Summary
Beskrevet RNA i situ hybridisering protokollen tillater påvisning av RNA i hele Drosophila embryo eller dissekert vev. Bruke 96-brønnen microtiter plater og tyramide signalforsterkning, kan utskrifter oppdages ved høy oppløsning og følsomhet gjennomstrømming og en relativt lav kostnad.
Abstract
Inne våre anstrengelser å finne mønstre av uttrykk og subcellular lokalisering av Drosophila RNAs på genomet-bred basis, og i en rekke vev, har vi utviklet mange endringer og forbedringer til vår opprinnelige fluorescerende på stedet hybridisering (fisk)-protokollen. For å lette gjennomstrømming og kostnadene effektivitet, utføres alle trinnene, fra sonden generasjon til signalet oppdagelsen, bruker ekson 96-brønnen microtiter plater. Digoxygenin (graver)-merket antisense RNA sonder er produsert med cDNA kloner eller genomisk DNA som maler. Etter vev fiksering og permeabilization, sonder er hybridiserte til utskrifter av interesse og deretter oppdaget ved hjelp av en rekke anti-grave antistoff konjugert til biotin, streptavidin konjugert til pepperrotperoksidase (HRP) og fluorescently konjugert tyramide, som i nærvær av HRP, produserer en svært reaktive mellomliggende som binder til elektron tett regioner i umiddelbar nærhet av proteiner. Følgende forsterkning og lokalisering produsere et robust og svært lokaliserte signal som forenkler både mobilnettet og subcellular transkripsjon lokalisering. Protokollene gitt har blitt optimalisert for å produsere svært spesifikke signaler i en rekke vev og utviklingsstadier. Referanser tilbys også for flere varianter som tillater samtidig påvisning av flere utskrifter, eller utskrifter og proteiner, samtidig.
Introduction
Nye genomet hele RNA gjenkjenningsmetoder som RNA-seq utvidet sterkt vår kunnskap når og hvor gener som er uttrykt, og på hvilke nivåer1. Dette gir imidlertid relativt dårlig timelige og romlig oppløsning. RNA i situ hybridisering lar den romlige fordelingen av transkripsjoner å visuelt i fast vev, dermed avslører detaljer om mobilnettet og subcellular lokalisering2. Med fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kan enda mer romlig oppløsning som det tillater bruk av kraftige mikroskopi teknikker, som AC confocal og lys ark mikroskopi3. Fluorescerende markører som DAPI kan også brukes til å etablere subcellular relasjoner4. FISK Letter også observasjon av flere RNAs og proteiner samtidig med tydelige indikasjoner på overlapping på subcellular nivå. Unik reagenser og trinnene som er nødvendig for dobbel-merking kan finnes i følgende referanser3,5.
Prosedyrene som er beskrevet her utnytte 96-brønnen microtiter plater for alle trinnene, inkludert cDNA mal produksjon (kolonien PCR), RNA sonde produksjon (med T7, T3 eller SP6 polymerase-avhengige avrenning transkripsjon), i situ hybridisering, og fluorescerende signal utvikling. Tilstrekkelig antall embryo eller vev legges til hver godt av 96-brønns plate å tillate evaluering av konsekvent spill og variasjon. Så får hver en annen sonde. Etter signal utvikling, er embryo eller vev fra hver brønn plassert på individuelle objektglass for mikroskopisk analyse.
Bruk av tyramide signalforsterkning (TSA) for sonden oppdagelsen gir robust signaler med eksepsjonell subcellular oppløsning 5,6,7,8. Den subcellular lokaliseringen av RNAs er en viktig regulatoriske mekanisme 9 til oppstå med nesten alle RNAs 4,10,11. Disse analysene har også vist at mange utskrifter som ikke gjenkjennes av RNA-seq er lett oppdaget av fisk 8. Tilpasning av RNA i situ hybridisering til 96-brønns plater tillater analyse av opptil 96 gener rundt på en tid (mer hvis flere plater brukes), gjør analyse av store datasett mulig. Ved å kutte plater i mindre deler, er metoden også tilpasset til bare noen få eksempler. Protokollen gitt er egnet for analyse av RNA distribusjoner i de fleste typer vev. Selv ikke vises, er det tilpasses ikkeDrosophila vev.
Protocol
1. PCR forsterkning av cDNA maler fra plasmider
Merk: bruke høykvalitets plasmider eller PCR-generert DNA maler for RNA sonde syntese. Drosophila Gene samling (DGC) bibliotekene generert av Berkeley Drosophila genom prosjektet gir dekning av de fleste koding gener i Drosophila genomet (se tabell 1a). Disse også tillater bruk av universell primere for forsterkning av noen cDNA sette. Disse PCR amplifications utføres på plasmider DNAs i lysates av plasmider inneholder bakteriekulturer. DNA produktene brukes deretter som maler for i vitro transkripsjon til å generere antisense RNA sonder (se tabell 1b).
- Design primere å forsterke en bestemt ekson regionen en genet av interesse av PCR (f.eks. fra genomisk DNA), fortrinnsvis med T7 polymerase anerkjennelse nettstedet antisense slutten.
- For eksperimenter med færre enn 96 prøver, kuttet unødvendige deler av 96-brønns plater. Adskilte dekkplater med tetting tape (se materialer) for alle incubations og lagring. Hvis microcentrifuge rør, justere volumene tilsvarende.
Merk: 96-brønns plater tillater bruk av flerkanals Pipetter for økt gjennomstrømning, samt mindre volumer for kostnadsbesparelser.
| tabellen 1a | ||||
vektor | Antibiotika arbeider konsentrasjon 1:1000 |
Primere | RNA polymerase for antisense | RNA polymerase. for følelse |
| pFLC-jeg | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Chlor | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tabell 1b | ||||
| Primer | sekvens | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Snu | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
tabell 1: A) generelt DGC klone informasjon for forsterke cDNA setter inn i plasmider. B) sekvenser av Universal primere for DGC plasmider.
- vokser 250 µL av plasmider inneholder bakteriell kultur i 96-brønnen plater ved å legge 240 µL av LB media per godt med riktig antibiotikumet utvalg (1:1000 fortynning av en 1000 X antibiotika lager), og 10 µL av originalen plasmider inneholder bakterier (fra en glyserol lager). Tett med tetting tape.
- Incubate ved å riste på 215 rpm på 37 ° C over natten (O/N).
Merk: Lage en ny kopi av bakteriell glyserol cDNA plasmider klone aksje å erstatte originalen. Ikke refreeze opprinnelige bakteriell lager, så dette kan drepe bakteriene. - å produsere PCR maler, fortynne 10 µL av O/N bakteriell kultur i 90 µL autoklaveres ddH 2 O i hver brønn av en ny 96-brønns PCR plate. Denature DNA for 5 min på 95 ° C i thermocycler. Umiddelbart plassere platen på is minst 5 min.
- Forberede PCR reaksjoner med riktig universell primer som tabell 2.
| reagenser | 50 μl eksempel reaksjon | 96 bland godt (112 x reaksjon) | siste konsentrasjon |
| 2 X PCR polymerase blanding | 25 μl | 2800 μl | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/μl) | 0,5 μl | 5 6 μl | 0,25 pmol/μl |
| Primer_Rev (25 pmol/μl) | 0,5 μl | 56 μl | 0,25 pmol/μl |
| ddH2O | 22 μl | 2464 μl | < /TR > |
| totalt | 48 μl | 5376 μl |
tabell 2: PCR Master Mix.
- bruker en pipette, aliquot 48 µL av PCR master blandingen i hver brønn av en ny 96-brønns PCR plate. Legge til 2 µL av hver denaturert plasmider DNA mal per brønn.
Merk: Bruk mellom 1 hører (pg) til 1 nanogram (ng) av plasmider DNA. Overdreven DNA mal reduserer PCR avkastning og spesifisitet. - Program 96-brønns PCR maskinen per tabell 3 og utføre forsterkning.
Merk: Utvidelse samtidig 72° C bestemmes av størrelsen på PCR produktet (45 s ≤ 2.0 kb, 1,5 min for ≤ 3.0 kb, 3 min for ≤ 4.0 kb og 3,5 min for 4.0-5.0 kb). Den annealing temperaturen (Tm) bestemmes av rekkefølgen på primere. Når en primer er samme eller lengre enn 20 nt Tm beregnes som:
Tm (° C) = (4 X antall CG) + (2 X antall på) -4.
| trinn | temperatur | tid | Cycle(s) |
| Første rødsprit | 95 ° C | 3 min | 1 syklus |
| forsterkning rødsprit, annealing og forlengelsen | 95 ° C | 45 sek | < td rad span = "3" > 30 sykluser|
| 54-58 ° C | 45 sek | ||
| 72 ° C | 45 sek-3,5 min | ||
| Endelig utvidelse | 72 ° C | 7 min | 1 syklus |
| Lagring | 4 ° C | har |
tabell 3: anbefalt PCR Program.
- PCR produktet nedbør med etanol (EtOH) og natrium acetate (NaOAC) (se tabell 4).
Merk: Hvis PCR reaksjon volumet er mindre enn 50 µL, fylle 50 µL med ddH 2 O.- å utløse DNA, bland komponentene fra tabell 4 og lager prøver O/N ved 20 ° C eller 30 min på-80 °C.Centrifuge 96-brønns platen etter 45-60 min 2250 x g på 4 ° C. Bruk en 8-kanals manifold pipette carefully fjerne nedbryting. Vask en gang med 160 µL av kaldt 70% EtOH (RNase-ledig) i 30 min 2250 x g på 4 ° C.
Merk: Utfelt DNA kan sees på bunnen av brønner. Kortere PCR produkter krever lengre centrifugations. - Forsiktig Inverter 96-brønns plate papirhåndkle å fjerne den siste dråper flytende i hver brønn (som mulig). Luften tørr DNA pellet 1t ved romtemperatur (RT). Resuspend utfelt DNA i 25 µL RNase gratis vann.
Merk: 1t luften tørr vil tillate alle spor av EtOH til å fordampe. Men bør en liten mengde væske (ca 1 µL) forbli i hver brønn for å hindre DNA pellet helt tørker. Bruke 25 µL for en 50 µL PCR reaksjon. Ikke bruk DEPC behandlet vann på dette stadiet for å unngå interferens med i vitro transkripsjon i fremgangsmåten.
- å utløse DNA, bland komponentene fra tabell 4 og lager prøver O/N ved 20 ° C eller 30 min på-80 °C.Centrifuge 96-brønns platen etter 45-60 min 2250 x g på 4 ° C. Bruk en 8-kanals manifold pipette carefully fjerne nedbryting. Vask en gang med 160 µL av kaldt 70% EtOH (RNase-ledig) i 30 min 2250 x g på 4 ° C.
| komponent | volum | del |
| PCR | 50 μl | |
| 100% etanol | 125 μl | 2,5 X vol. av PCR |
| 3 M NaOAc (pH = 5.2, RNase gratis) | 5 μl | 10% av vol. av PCR |
| totalt | 180 μl |
Tabell 4: eksempel på en 50 µL PCR reaksjon.
- sjekke størrelsen og avkastning PCR produkter ved å kjøre 5 µL resuspended DNA løsningen på en 1% agarose gel 1 X TAE buffer.
Merk: Totalt 250-500 ng av DNA kreves for 15 µL i vitro transkripsjon reaksjonen. Prøver med høyere avkastning kan fortynnes ytterligere. RNA avkastningen er også avhengig av sekvensen og lengden på malen DNA. I henhold til de generelle guiden for DIG-RNA merking med T7 RNA polymerase, ca. 10 µg av grave-merket er produsert fra 1 µg linearisert mal.
2. In vitro transkripsjon til å generere antisense sonder.
Merk: det er viktig å arbeide i et RNase miljø. Alle reagenser og lab-ware må være RNase gratis (for eksempel sertifisert DNase/RNase gratis plast ware).
| komponenten | lager konsentrasjon | volum | Siste konsentrasjon |
| ATP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| GTP | 100 mM | 7 & # 956; l | 10 mM |
| UTP | 100 mM | 4,5 μl | 6.5 mM |
| Grave-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3,5 mM |
| RNase gratis vann | < /td > | 19,5 μl | |
| totalt | 70 μl |
tabell 5: grave-NTP blanding forberedelse.
< tabell Border = "1" fo:keep-together.within-side = "1" fo:keep-med-next.within-side = "alltid" >(112 x reaksjon)
tabell 6:2 X transkripsjon Master Mix.
- Forberede grave-NTP blanding per tabell 5.
Merk: For å unngå feil, alltid justere platen slik at A1 er øverst i venstre hjørne av tallerkenen. - Legg til komponenter beskrevet i tabell 6 hver brønn i en ny 96-brønns PCR plate (sonde plate). Legge til 7,5 µL av PCR produkt (DNA mal) til hver samsvarer godt, ved hjelp av en flerkanals pipette. Dekk platen med tetting tape.
Merk: Den optimale mengden PCR produkt lagt til transkripsjon reaksjon bør være mellom 0,5 og 1 µg. Hvis band på gel er betydelig svakere eller mer intense, kan volumet av DNA lagt til reaksjonen bli justert tilsvarende. Hvor nøyaktig er ikke kritisk. - Ruge sonde platen på 37 ° C for 3.5-4 h. blanding 15 µL av syntetisk sonde med 35 µL av DEPC behandlet ddH 2 O, 125 µL av 100% EtOH, og 5 µL av 3 M NaOAC (pH = 5.2, RNase gratis). Lagre på-80 ° C i minst 30 min. sentrifuge og vask som beskrevet i trinn 1.10.2 og 1.10.3.
- Resuspend utfelt sonden i 25 µL av DEPC behandlet ddH 2 O. kjøre 5 µL på en 1% agarose gel (kjøretiden < 20 min) kontrollere integriteten og avkastning av sonden ( figur 2).
Merk: Agarose gel må gjøres med DEPC behandlet ddH 2 O og TAE buffer. Gel geleelektroforese apparatet skal tilordnes for RNA arbeide. Lengre gel kjøretiden ved lav hastighet kan føre til RNA fornedrelse under geleelektroforese. - Blande de resterende 20 µL av syntetisk sonde med 100 µL hybridisering løsning (Tabell 7) og butikk på-80 ° C inntil.
Merk: Sonde konsentrasjonen kan fortynnes flere hvis band er særlig robust (se figur 2 eksempler). Hybridisering løsningen er svært effektiv for forhindrer RNase forurensning. Umiddelbart legge hybridisering løsning til resuspended sonden å unngå RNA degradering. Hybridisering løsning må filtreres gjennom en 0,2 µm. For vevsprøver, øke vaskemiddel konsentrasjonen av hybridisering løsningen ved å legge Triton-X-100 til en siste konsentrasjon på 0,3%.
| komponent | volum | siste konsentrasjon |
| DEPC behandlet ddH2O | ml 11.85% | 23,7% |
| 20 X SSC | 12.5 ml | 25% (5 X) |
| Formamide | 25 ml | 50% |
| Heparin (50 mg/ml) | 0,1 ml | 0. 2% (0,1 mg/ml) |
| Laks sperm enkelt strandet DNA | 0,5 ml | 1,0% |
| Tween-20 | 0,05 ml | 0,1% |
| Totalt | 50.00 ml | 100% |
3. drosophila oppdrett og embryo, larve og voksen vev samling.
Merk: For både liten skala (flasker) og masse (bokser) fly oppdrett, bruker standard fly lab protokoller cornmeal basert mat på 25 ° C. holde riktig voksne og larver tetthet og gir ekstra aktiv gjær pulver på mat overflater.
- Samle embryo etter standardprotokoller. De viktigste trinnene av embryoet samling er illustrert i Figur 3.
Merk: Etter rense devitillinized embryo i metanol, de faste embryoene kan lagres på 20 ° C i opptil ett år. Fosteret permeabilization og etter fiksering utføres på dag 1 av fisk protokollen. - Forberede frisk 40% PFA lagerløsning.
- Forberede en nystekte lager løsning av 40% paraformaldehyde (PFA) ved å blande 10 mL av DEPC behandlet ddH 2 O 3.68 g PFA og 70 µL av 2N KOH i en 20 mL scintillation hetteglass med et lite Språklinje
Forsiktig: PFA er svært giftige med potensielle akutte og kroniske helseeffekter. Lese MSDS (HMS-Datablad) og bruke riktig beskyttelse for øyne, hud og luftveier. - i avtrekksvifte, varme og rør ampullen for 3-5 minutter på en oppvarming plate på 200 ° C til PFA er fullstendig oppløst. Fjern PFA lager løsningen fra varmen så snart PFA oppløses (ikke overopphetes).
- Kule oppløste 40% PFA lager løsningen på is 5 min, og filtrere med 0,2 µm filter og 10 mL sprøyte.
- Forberede en nystekte lager løsning av 40% paraformaldehyde (PFA) ved å blande 10 mL av DEPC behandlet ddH 2 O 3.68 g PFA og 70 µL av 2N KOH i en 20 mL scintillation hetteglass med et lite Språklinje
- Tredje skikkelsen larver (L3) eller voksen vev fiksering, slukke og permeabilization
Merk: denne protokollen skal være ferdig på en dag. Det inkluderer vev disseksjon, fiksering, slukke endogene HRP, permeabilization og etter fiksering.- Forberede fikse løsninger (fastsette-I og Fix-II) per tabell 8.
Merk: pikrinsyre brukes som en ekstra bindemiddel når vev har en delikat struktur som må bevares. Det er ikke en god bindemiddel når vev ultrastructure må bevares for elektronmikroskop (EM).
Advarsel: pikrinsyre er ustabil og har evnen til å reagere med andre materialer og opprette eksplosivt forbindelser. Bruke og lagre ifølge sikkerhetsretningslinjer. - Sted larver eller voksen fluer i et 50 mL plastrør som inneholder 10 mL kaldt 1 X PBS og 100 µL av Fix-jeg løsning. Chill på isen i 2 minutter å redusere larver eller voksen fly motilitet.
- Kutt av tuppen av en 1 mL plast tips for å lage en åpning for 2-3 mm. Overfør 10-30 larver eller voksen flyr med 1 mL spissen i en Petriskål (9 cm diameter) med et tynt lag med 1 X PBS fra 50 mL tube (trinn 3.3.2). Legge litt PBTT kan redusere overflatespenningen. Nøye analysere larver (åpen fra fremre og presse vev fra bakenfor anterior) eller voksen vev rundt med et par skarpe tang under en dissecting omfang.
Merk: Ca 200-300 larver eller voksen testiklene kan dissekert og fast i en dag av erfarne personer. - Overføring dissekert vev med en 200 µL pipette (med spissen kuttet opprette 2 mm diameter åpning) i en 1,5 mL tube og butikk på is. Fullføre hver runde av disseksjon innen 10-15 min før du går videre til neste trinn.
Merk: Fortsette med flere runder (innen et 2t tidsvindu) som kreves for å generere tilstrekkelig materiell. - Fastsette vev med 800 µL av Fix-jeg løsning for 30 min på en benk toppen mikser. Skyll vev når med 800 µL 1 X PBTT og holde rør på is maksimalt 2,5 h. på grunn av 30 min grense, må denne utføres batch-wise før du har samlet tilstrekkelig vev.
- Pool alle dissekert og fast vev i et enkelt 15 mL plastrør som inneholder mesh i lokket (se Figur 4 tube design). Sug opp overflødig væske gjennom nettet i rør lokket. Vask 3 X 5 min hver med 10 mL 1 X-PBTT. Skyll to ganger med 10 mL 1 X PBS fjerne vaskemiddel. Dette forhindrer overflødig bobler i neste trinn.
Merk: Hvis dissekert vev synke å bunnen av røret, trinnene utføres i vanlige microtiter plater eller 0,5-1,5 mL microcentrifuge rør (300-800 µL volum per tube). - Slukke endogene HRP aktivitet med 5 mL 0,3% H 2 O 2 i PBS i 15 min på RT. Repeat igjen. Holde lokket åpent i dette trinnet uten blanding. Skyll to ganger med 10 mL 1 X-PBTT. Vask to ganger i 5 min med 10 mL av 1 X-PBTT.
- Permeabilize vev med 10 mL av 80% aceton (20 ° C, pre kjølt) på 20 ° C for 10 min. Inverter røret to ganger under inkubasjonstiden. Vask to ganger for 10 min med 10 mL 1 X PBTT rehydrate vev.
- Skyll med 10 mL blanding av 5 ml PBTT pluss 5 ml hybridisering løsning (1:1). forkaste blanding og erstatte med 10 ml hybridisering løsning. Eksempler kan lagres på 20 ° C til nødvendig. For best resultat, lagrer ikke prøver for mer enn en uke.
- Forberede fikse løsninger (fastsette-I og Fix-II) per tabell 8.
| komponent | fastsette jeg (10 ml) | fikse II (10 ml) |
| 40% PFA lager | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8.99 ml | 9 ml |
| pikrinsyre løsning | 10 μl | - |
4. in situ hybridisering
Merk: denne delen av protokollen krever minimum 2 dager, prøve forberedelser, før hybridisering og hybridisering tar sted på dag 1 og sonde gjenkjenning på dag 2. Hvis prøver er relativt høy, hvis ukjent med protokollen, eller en hel dag er ikke mulig, skal protokollen utføres i 3 dager med trinn sonde gjenkjenning og signal forsterkning delt inn i 2 dager. Stort antall embryo eller dissekert vevsprøver kan også kreve ekstra dager å behandle. For dissekert vevsprøver, erstatte 1 X PBT med 1 X-PBTT i alle trinnene, med mindre annet er angitt. Ekstra vaskemiddel kreves for penetrasjon av mange larver og voksen vev, som hjernen og testikkel. Selv om ikke testet, 1 kan X PBTT også brukes for embryoer. Bruke 100 µL per brønn for 96-brønns plater og 800 µL for 1,5 mL rør.
- Før hybridisering og blanding
Merk: trinn 4.1.1-4.1.6.2 er for fosteret i situ hybridisering. For larver eller voksen vev i situ hybridizations, kan du hoppe over disse trinnene.- Fjerne 2 mL av fast embryo (lagret i metanol på 20 ° C) til en ny 15 mL tube. Vask embryo to ganger for 7 min med 10 mL av metanol i hver vask. WAsh embryo for 7 min med 10 mL blanding av metanol og 1 X PBTT (1:1). Vask embryo to ganger for 7 min med 10 mL 1 X PBTT rehydrate.
- For fosteret permeabilization, forberede en mellomliggende proteinasen K løsning (40 µL/mL) fortynne 1:500 fra lagerløsning (20 mg/mL). Butikken på -20 ° C. gjør en fungerende proteinasen K løsning ved å fortynne den mellomliggende proteinasen K løsningen 1/15 i 1 X-PBTT for en siste arbeider konsentrasjon av 2.667 ug/mL.
- Permeabilize embryo med 10 mL arbeider proteinasen K løsning (Bruk mindre for mindre antall embryo). Inkuber røret på RT for 13 min. forsiktig Inverter røret 4 ganger under incubation. Inkuber eksemplene i proteinasen K løsning på is 1t uten blanding.
Merk: Denne relativt lang incubation med fortynnet proteinasen K sikrer reproduserbar uniform permeabilization og påfølgende farging. - Mens embryo permeabilize, lage en 2 mg/mL glysin løsning fra 10 X lager (20 mg/mL) i 1 X PBTT for et totalt volum på 30 mL.
- Fjern proteinasen K løsning, skyll med 10 mL glysin (2 mg/mL) og vaske to ganger i 2 minutter. Skyll tre ganger med 10 mL 1 X PBTT fjerne glysin.
- Etter fiksering av embryo.
- Forberede 10 mL av 4% PFA (1 mL av 40% PFA i 9 mL PBTT, filtrert gjennom 0,45 µm).
- Ruge eksemplene i 4% PFA i 20 min. vask 3 X i 2 minutter med PBTT.
- å forberede denaturert hybridisering løsning, kok hybridisering løsningen for 5 min. For en full 96-brønns plate, kan du bruke tre rør 12 ml. Kul på is umiddelbart 5 min.
- Skyll embryoer når med 10 mL 1 X PBTT: hybridisering løsning (1:1). Skyll to ganger med 5 mL hybridisering. Aliquot ~ 20 µL per brønn av avgjort embryo (30-40 embryo) eller fast vev i en 96-brønns PCR plate på is. Fjerne hybridisering løsningen fra vev eller embryo med en 8-kanals manifold Pipetter ( figur 1 / video).
NOTE Det mangfoldige pipette har en ‘ stoppe ’ som forhindrer tips fra å gå til bunnen av brønnene og fjerne prøven. Eksperimenter med vev som flyter, fjerne væske med en 100 µL pipette ovenfra.
- Legge 100 µL av denaturert hybridisering løsningen i hver brønn. Pre hybridize embryo minimum 2,5-3 h på 56 ° C med en tørr bad oppvarming enhet som inneholder metall perler (se materialer og figur 1).
- Denature 100 µL av tilberedes sonde i en 96-brønns PCR plate bruker en thermocycler for 5 min på 80 ° C. umiddelbart kule på is 5 min. Fjerne pre hybridisering løsningen fra befruktede egg eller vev. Legg denaturert gen-spesifikke sonder hver prøve, dekk med tetting tape og hybridize ved 56 ° C i 16-18 h O/N, under metall perler i tørr bad oppvarming enhet
5. Undersøke oppdagelsen
- Forvarm løsningene i tabell 9 i 56 ° C oppvarming enhet. Fjerne sonder fra platen.
Merk: Sonder kan gjenbrukes mellom 2 - 3 ganger hvis lagret på-80 ° C (aldri lager noen RNA eksempler i 20 ° C). Etter hybridisering, den doble strandet RNA er mer stabil enn enkelt tråd RNA og er mindre utsatt for degradering skyldes RNase forurensning.
Hvis bruker en en multi godt plate vakuum filtreringssystem for vev, en samling plate skal tas under filter platen samle sonder (se video samling informasjon). Hybridisert vev må overføres fra vanlige 96-brønnen microtiter platen brukes for hybridisering til en med 1,2 µm pore størrelse PVDF membraner nederst på hver brønn.
| trinn | pre varmet løsning (56 ° C) | tid | Volume per godt |
| 1 | Hybridisering løsning: PBTT (3:1) | 15 min | 100 μl |
| 2 | Hybridisering løsning: PBTT (3:1) | 15 min | 100 μl |
| 3 | Hybridisering løsning: PBTT (1:1) | 15 min | 100 μl |
| 4 | Hybridisering løsning: PBTT (1:3) | 15 min | 100 μl | 5 | .PBTT 3 vasker | 5 min | 100 μl |
tabell 9: vaske sonder etter hybridisering.
- Hvis bruker vanlig plater, vask prøver per tabell 9 oppvarming enhet på 56 ° C. Hvis bruker vakuum manifold systemet, bruker oppvarmet løsninger med vakuum system på benken og fjerne løsninger umiddelbart fra nedenfor ved vaccuum. Etter 3 vask med 1 X-PBTT, vanlig platen kan fjernes fra oppvarming enhet
- Forberede antistoffer.
- Forberede 11 mL primære antistoff løsning (2,5 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) fortynne biotin-konjugerte musen monoklonale anti-grave antistoff (se materiale) i PBTTB (1:400). Hvis behandlingen færre prøver, justere volumene tilsvarende.
- Forberede 11 mL av streptavidin-HRP løsning (1 µg/mL) fra lager (1 mg/mL) fortynne 1:1000 streptavidin-HRP bøy (se materiale) i PBTTB. Hvis bruker færre prøver, justere volumene tilsvarende.
- Blokkere embryo eller vev med PBTTB (1% skummet melk i 1 X PBTT) for 20 min på en benk toppen mikser på RT.
Merk: Filter PBTTB bruke filter papir (klasse 3, 6 µm) før du bruker den på 96-brønns filter plater for å unngå tilstopping filtrene. I stedet for PBTB, PBTTB (PBTB med ekstra 0,3% Triton-X-100) brukes for alle vev under protokollen. - Incubate embryo eller vev i antistoff løsning (100 µL/vel) for 2t på benken-top utvalg mikser. Skyll to ganger med 1 x PBTTB. Vask 3 X 5 min og 5 X i 10 minutter med PBTTB. Inkuber embryo eller vev med streptavidin-HRP løsning (100 µL/vel) for 1,5 t med en benk-top utvalg mikser. Vask 2 X i 5 min med PBTTB. Holde prøver i mørket fra dette punktet på.
Merk: under alle antistoff vasker, hvis vev blir tapt på grunn av tetthet produsert av melk, prøve vask uten melk (PBTT stedet for PBTTB). - Utarbeide en DAPI løsning med utvannende 100 X DAPI i PBTTB (1: 100).
- Incubate embryo eller vev med DAPI løsning (100 µL/vel) i 15 min på en benk-top utvalg mikser. Vask 4 X i 10 minutter med PBTT. Lagre 96-brønns platen med samples O/N ved 4 ° C eller fortsette til neste trinn.
Merk: Prosedyren kan pauses her.
6. Antistoff oppdagelsen ved hjelp av tyramide (se figur 5)
Merk: her hjemmelaget cyanine 3-konjugerte tyramide ble brukt, som ble utarbeidet i henhold til protokollen beskrevet i 12 . Hvis utfører mange eksperimenter eller teste mange prøver, sparer mye penger og er effektive i forhold til kommersielle reagenser (fra erfaring). Færre eksperimenter og prøver, kommersielt tilgjengelig cyanine 3-tyramide kan brukes (se materialer).
- Vask eksempel plater 3 X i 5 min med 1 X-PBTT.
- Forberede tyramide aktivisering buffer (aktivisering buffer) 0.006 prosent av H 2 O 2 i PBTT (fortynne 30% (w/w) H 2 O 2 lager 1:5000). < lJeg > rense platene med aktivisering bufferen.
- Forberede cyanine 3-tyramide løsning ved å fortynne det aktivisering buffer i en 15 mL tube.
- For embryoer, bruke 1:80 fortynning (137 µL av cyanine 3-tyramide i 11 mL aktivisering buffer). Larver vev, bruke 1:150 fortynning (73 µL av cyanine 3-tyramide i 11 mL aktivisering buffer). Voksen testiklene, bruke 1:200 fortynning (55 µL av cyanine 3-tyramide i 11 mL aktivisering buffer). Bruk 1:300 fortynning (36 µL av cyanine 3-tyramide i 11 mL aktivisering bufferen) for voksne eggstokkene,.
- Ruge prøver med cyanine 3-tyramide løsning for 2t på benken-top utvalg mikser. Skyll fire ganger med PBTT. Vask 6 X for 10 min med PBTT. Vask 3 X i 5 min med PBS fjerne smuss.
- Legge til 150 µL/godt av anti-fade monterer medier. Hold prøver O/N på 4 ° C vev eller embryo til synke å bunnen av røret. Montere eksempler på objektglass (under dissekere omfang for vev) og dekk med dekkglassvæske. Forsegle kantene på dekkglassvæske med gjennomsiktig neglelakk.
- Bildet med fluorescens mikroskop.
Merk: analysere negativ kontroll først for å få en idé om ‘ uspesifisert ’ bakgrunn.
Representative Results
Figur 6 viser eksempler på resultatene ved hjelp av denne fremgangsmåten. Topp 3 panelene viser eksempler på tidlig Drosophila embryo (figur 6, paneler vekselstrøm), det neste 3 paneler viser eksempler sen Drosophila embryo med signaler i ulike vev (amnioserosa, muskler og sentralnervesystemet, henholdsvis (figur 6, paneler D-F). Neste er eksempler fra 3dje skikkelsen larver vev (figur 6, paneler G-J). Paneler K og L Vis representant bilder fra voksen gonader (eggstokken og testikkel, henholdsvis). Hundrevis av bilder har blitt lastet opp og kommenterte i vår søkbare fluorescerende i situ frukt fly database (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Figur 1. Omrisset av fluorescerende i situ hybridisering (fisk) protokollen nøkkel utstyr og. (A) PCR forsterkning av cDNA. (B) In vitro transkripsjon generere gen-spesifikke antisense grave - merket RNA sonder i en 96-brønns plate (Foto av platen vises i b). (C) og (D): voksne (kvinnelig: mannlige forholdet 2:1. 300-400 fluer/flaske) flyr tillates å mate i 3-4 dager. Embryoer fra en overnatting samling på standard cornmeal mat ved 25 ° C er overført til en godt ventilert plasteske (1 L cornmeal mat i en container størrelse: 8 "X 8" X 3" LWH) eller nye flasker holder en lated larver tetthet. Vev samling, bør aktiv gjær pulver stenket på maten på 24, 48 timer etter egglegging (jel). (E til H): Fluorescerende i situ hybridisering eksperimenter utført over 3 dager. Embryo eller vev som ikke flyte, bruke en 96-brønns PCR plate som vist på bilde b med 8-kanals aspirator (bilde c). For vev som flyter, som de fleste larver vev, bruke en filter bunn plate (bilde i d) og fjern væsken fra bunnen med en manifold aspirator ved hjelp av lavtrykk (bilde i e). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fastsettelse av RNA sonde avkastning. Nylig syntetisert antisense RNA sonder observert på en 1% agarose gel (5 µL/lane). Avkastningen kan kategoriseres (basert på intensiteten av bandet) som "lav yield" i baner 3 og 10, typisk avkastning i baner 1, 4, 5, 6 og 8 eller "høy avkastning" i kjørefelt 2, 7, 9, 11 og 12. For eksempler med 'typisk gir' bruk 10-15 µL av sonden fortynnet i 100 µL av hybridisering løsning for hvert i situ eksperiment. Fortynne prøver med "høy avkastning" av sonde med ekstra hybridisering løsning ifølge bandet intensiteten i forhold til en "typisk sonde" intensitet. Mål å ha omtrent lik siste sonde konsentrasjoner i hver brønn. Pilen peker til en av 'RNA sonder', høyere bandet på hver bane er den opprinnelige DNA-malen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Store trinnene for en storstilt embryoet samling og fiksering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Hjemmelaget rør for å fjerne væske fra larver eller flytende vev. Noen larver og voksne vev flyter i løsningen under fiksering. Dette enkle verktøyet består av en nylon maske holdt av en 200 µL kutte spissen, fulgt av en 1 mL-tips som en adapter til å koble til en aspirator. Flytende kan trygt fjernes uten å miste noen vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Tyramide Signal forsterkning. (1) grave-merket antisense RNA sonde arten endogene følelse RNA. (2) Immuno-affinitet binding mellom biotin-konjugerte primære antistoff og grave-UTP. (3) HRP konjugert streptavidin binder biotin. (4) HRP gir cyanine 3-tyramide og hydrogen peroxide reaksjonen å danne kortvarig cyanine 3-tyramide radikaler. (5) cyanine 3-tyramide radikaler binde til tyrosin rester på nærliggende proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representant i situ hybridisering bilder. Hvert panel viser et eksempel på en annen RNA (vist i Cyan) og kjerner med DAPI (vises i rødt). (A-C) Eksempler på tidlig Drosophila embryo. (D, F) Eksempler på slutten Drosophila embryoer. (G-J) Eksempler på 3rd skikkelsen Drosophila larver vev (malphigian tubuli, midttarmen, salivary kjortelen og muskel henholdsvis). (K) voksen eggstokken. (L) voksen testikkel. Hvert panel viser navnet på genet som sonden er hybridizing til. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Beskrevet protokollen inneholder en svært reproduserbare, følsom og økonomisk metode for påvisning av de fleste RNAs i fast Drosophila embryo eller vev. Selv om litt mer komplisert enn mer tradisjonelt brukt alkalisk fosfatase metoden av sonden, oppløsningen ved fisk er langt større og følsomheten er tilsvarende eller bedre 7,8. Ved å bruke hele og delvise microtiter plater, kan protokollene brukes for store eller begrenset analyser av gener av interesse. Det bør bemerkes at sonder generert oppdager alle eller flere transkripsjon skjøte danner med mindre sonder er mer spesielt utformet (dvs. enkel exons). Selv om vi har testet sonder så lite som 200 nukleotider med rimelig vellykket, mindre sonder pleier å være mindre effektiv og kan være mindre spesifikk. Tydelig, denne protokollen er ikke riktig for påvisning av små introns, exons, eller behandlet microRNAs.
Selv om denne tilnærmingen bruker en enzymatisk skritt for å øke styrken på signalene, synes signalet intensitet å være proporsjonal med målet genuttrykk i et relativt lineære og bredt spekter av uttrykk. Ved høyere forstørrelse, signalet er sett på som puncta eller flekker i celler og vev. Relativt sjeldne transkripsjoner er bare noen små puncta sett. Som transkripsjon overflod vokser dette i antall og størrelse. Som med ett molekyl fisk (smFISH), enkelt små puncta kan også tilsvarer én RNAs og bør også lett kvantifiseres bruker bildebehandling og informatikk. Sammenligninger av publiserte bilder hentet ved hjelp av smFISH med bilder som vi har kuratert for samme mål foreslår at samlet, følsomhet og oppløsning av de to metodene er relativt lik, men dette bør testes av strengere sammenligninger. Gitt mye høyere bekostning av smFISH, bør metoden her gi lignende resultater på en brøkdel av prisen. Hvis målet er å oppdage små utskrifter eller atskilte deler av transkripsjoner, anbefales imidlertid smFISH.
På grunn av mindre størrelsen av noen fisk sonder, kan denne metoden også være bedre på gjennomtrengende vev som er store eller har utfordringer. Men vår bruk av vaskemiddel nivået og vev fiksering og permeabilization tweaks synes å ha løst problemet. Til slutt, selv om utviklet for Drosophila vev, høy vaskemiddel bufferne beskrevet her for dissekert vev burde likeledes arbeide for Drosophila embryo som de fleste andre organismer og vev.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Midler støtte til dette prosjektet ble gitt av en bevilgning til HMK av den kanadiske institutter for helseforskning (gi MOPP 133473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
