Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.
Nei nostri sforzi per determinare i modelli di espressione e localizzazione subcellulare di Drosophila RNAs su una base del genoma e in una varietà di tessuti, abbiamo sviluppato numerose modifiche e miglioramenti al nostro originale fluorescente in situ protocollo di ibridazione (pesce). Per facilitare la velocità effettiva e convenienza, tutte le fasi, dalla generazione di sonda per il rilevamento del segnale, vengono eseguite utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti esone. Digoxygenin (DIG)-etichettati antisenso RNA sonde sono prodotte utilizzando DNA genomico o cDNA cloni come modelli. Dopo il fissaggio del tessuto e permeabilizzazione, sonde sono ibridate al trascrizioni di interesse e quindi rilevato utilizzando una successione di anticorpo anti-DIG coniugato con biotina, streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e coniugato fluorescente tyramide, che in presenza di HRP, produce un intermedio altamente reattivo che si lega alle regioni densi dell’elettrone di proteine immediatamente adiacente. Questi passaggi di amplificazione e localizzazione producono un segnale robusto e altamente localizzato che facilita la localizzazione sia trascrizione cellulare e subcellulare. I protocolli forniti sono stati ottimizzati per produrre segnali altamente specifici in una varietà di tessuti e stadi di sviluppo. Inoltre vengono forniti riferimenti per variazioni aggiuntive che consentono la rilevazione simultanea di più trascrizioni, o trascrizioni e proteine, allo stesso tempo.
Nuovi metodi di rilevamento RNA genoma come RNA-seq hanno notevolmente ampliato la nostra conoscenza di dove e quando i geni sono espressi, e a quali livelli di1. Tuttavia, questi forniscono relativamente scarsa risoluzione spaziale e temporale. Ibridazione in situ RNA permette la distribuzione spaziale delle trascrizioni da osservare visivamente in tessuti fissi, rivelando così i dettagli di localizzazione cellulare e subcellulare2. Usando l’ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette maggiore risoluzione spaziale come consente l’utilizzo di tecniche di microscopia potente, come di microscopia confocale e leggero foglio3. Marcatori fluorescenti come DAPI è utilizzabile anche per stabilire relazioni sottocellulare4. PESCE, inoltre, facilita l’osservazione di più di RNA e proteine contemporaneamente con chiare indicazioni di sovrapposizione a livello subcellulare. Reagenti unici e passaggi necessari per doppia marcatura possono essere trovati nei seguenti riferimenti3,5.
Le procedure descritte qui utilizzano 96 piatti di microtitolo per tutti i passaggi, tra cui produzione di modello di cDNA (PCR della Colonia), produzione di sonda RNA (mediante trascrizione della polimerasi dipendente dal dilavamento T7, T3 o SP6), ibridazione in situ , e sviluppo del segnale fluorescente. Un numero sufficiente di embrioni o tessuti vengono aggiunti a ogni bene della piastra 96 pozzetti per consentire la valutazione della coerenza e della variabilità. Bene, allora ognuno riceve una sonda diversa. Dopo lo sviluppo di segnale, embrioni o tessuti da ogni pozzetto sono schierati su vetrini da microscopio individuali per l’analisi al microscopio.
L’uso di amplificazione del segnale di microarray (TSA) per sonda rilevazione produce segnali robusti con una risoluzione eccezionale subcellulare 5,6,7,8. La localizzazione subcellulare di RNA è un importante meccanismo di regolazione 9 che sembra accadere con praticamente tutti gli RNA 4,10,11. Queste analisi hanno inoltre dimostrato che molte trascrizioni che non vengono rilevate da RNA-seq vengono prontamente rilevate da pesce 8. L’adattamento di RNA in situ ibridazione per piastre da 96 pozzetti permette l’analisi di fino a 96 geni di interesse in un momento (più se ulteriori piastre vengono utilizzati), rendere possibile l’analisi di DataSet di grandi dimensioni. Tagliando le piastre in sezioni più piccole, il metodo è anche facilmente adattato a pochi campioni. Il protocollo fornito è appropriato per l’analisi delle distribuzioni di RNA nella maggior parte dei tipi di tessuti. Anche se non indicato, è adattabile ai non – tessutidella drosofila pure.
Il protocollo descritto fornisce un metodo altamente riproducibile, sensibile ed economico per la rilevazione della maggior parte RNAs in fissa embrioni della drosofila o tessuti. Anche se leggermente più complessa rispetto più tradizionalmente utilizzato metodo di fosfatasi alcalina di sonda rilevazione, la risoluzione ottenuta da pesce è molto più grande e la sensibilità è paragonabile o migliore 7,8. Utilizzando piastre microtiter intero o parziale, dei protocolli possono essere utilizzati per analisi su larga scala o limitati di geni di interesse. Dovrebbe essere notato che le sonde generate potrebbero rilevare tutti o multiple della giuntura di trascrizione forma a meno che le sonde sono più specificamente progettati (cioè, singoli esoni). Anche se abbiamo testato sonde piccole come 200 nucleotidi con discreto successo, sonde più piccole tendono ad essere meno efficaci e possono essere meno specifici. Chiaramente, questo protocollo non è appropriato per la rilevazione di piccoli introni, esoni, o elaborati microRNA.
Sebbene questo approccio utilizza un passaggio enzimatico per aumentare la forza del segnale, intensità del segnale sembra essere proporzionale all’espressione genica in una relativamente lineare e ampia gamma di livelli di espressione. A maggiore ingrandimento, il segnale è visto come puncta o macchioline all’interno di cellule e tessuti. Per le trascrizioni relativamente rare sono visti solo pochi piccoli puncta. Abbondanza di trascrizione aumenta, questi si sviluppano in numero e dimensioni. Come con la singola molecola pesce (smFISH), singola puncta piccolo può anche corrispondere a singolo RNAs e inoltre dovrebbe essere facilmente quantificato utilizzando il software di imaging e informatica. Confronti di immagini pubblicate ottenute mediante smFISH con le immagini che abbiamo abbiamo curato per i medesimi obiettivi suggeriscono che il complessivo, la sensibilità e la risoluzione dei due metodi sono relativamente simili, anche se questo dovrebbe essere testato tramite i confronti più rigorosi. Dato il costo molto più elevato di smFISH, il metodo fornito qui dovrebbe dare risultati simili a una frazione del costo. Tuttavia, se l’obiettivo è quello di rilevare piccole trascrizioni o parti distinte di trascrizioni, smFISH è raccomandato.
A causa delle dimensioni più piccole di alcune sonde FISH, questo metodo può anche essere meglio a tessuti penetranti che sono grandi o con barriere significative. Tuttavia, il nostro uso di livelli più elevati di detersivo e tweaks di fissazione e permeabilizzazione tessuto sembrano hanno risolto questo problema. Infine, sebbene sviluppato per tessuti di Drosophila , il buffer di detergente alta descritto qui per tessuti dissecati dovrebbe funzionare anche per tessuti, nonché la maggior parte altri organismi ed embrioni della drosofila .
The authors have nothing to disclose.
Finanziamento per questo progetto ha fornito una sovvenzione alla HMK dal canadese istituti di salute ricerca (concedere 133473 MOP).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |