O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.
Em nossos esforços para determinar os padrões de expressão e Localização subcellular da drosófila RNAs em uma base de todo o genoma e em uma variedade de tecidos, temos desenvolvido inúmeras modificações e melhorias para nossa original fluorescente in situ protocolo de hibridação (peixe). Para facilitar a taxa de transferência e custo eficácia, todas as etapas, desde a geração da sonda de detecção do sinal, são executadas usando placas de 96 poços da microplaca exon. Digoxygenin (escavação)-rotulados antisentido RNA sondas são produzidas usando clones de cDNA ou DNA genômico como modelos. Após a fixação de tecidos e permeabilização, sondas são hibridizadas para transcrições de interesse e então detectado usar uma sucessão de antianticorpo escavação conjugado com biotina, estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e conjugado fluorescente tyramide, que, na presença de HRP, produz um intermediário altamente reativo que vincula à regiões densa de elétron de proteínas imediatamente adjacentes. Estas etapas de amplificação e localização produzem um sinal robusto e altamente localizado que facilita a localização ambos transcrição celular e subcellular. Os protocolos fornecidos foram otimizados para produzir sinais altamente específicos em uma variedade de tecidos e estádios de desenvolvimento. As referências também são fornecidas para variações adicionais que permitem a detecção simultânea de várias transcrições, ou transcritos e proteínas, ao mesmo tempo.
Novos métodos de deteção de RNA de todo o genoma como RNA-seq expandiram enormemente nosso conhecimento de quando e onde os genes são expressos, e em que os níveis1. No entanto, estes fornecem relativamente pobre resolução temporal e espacial. RNA hibridação in situ permite a distribuição espacial de transcrições para ser observada visualmente em tecidos fixos, revelando os detalhes da localização celular e subcellular2. Usar hibridização fluorescente in situ (FISH) permite a resolução espacial ainda mais, pois permite o uso de técnicas de microscopia poderoso, como o de microscopia confocal e leve folha3. Marcadores fluorescentes como DAPI também podem ser usados para estabelecer relacionamentos subcellular4. PEIXES também facilita a observação de vários RNAs e proteínas simultaneamente com indicações claras de sobreposição a nível subcelular. Os reagentes originais e etapas necessárias para a dupla-rotulagem podem ser encontradas no seguinte referências3,5.
Os procedimentos descritos aqui utilizam placas de 96 poços da microplaca para todas as etapas, incluindo a produção de modelo de cDNA (PCR de Colônia), produção de sonda RNA (usando a transcrição de escoamento dependente do polymerase T7, T3 ou SP6), hibridização in situ , e desenvolvimento do sinal fluorescente. Um número suficiente de embriões ou tecidos é adicionado a cada bem da placa de 96 poços para permitir a avaliação da consistência e variabilidade. Bem, então, cada um recebe uma sonda diferente. Após o desenvolvimento do sinal, embriões ou tecidos de cada poço são dispostos em corrediças do microscópio individuais para análise microscópica.
O uso de amplificação de sinal tyramide (TSA) para a deteção de sonda produz sinais robustos com excepcional resolução subcellular 5,6,7,8. A Localização subcellular de RNAs é um importante mecanismo regulatório 9 que parece ocorrer com praticamente todos os RNAs 4,10,11. Essas análises também mostraram que muitas transcrições não são detectados pelo RNA-seq são prontamente detectadas pelo peixe 8. A adaptação de hibridação in situ RNA para placas de 96 poços permite a análise de até 96 genes de interesse numa altura (placas mais se adicionais são usadas), possibilitando a análise de grandes conjuntos de dados. Cortando as placas em seções menores, o método é também facilmente adaptado para apenas algumas amostras. O protocolo fornecido é adequado para a análise das distribuições de RNA na maioria dos tipos de tecidos. Embora não mostrado, é adaptável aos não – tecidos deDrosophila também.
O protocolo descrito fornece um método altamente reprodutível, sensível e econômico para a detecção da maioria dos RNAs em embriões da drosófila fixo ou de tecidos. Embora um pouco mais complicado do que o mais tradicionalmente utilizado método de fosfatase alcalina da deteção de sonda, a resolução obtida por peixe é muito maior e a sensibilidade é comparável ou melhor 7,8. Usando placas de microtitulação total ou parcial, os protocolos podem ser usados para análises em larga escala ou limitadas de genes de interesse. Deve-se notar que as sondas geradas podem detectar todos ou tala de transcrição múltiplos formulários a menos que sondas destinam-se mais especificamente (ou seja, único exões). Embora nós testamos sondas tão pequenas quanto 200 nucleotídeos com razoável sucesso, sondas menores tendem a ser menos eficaz e podem ser menos específicas. Claramente, este protocolo não é apropriado para a detecção de pequenas intrões, exões, ou processado microRNAs.
Embora esta abordagem usa um passo enzimático para aumentar a força dos sinais, intensidade de sinal parece ser proporcional à expressão do gene alvo em uma escala relativamente ampla e linear dos níveis de expressão. A maior ampliação, o sinal é visto como partitura ou speckles dentro de células e tecidos. Para transcrições relativamente raras são vistos apenas alguns pequenos partitura. Como aumenta a abundância de transcrição, estes crescem em número e tamanho. Assim como única molécula peixe (smFISH), única pequena partitura também pode corresponder ao único RNAs e deve também ser facilmente quantificada usando software de imagem e informática. Comparações de imagens publicadas obtidas usando smFISH com imagens que nós temos com curadoria para os mesmos objectivos de sugerem que a geral, a sensibilidade e a resolução dos dois métodos são relativamente semelhantes, embora isto deve ser testado pelo comparações mais rigorosas. Tendo em conta a despesa muito maior de smFISH, o método fornecido aqui deve dar resultados semelhantes em uma fração do custo. No entanto, se o objetivo é detectar pequenas transcrições, ou partes distintas de transcrições, smFISH é recomendado.
Devido ao tamanho menor de algumas sondas de peixe, este método também pode ser melhor em tecidos penetrantes que são grandes ou têm barreiras significativas. No entanto, nosso uso de níveis mais elevados de detergente e ajustes de fixação e permeabilização do tecido parecem ter resolvido este problema. Finalmente, embora desenvolvido para tecidos de Drosophila , os buffers de detergente altos descritos aqui para tecidos dissecados devem funcionar também para os tecidos, bem como a maioria dos outros organismos e embriões da drosófila .
The authors have nothing to disclose.
Apoio para este projeto de financiamento foi fornecido por uma concessão para HMK pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder 133473 MOP).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |