गों में प्लेटें काटने से, विधि भी आसानी से बस कुछ ही नमूनों के लिए अनुकूलित है । प्रदान की गई प्रोटोकॉल के ऊतकों के अधिकांश प्रकार में आरएनए वितरण के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । हालांकि नहीं दिखाया गया है, यह गैर के रूप में अच्छी तरह सेDrosophila ऊतकों के लिए अनुकूल है ।
1. पीसीआर प्रवर्धन सीडीएनए टेम्पलेट्स से plasmids
नोट: आरएनए जांच संश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मिड या पीसीआर जनित डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करें । Drosophila जीन संग्रह (क्लब) बर्कले Drosophila जीनोम परियोजना द्वारा उत्पंन पुस्तकालयों सबसे कोडन Drosophila जीनोम में पाया जीन की कवरेज प्रदान करता है (1a तालिका देखें) । ये भी किसी भी सीडीएनए डालने के प्रवर्धन के लिए यूनिवर्सल प्राइमरों के उपयोग की अनुमति देते हैं । ये पीसीआर प्रवर्धन प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरियल संस्कृतियों के lysates में मौजूद प्लाज्मिड DNAs पर प्रदर्शन कर रहे हैं । डीएनए उत्पादों तो के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन में antisense आरएनए जांच उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट्स के रूप में उपयोग किया जाता है (तालिका 1b देखें). डिजाइन प्राइमरों के लिए पीसीआर द्वारा ब्याज की एक जीन की एक विशिष्ट एक्सॉन क्षेत्र बढ़ाना ( उदाहरण डीएनए से जीनोमिक), अधिमानतः T7 समाप्ति पर पोलीमरेज़ antisense मांयता साइट के साथ । से कम ९६ नमूनों के साथ प्रयोगों के लिए, ९६-अच्छी तरह से प्लेटों की जरूरत से ज्यादा भागों में कटौती । सील टेप के साथ प्लेटें कवर (सामग्री देखें) सभी की मशीन और भंडारण के लिए । यदि microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, तदनुसार मात्रा समायोजित करें । नोट: ९६-अच्छी तरह से प्लेटें वृद्धि हुई प्रवाह के लिए मल्टीचैनल पिपेट के उपयोग की अनुमति, साथ ही लागत की बचत के लिए छोटे संस्करणों । table 1a वेक्टर एंटीबायोटिक कार्य एकाग्रता 1:1000 प्राइमरी आरएनए पोलीमरेज़ फॉर antisense आरएनए पोलीमरेज़. त्यात सेन्स pFLC-I amp pBst_SK (-) _F/R T3 T7 pBst (-) Amp pBst_SK (-) T7 T3 pOT2 Chlor pOT2_F/आर SP6 T7 pOTB7 Chlor pOT2_F/R T7 SP6 Table 1b प्राइमरी अनुक्रम pOT2_Forward
तालिका 1: A) सीडीएनए में plasmids आवेषण बढ़ाना के लिए सामान्य क्लब क्लोन जानकारी. ख) क्लब plasmids के लिए यूनिवर्सल प्राइमरों का जुगाड़. बढे २५० & #181; ९६ में प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरियल संस्कृति के एल-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों जोड़कर २४० & #181; एल पौंड मीडिया की अच्छी तरह से उचित एंटीबायोटिक चयन के साथ (1:1000 एक १००० एक्स एंटीबायोटिक स्टॉक के कमजोर पड़ने), और 10 & #181; l के मूल प्लाज्मिड-युक्त बैक्टीरिया (एक ग्लिसरॉल स्टॉक से) । सील टेप के साथ मुहर. २१५ आरपीएम पर ३७ & #176 पर झटकों से मशीन; सी रातोंरात (O/ नोट: मूल की जगह के लिए बैक्टीरियल ग्लिसरॉल सीडीएनए प्लाज्मिड क्लोन शेयर की एक नई प्रतिलिपि बनाओ । इस बैक्टीरिया को मार सकता है के रूप में मूल बैक्टीरियल स्टॉक reफ्रीज़ न करें । का निर्माण करने के लिए पीसीआर टेम्पलेट्स, पतला 10 & #181; l में O/N बैक्टीरियल संस्कृति के ९० & #181; l autoclaved ddH 2 ओ एक नई ९६-खैर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में । thermocycler में ९५ & #176; C पर 5 मिनट के लिए डीएनए को विकृत करना । तुरंत बर्फ पर थाली कम से 5 मिनट के लिए जगह तालिका 2. के अनुसार उपयुक्त यूनिवर्सल प्राइमरों का उपयोग कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार रिएजेंट्स ५० & #956; l sample reaction ९६ वेल मिक्स (112x reaction) अंतिम एकाग्रता 2 x पीसीआर पोलीमरेज़ मिक्स 25 & #956; l २८०० & #956; l 1 X Primer_For (25 pmol/& #956; l) ०.५ & #956; l 5 6 & #956; l ०.२५ pmol/& #956; l Primer_Rev (25 pmol/& #956; l) ०.५ & #956; l ५६ & #956; l ०.२५ pmol/& #956; l ddH2O 22 & #956; l २४६४ & #956; l कुल ४८ & #956; l ५३७६ & #956; l
तालिका 2: पीसीआर मास्टर मिक्स । का उपयोग कर एक पिपेट, aliquot ४८ & #181; एक नया ९६-खैर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुआं में पीसीआर मास्टर मिश्रण के एल । Add 2 & #181; L प्रत्येक विकृत प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट प्रति well. नोट: 1 picogram (pg) से 1 नैनोग्राम (एनजी) प्लाज्मिड डीएनए के बीच का उपयोग करें । अत्यधिक डीएनए टेम्पलेट पीसीआर यील्ड और विशिष्टता को कम करता है । प्रोग्राम ९६-well पीसीआर मशीन के अनुसार तालिका 3 और प्रवर्धन प्रदर्शन । नोट: एक्सटेंशन टाइम पर ७२ & #176; C पीसीआर उत्पाद के आकार से निर्धारित होता है (४५ s for & #8804; २.० kb, & #8804 के लिए १.५ min; ३.० kb, & #8804 के लिए 3 min; ४.० kb और ३.५ मिनट के लिए 4.0-5.0 kb). एनीलिंग तापमान (Tm) प्राइमरों के अनुक्रम से निर्धारित होता है । जब एक प्राइमर बराबर है या 20 से अधिक nt, tm के रूप में गणना की है: tm (& #176; C) = (4 सीजी के एक्स संख्या) + (2 एक्स संख्या एटी)-4. पाइला तापमान Time सायकल (s) पहायला विकार ९५ & #176; ग 3 मिन 1 सायकल प्रवर्धन विकार, एनीलिंग व विस्तार ९५ & #176; ग ४५ sec 30 चक्र 54-58 & #176; ग ४५ सेक ७२ & #176; ग ४५ sec-३.५ min अंतिम विस्तार ७२ & #176; ग 7 मिन 1 सायकल हण 4 & #176; ग पकड़
तालिका 3: अनुशंसित पीसीआर प्रोग्राम । पीसीआर इथेनॉल (ेतोः) और सोडियम एसीटेट (NaOAC) के साथ उत्पाद वर्षा (तालिका 4 देखें). नोट: यदि पीसीआर रिएक्शन की मात्रा ५० & #181 से कम है; l, भरण करने के लिए ५० & #181; l साथ ddH 2 हे. डीएनए को हाला, अवयवों को टेबल 4 से मिलाएं और स्टोर के नमूने हे/N at-20 & #176; c या के लिए 30 min at-८० & #176; c. ९६-खैर प्लेट के लिए 45-60 मिनट पर २,२५० x g पर 4 & #176; c. एक 8 चैनल का उपयोग कई गुना पिपेट सीarefully निकाल supernatant । १६० & #181 के साथ एक बार धो लें; L शीत ७०% ेतोः (RNase-फ्री) के लिए 30 मिनट में २,२५० x g पर 4 & #176; C. नोट: उपजी डीएनए कुओं के नीचे देखा जा सकता है । कम पीसीआर उत्पादों अब केंद्रापसारक की आवश्यकता है । धीरे एक कागज तौलिया पर ९६-अच्छी तरह से प्लेट उलटा एक अच्छी तरह से (जितना संभव हो) में तरल की पिछले बूंदों को दूर करने के लिए । एयर शुष्क डीएनए गोली 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर (आरटी) । RNase में हाला डीएनए को फिर से सस्पेंड किया गया & #181; L नि जल. नोट: 1 एच हवा सूखी ेतोः के सभी निशान को लुप्त होने की अनुमति देगा । हालांकि, तरल की एक बहुत छोटी मात्रा (लगभग 1 & #181; L) को पूरी तरह से सूखने से डीएनए गोली को रोकने के लिए प्रत्येक कुआं में रहना चाहिए । उपयोग 25 & #181; l के लिए एक ५० & #181; l पीसीआर रिएक्शन. इन विट्रो प्रतिलेखन में निम्नलिखित चरणों में के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए इस स्तर पर इलाज DEPC पानी का उपयोग न करें. घटक मात्रा भाग पीसीआर ५० & #956; l १००% इथेनॉल १२५ & #956; l २.५ X vol. of पीसीआर 3m NaOAc (pH = 5.2, RNase free) 5 & #956; l 10% of vol. of पीसीआर कुल १८० & #956; l
तालिका 4:५० & #181 का उदाहरण; L पीसीआर रिएक्शन. द्वारा पीसीआर उत्पादों के साइज व उपज की जांच कर 5 & #181; L 1 X ताे बफर में 1% agarose जेल पर पुनर्निलंबित डीएनए समाधान के एल. नोट: DNA टें पलेट के 250-500 एनजी के कुल 15 & #181 के लिए आवश् यक है; L इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया । अधिक पैदावार वाले नमूनों को आगे पतला किया जा सकता है । आरएनए उपज भी डीएनए टेम्पलेट के अनुक्रम और लंबाई पर निर्भर करता है । T7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ डीआईजी-आरएनए लेबलिंग के लिए सामान्य गाइड के अनुसार, लगभग 10 & #181; डीआईजी के जी-लेबल आरएनए 1 & #181 से निर्मित है; जी रेखीय टेम्पलेट.
2. इन विट्रो प्रतिलेखना antisense जांच उत्पन्न.
नोट: यह एक RNase-मुक्त वातावरण में काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । सभी रिएजेंट और लैब-वेयर को RNase फ्री (जैसे सर्टिफाइड DNase/RNase फ्री प्लास्टिक वेयर) होना जरूरी है । घटक स्टोक एकाग्रता मात्रा अंतिम एकाग्रता एटीपी १०० mm 7 & #956; l 10 mm CTP १०० mm 7 & #956; l 10 mm GTP १०० mm 7 & # 956; l 10 mm UTP १०० mm ४.५ & #956; l ६.५ mm डीआईजी-11-UTP 10 mM 25 & #956; l ३.५ mM RNase फ्री वॉटर १९.५ & #956; l कुल ७० & #956; l
तालिका 5: डीआईजी-NTP मिक्स वडा.
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |