Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

doi: 10.3791/56281 Published: October 19, 2017

Summary

Beskrivna RNA i situ hybridisering protokollet tillåter påvisande av RNA i hela Drosophila embryon eller dissekerade vävnader. Med 96 brunnar mikrotiter plattor och tyramide signal förstärkning, kan avskrifter upptäckas på hög upplösning, känslighet och genomströmning och på en relativt låg kostnad.

Abstract

I våra ansträngningar för att fastställa mönster av uttryck och subcellulär lokalisering av Drosophila RNAs på basis av genome-wide, och i en mängd olika vävnader, har vi utvecklat ett flertal ändringar och förbättringar till våra ursprungliga fluorescerande på plats hybridisering (FISH)-protokollet. För att underlätta genomströmning och kostnadseffektivitet, utförs alla steg, från sonden generation signal upptäckt, med exon 96 brunnar mikrotiter plattor. Digoxygenin (DIG)-märkta antisense RNA sonder tillverkas med hjälp av cDNA kloner eller genomiskt DNA som mallar. Efter vävnad fixering och permeabilisering, sonder är hybridiseras till avskrifter av intresse och sedan identifierade med hjälp av en rad anti gräva antikropp konjugerat med biotin, streptividin konjugerat med pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorescently konjugerade tyramide, som i närvaro av HRP, producerar en mycket reaktiva intermediären som binder till elektron tät regioner i omedelbart angränsande proteiner. Dessa förstärkning och lokalisering steg producera en robust och starkt lokaliserad signal som underlättar både cellulär och subcellulär avskrift lokalisering. De protokoll som har optimerats för att producera mycket specifika signaler i en mängd olika vävnader och utvecklingsstadier. Referenser finns också för ytterligare varianter som tillåter samtidig upptäckt av flera avskrifter, eller avskrifter och proteiner, på samma gång.

Introduction

Ny genome-wide RNA upptäckt metoder såsom RNA-seq har kraftigt utökat vår kunskap om när och var generna uttrycks, och på vilka nivåer1. Dessa ger dock relativt dålig temporal och spatial upplösning. RNA in situ hybridisering tillåter rumslig distribution av avskrifter observeras visuellt i fasta vävnader, således avslöja detaljerna i cellulär och subcellulär lokalisering2. Med fluorescerande in situ hybridisering (FISH) tillåter ännu mer rumslig upplösning eftersom det tillåter användning av kraftfulla mikroskopi tekniker, såsom confocal och lätta blad mikroskopi3. Fluorescerande markörer såsom DAPI kan också användas för att fastställa subcellulär relationer4. FISK underlättar också observationen av flera RNAs och proteiner samtidigt med tydliga indikationer överlappning på subcellulär nivå. Unika reagenser och steg som krävs för dubbel-märkning kan hittas i följande referenser3,5.

De förfaranden som beskrivs här utnyttja 96 brunnar mikrotiter plattor för alla åtgärder, inklusive cDNA mall produktion (koloni PCR), RNA sonden produktion (med T7, T3 eller SP6 polymeras-beroende avrinning transkription), in situ hybridisering, och fluorescerande signal utveckling. Tillräckligt antal embryon eller vävnader läggs till var väl av plattan med 96 brunnar att möjliggöra bedömning av konsekvens och variabilitet. Var och en får väl sedan en annan sond. Efter signal utveckling, är embryon eller vävnader från varje brunn klädd på enskilda objektglas för Mikroskopisk analys.

Användning av tyramide signal amplifiering (TSA) för probe identifiering producerar robusta signaler med enastående subcellulär upplösning 5,6,7,8. Subcellulär lokalisering av RNAs är en viktig reglerande mekanism 9 som verkar uppstå med praktiskt taget alla RNAs 4,10,11. Dessa analyser har också visat att många avskrifter som inte upptäcks av RNA-seq upptäcks lätt genom fisk 8. Anpassning av RNA i situ hybridisering till 96 brunnar tillåter analys av upp till 96 gener av intresse samtidigt (mer om ytterligare plattor används), möjliggör analys av stora datamängder. Genom att minska plattorna i mindre delar, är metoden också enkelt anpassas efter bara några prover. Protokollet som är lämpliga för analys av RNA-distributioner i de flesta typer av vävnader. Även om det inte visas, är det anpassningsbar till icke -Drosophila vävnader samt.

Protocol

1. PCR-amplifiering av cDNA mallar från plasmider

Obs: använda hög kvalitet plasmid eller PCR-genererade DNA mallar för RNA sond syntes. Drosophila gen samling (DGC) bibliotek genereras av Berkeley Drosophila genomprojektet ger täckning av de flesta kodande gener hittade i Drosophila genomet (se tabell 1a). Dessa tillåter även användning av universella primers för förstärkning av någon cDNA infoga. Dessa PCR kompletteringar utförs på plasmid DNAs finns i lysates av plasmid-innehållande bakteriekulturer. De DNA-produkterna som sedan används som mallar för in vitro- transkription för att generera antisense RNA sonder (se Tabell 1b).

  1. Design grundfärger att förstärka en specifik exon region av en gen av intresse av PCR (t.ex. från genomiskt DNA), helst med webbplatsen T7 polymeras erkännande på antisense slutet.
  2. För experiment med färre än 96 prover, klippa bort onödiga delar av 96 brunnar. Täck plattorna med tätning band (se material) för alla inkubationer och lagring. Om mikrocentrifugrör används, justera volymerna.
    Obs: 96 brunnar tillåter användning av multikanal för ökad genomströmning, liksom mindre volymer för kostnadsbesparing.
tabell 1a

Vector
Antibiotika
arbetar koncentration 1: 1000

Primers
RNA-polymeras
för
antisense
RNA-polymeras.
för
känsla
pFLC-jag Amp pBst_SK (-) _F/R T3 T7
pBSt(-) Amp pBSt_SK(-) T7 T3
pOT2 Klor pOT2_F/R SP6 T7
pOTB7 Chlor pOT2_F/R T7 SP6
Tabell 1b
Primer sekvens
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Omvänd 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

tabell 1: A) allmänna DGC klon information för förstärkande cDNA infogas i plasmider. (B) sekvenser av universella Primers för DGC plasmider.

  1. växa 250 µL av Plasmiden innehåller bakteriekulturen i 96 brunnar kultur plattor genom att lägga till 240 µL LB media per brunn med rätt antibiotika val (1: 1000 utspädning av en 1000 X antibiotika lager), och 10 µL av ursprungligen plasmid-innehållande bakterier (från en glycerol lager). Tätning med tätningsband.
  2. Inkubera genom att skaka på 215 rpm vid 37 ° C över natten (O/N).
    Obs: Göra en ny kopia av bakteriell glycerol cDNA plasmid klon lager ersätta ursprungliga. Inte frysas ursprungliga bakteriell lager, eftersom detta kan döda bakterier.
  3. Att producera PCR-mallarna, späd 10 µL av den O/N bakteriella kulturen i 90 µL Ånghärdad ddH 2 O i varje brunn för en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Denature DNA för 5 min vid 95 ° C i termocykler. Placera omedelbart plattan på is i minst 5 min.
  4. Förbered PCR reaktioner med lämpliga universella primers enligt tabell 2.
< /TR >
reagens 50 µl prov reaktion 96 väl blanda
(112 x reaktion)
slutlig koncentration
2 X PCR polymeras Mix 25 μl 2800 μl 1 X
Primer_For (25 pmol/μl) 0,5 μl 5 6 μl 0,25 pmol/μl
Primer_Rev (25 pmol/μl) 0,5 μl 56 μl 0,25 pmol/μl
ddH2O 22 μl 2464 μl
totalt 48 µl 5376 μl

tabell 2: PCR Master Mix.

  1. med pipett alikvotens 48 µL av PCR huvudmixen i varje brunn för en ny PCR-plattan med 96 brunnar. Tillsätt 2 µL av varje denaturerat plasmid DNA mall per brunn.
    Obs: Användning mellan 1 pikogram (pg) till 1 nanogram (ng) av plasmid DNA. Överdriven DNA mall minskar PCR avkastning och specificitet.
  2. Programmera 96 brunnar PCR-maskinen enligt tabell 3 och utföra förstärkning.
    Obs: Förlängning tiden vid 72° C bestäms av storleken på PCR-produkten (45 s för ≤ 2.0 kb, 1,5 min för ≤ 3,0 kb, 3 min för ≤ 4,0 kb och 3,5 min för 4,0-5,0 kb). Glödgning temperaturen (Tm) bestäms av en sekvens av primers. När en primer är lika med eller längre än 20 nt, Tm beräknas som:
    Tm (° C) = (4 X antal CG) + (2 X antal AT) -4.
< td rad span = ”3” > 30 cykler
steg temperaturen tid cyklerna
Inledande denaturering 95 ° C 3 min 1 cykel
förstärkning
denaturering, glödgning och förlängning
95 ° C 45 SEK
54-58 ° C 45 SEK
72 ° C 45 SEK-3,5 min
Slutliga förlängning 72 ° C 7 min 1 cykel
Förvaring 4 ° C hålla

tabell 3: rekommenderas PCR Program.

  1. PCR-produkt nederbörd med etanol (EtOH) och natrium acetat (NaOAC) (se tabell 4).
    Obs: Om PCR-reaktion volymen är mindre än 50 µL, fyll till 50 µL med ddH 2 O.
    1. Till fällningen DNA, blanda komponenter från tabell 4 och store prover O/N vid-20 ° C eller för 30 min vid-80 °C.Centrifuge plattan med 96 brunnar för 45-60 min vid 2 250 x g vid 4 ° C. användning 8-kanal grenrör pipett till cuträtat avlägsna supernatanten. Tvätta en gång med 160 µL kallt 70% EtOH (RNase-fri) för 30 min vid 2 250 x g vid 4 ° C.
      Obs: Den utfällda DNA kan ses på botten av brunnarna. Kortare PCR-produkter kräver längre centrifugations.
    2. Vänd försiktigt på plattan med 96 brunnar på en pappershandduk för att avlägsna de sista dropparna av vätska i varje brunn (som möjligt). Luften torr DNA pelleten för 1 h i rumstemperatur (RT). Återsuspendera utfällda DNA i 25 µL RNase gratis vatten.
      Obs: 1 h luften torr gör att alla spår av EtOH avdunsta. En mycket liten mängd vätska (ca 1 µL) bör dock i varje brunn för att förhindra DNA pelleten helt torkar. Använda 25 µL för en 50 μl PCR-reaktion. Använd inte DEPC behandlat vatten i detta skede undvika störningar med in vitro- transkription i följande steg.
komponent luftavolym Portion
PCR 50 μl
100% etanol 125 μl 2,5 X vol. av PCR-
3 M NaOAc (pH = 5.2, RNase gratis) 5 μl 10% av vol. av PCR
totalt 180 μl

tabell 4: exempel på en 50 μl PCR-reaktion.

  1. Kontrollera storlek och avkastningen av PCR-produkter genom att köra 5 µL av den återsuspenderade DNA-lösningen på en 1% agarosgel i 1 X TAE buffert.
    Obs: Sammanlagt 250-500 ng DNA mall krävs för 15 µL i vitro transkription reaktionen. Prover med högre avkastning kan spädas ytterligare. RNA avkastningen beror också på sekvens och längd av mallen DNA. Enligt den allmänna handledningen för gräva-RNA märkning med T7 RNA-polymeras, cirka 10 µg av gräva-märkt RNA tillverkas från 1 µg linearized mall.

2. In vitro transkription att generera antisense sonder.

Obs: det är viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö. Alla reagenser och lab-ware vara RNase gratis (till exempel certifierade DNAS/RNase gratis plastartiklar).

komponent lager koncentration volym Slutlig koncentration
ATP 100 mM 7 μl 10 mM
CTP 100 mM 7 μl 10 mM
GTP 100 mM 7 & # 956; l 10 mM
UTP 100 mM 4,5 μl 6,5 mM
Gräva-11-UTP 10 mM 25 μl 3,5 mM
RNase gratis vatten < /td > 19,5 μl
Summa 70 μl

tabell 5: gräva-NTP Mix förberedelse.

< tabell Border = ”1” fo:keep-together.within-sida = ”1” fo:keep-med-next.within-sida = ”always” > komponent 15 μl reaktion 96 väl blanda
(112 x reaktion)
Slutliga konc. 5 X transkription buffert 3.00 μl 3.00 μl 1 x gräva-NTP blanda (10 mM) 0,75 μl 0,75 µl 0,5 mM RNase inhibitor 0,25 μl 0,25 μl 0,67 U / μl RNA-polymeras (T7 eller T3 eller SP6) 2.00 μl 2.00 μl 2,67 U / μl RNase gratis vatten 1.50 μl 1.50 μl Totala 7.50 μl 7.50 μl

tabell 6:2 X transkription Master Mix.

  1. Förbered DIG-NTP mix enligt tabell 5.
    Obs: För att undvika misstag, alltid justera plattan så att A1 är i det övre vänstra hörnet av plattan.
  2. Lägg till komponenter som beskrivs i tabell 6 till varje brunn i en ny PCR-plattan med 96 brunnar (sonden plattan). Lägg till 7,5 µL av PCR-produkten (DNA-mallen) till varje motsvarande väl, med hjälp av en flerkanalspipett. Täcka plattan med tätningsband.
    Obs: Den optimala mängden PCR-produkten tillsatts per transkription reaktion bör vara mellan 0,5 och 1 µg. Om band på gelen är betydligt svagare eller mer intensiv, kan volymen av DNA till reaktionen justeras. Det exakta beloppet inte är kritisk.
  3. Inkubera sonden plattan vid 37 ° C för 3.5-4 h. Mix 15 µL av syntetiserade sonden med 35 µL av DEPC behandlas ddH 2 O, 125 µL av 100% EtOH och 5 µL 3 M NaOAC (pH = 5.2, RNase gratis). Förvaras vid-80 ° C i minst 30 min. Centrifugera och tvätta enligt beskrivningen i steg 1.10.2 och 1.10.3.
  4. Omsuspendera utfällda sonden i 25 µL av DEPC behandlas ddH 2 O. kör 5 µL på en 1% agarosgel (gångtid < 20 min) att kontrollera integritet och avkastningen av sonden ( figur 2).
    Obs: Agarosgel måste göras med DEPC behandlas ddH 2 O och TAE buffert. Gel-elektrofores apparater ska tilldelas för RNA endast fungera. Längre gel gångtid vid låg hastighet kan leda till RNA nedbrytning under elektrofores.
  5. Blanda de återstående 20 µL av syntetiserade sonden med 100 µL hybridisering lösning (tabell 7) och förvaras vid-80 ° C tills behövs.
    Obs: Sonden koncentrationen kan spädas mer om banden är särskilt robust (se figur 2 för exempel). Hybridisering lösning är mycket effektiv på att RNase förorening. Tillsätt omedelbart hybridisering lösning till återsuspenderade sonden att undvika RNA nedbrytning. Hybridisering lösning måste filtreras genom ett 0,2 µm filter. För vävnadsprover, öka koncentrationen av rengöringsmedel i hybridisering lösningen genom att lägga till Triton-X-100 till en slutlig koncentration på 0,3%.
komponent volym slutlig koncentration
DEPC behandlad ddH2O 11.85 ml 23,7%
20 X SSC 12,5 ml 25% (5 X)
Formamid 25 ml 50%
Heparin (50 mg/ml) 0,1 ml 0. 2% (0,1 mg/ml)
Lax spermier enda stranded DNA 0,5 ml 1,0%
Tween-20 0,05 ml 0,1%
Totalt 50.00 ml 100%
< p class = ”jove_content-fo:keep-together.within-sida = ”1” > tabell 7: hybridisering lösning.

3. drosophila uppfödning och embryo, larv och vuxen vävnad samling.

Obs: för både liten skala (flaskor) och vikt (lådor) flyga uppfödning, använder standard flyga lab protokoll på majsmjöl baserat mat på 25 ° C. hålla ordentlig vuxna och larver densitet och ger ytterligare aktiv jäst pulver på mat ytor.

  1. Samla embryon efter standardprotokoll. De stora steg för embryosamling illustreras i figur 3.
    Obs: Efter sköljning devitillinized embryon i metanol, fast embryon kan lagras vid-20 ° C i upp till ett år. Embryo permeabilisering och efter fixering utförs på dag 1 av protokollet fisk.
  2. Förbereda färska 40% PFA stamlösning.
    1. Förbered en nybryggd stamlösning av 40% PARAFORMALDEHYD (PFA) genom att blanda 10 mL DEPC behandlas ddH 2 O-3.68 g av PFA och 70 µL av 2N KOH i en 20 mL scintillation injektionsflaska av glas innehållande en liten uppståndelse baren
      Varning: PFA är mycket giftiga med potentiella akuta och kroniska hälsoeffekter. Läsa MSDS (Material säkerhetsdatablad) och använda med lämpligt skydd för ögon, hud och andningsorgan.
    2. i ett dragskåp, Värm och rör injektionsflaskan för 3-5 min på en värmeplattan vid 200 ° C tills PFA är helt upplöst. Ta bort PFA stamlösning från värmen så fort PFA är upplöst (inte överhettas).
    3. Cool upplöst 40% PFA stamlösning på is för 5 min och filtrera med en 0,2 µm filter och 10 mL spruta.
  3. Tredje instar larver (L3) eller adult vävnad fixering, snabbkylning och permeabilisering
    Obs: detta protokoll bör vara klar på en dag. Den innehåller vävnad dissektion, fixering, snabbkylning av endogena HRP, permeabilisering och efter fixering.
    1. Förbered fastställande lösningar (Fix-I och Fix-II) enligt tabell 8.
      Obs: pikrinsyra används som en ytterligare fixativ när vävnad har en känslig struktur som måste bevaras. Det är inte en bra fixativ när vävnad ultrastruktur måste bevaras för elektronmikroskopi (EM).
      Varning: pikrinsyra är instabil och har förmågan att reagera med andra material och skapa explosiva föreningar. Använda och förvara enligt säkerhetsriktlinjerna.
    2. Plats larver eller vuxna flugor i ett 50 mL plaströr som innehåller 10 mL kallt 1 X PBS och 100 µL av Fix-jag lösning. Chill på is i 2 min att minska larver eller vuxen fluga motilitet.
    3. Skär av spetsen på en 1 mL plastspets att skapa en 2-3 mm öppning. Överför 10-30 larver eller vuxen flyger med 1 mL spetsen i en petriskål (9 cm diameter) med ett ytligt lager av 1 X PBS från 50 mL röret (steg 3.3.2). Att lägga till lite av PBTT kan minska ytspänningen. Noggrant dissekera larver (öppna från främre och pressa vävnader från bakre till främre) eller vuxna vävnader av intresse med ett par vassa pincetten under en dissekera omfattning.
      Obs: Ca 200-300 larver eller vuxen testiklarna kan dissekeras och fast i en dag av erfarna individer.
    4. Överföring dissekeras vävnader med 200 µL pipett (med spetsen avskurna för att skapa en 2 mm diameter öppning) i en 1,5 mL tub och store på isen. Slutföra varje runda av dissektion inom 10-15 min innan du går vidare till nästa steg.
      Obs: Fortsätta med ytterligare rundor (inom en 2 h tidsramen) som krävs för att generera tillräckligt med material.
    5. Reparation av vävnader med 800 µL av Fix-jag lösning under 30 minuter på en bänk topp mixer. Skölj vävnader när med 800 µL 1 X PBTT och hålla rören på isen maximalt 2,5 h. på grund av de 30 min begränsa, detta måste utföras batch-wise tills tillräcklig vävnad har samlats.
    6. Pool alla dissekeras och fasta vävnader i ett enda 15 mL plaströr som innehåller mesh i locket (se figur 4 för röret design). Sug ut överflödig vätska genom maskorna i tube locket. Tvätta 3 X 5 min varje med 10 mL av 1 X PBTT. Skölj två gånger med 10 mL 1 X PBS ta bort rengöringsmedel. Detta förhindrar överflödigt bubblor i nästa steg.
      Obs: Om dissekerade vävnader sjunker till botten av röret, steg kan utföras i regelbundna mikrotiter plattor eller 0,5-1,5 mL mikrocentrifugrör (300-800 µL volym per rör).
    7. Släcka endogena HRP aktivitet med 5 mL 0,3% H 2 O 2 i PBS för 15 min på RT. Repeat en gång till. Hålla locket öppet under detta steg utan att blanda. Skölj två gånger med 10 mL 1 X PBTT. Tvätta två gånger för 5 min med 10 mL av 1 X PBTT.
    8. Permeabilize vävnader med 10 mL 80% aceton (-20 ° C, före kylda) vid-20 ° C i 10 min. Vänd tuben två gånger under inkubationstiden. Tvätta två gånger i 10 min med 10 mL av 1 X PBTT att rehydrera vävnader.
    9. Skölj med 10 mL blandning av 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisering lösning (1:1). Kassera mix och Ersätt med 10 ml hybridisering lösning. Prover kan förvaras vid-20 ° C tills den behövs. För bästa resultat, inte lagra prover för mer än en vecka.
komponent fixa jag (10 ml) fixa II (10 ml)
40% PFA lager 1 ml 1 ml
PBTT 8,99 ml 9 ml
pikrinsyra lösning 10 μl
< p class = ”jove_conte NT ”fo:keep-together.within-sida =” 1 ”> tabell 8: fastställande lösningar för vävnader.

4. in situ hybridisering

Obs: denna del av protokollet kräver minst 2 dagar, med provberedning, före hybridisering och hybridisering tar plats på dag 1 och sonden upptäckt på dag 2. Om antalet prov är relativt hög, om obekanta med protokollet, eller en hel dag är inte möjligt, bör protokollet utföras i 3 dagar med steg av probe identifiering och signal förstärkning uppdelad i 2 dagar. Stort antal embryon eller dissekerade vävnadsprover kan också kräva ytterligare dagar att behandla. För dissekerade vävnadsprover, ersätta 1 X PBT med 1 X PBTT i alla steg, om inte annat anges. Det extra rengöringsmedlet krävs för penetration av många larver och vuxna vävnader, såsom hjärnan och testiklarna. Även om inte testade, 1 kan X PBTT också användas för embryon. Använd 100 µL per brunn för 96 brunnar och 800 µL för 1,5 mL rör.

  1. Pre hybridisering och hybridisering
    Obs: steg 4.1.1-4.1.6.2 är för embryo i situ hybridisering. För larver eller adult vävnad i situ hybridizations, hoppa över dessa steg.
    1. Ta bort 2 mL av fasta embryon (lagrade i metanol vid-20 ° C) till en ny 15 mL tub. Tvätta embryon två gånger för 7 min med 10 mL metanol i varje tvätt. WASH embryon för 7 min med 10 mL blandning av metanol och 1 X PBTT (1:1). Tvätta embryon två gånger för 7 min med 10 mL av 1 X PBTT att rehydrera.
    2. För embryo permeabilisering, förbereda en mellanliggande proteinas K lösning (40 µL/mL) genom spädning 1: 500 från stamlösning (20 mg/mL). Förvaras vid -20 ° C. gör en fungerande proteinas K lösning genom att späda ut mellanliggande proteinas K lösningen 1/15 i 1 X PBTT för en slutkoncentration arbetar på 2.667 ug/mL.
    3. Permeabilize embryon med 10 mL arbetar proteinas K lösning (Använd mindre för mindre antal embryon). Inkubera röret på RT för 13 min. Vänd försiktigt röret 4 gånger under ruvningen. Inkubera proverna i proteinas K lösning på is för 1 h utan blandning.
      Obs: Denna relativt lång inkubation med utspädd proteinas K säkerställer reproducibly enhetliga permeabilisering och efterföljande färgning.
    4. Medan embryon permeabilize, göra en 2 mg/mL glycin lösning från 10 X lager (20 mg/mL) i 1 X PBTT för en total volym på 30 mL.
    5. Ta bort proteinas K lösning, skölj med 10 mL glycin lösning (2 mg/mL) och tvätta två gånger under 2 min varje. Skölj tre gånger med 10 mL 1 X PBTT att ta bort glycin.
    6. Efter fixering av embryon.
      1. Bereda 10 mL 4% PFA (1 mL av 40% PFA i 9 mL PBTT, filtreras genom 0.45 µm filter).
      2. Inkubera proverna i 4% PFA för 20 min. Tvätta 3 X 2 min varje med PBTT.
      3. Att förbereda denaturerat hybridisering lösning, koka hybridisering lösningen för 5 min. För en fullständig 96 brunnar plåt, Använd tre rör med 12 mL. Cool på is omedelbart för 5 min.
      4. Skölj embryon en gång med 10 mL 1 X PBTT: hybridisering lösning (1:1). Skölj två gånger med 5 mL hybridisering lösning. Alikvotens ~ 20 µL per brunn fast embryon (30-40 embryon) eller fasta vävnader i en PCR-plattan med 96 brunnar på is. Ta bort hybridisering lösning från vävnader eller embryon med hjälp av en 8-kanals grenrör pipett ( figur 1 / video).
        Obs: Grenrör pipetten har en ‘ stoppa ’ som förhindrar tips från att gå till botten av brunnarna och ta bort provet. För experiment med hjälp av vävnader som flyta, ta bort vätska noggrant med 100 µL pipett uppifrån.
    7. Tillsätt 100 µL av denaturerat hybridisering lösningen till varje brunn. Pre hybridisera embryon för minst 2,5-3 h vid 56 ° C med en torr bad värme enhet som innehåller metall pärlor (se material och figur 1).
    8. Denaturera 100 µL av den beredda sonden i en PCR-plattan med 96 brunnar med en termocykler för 5 min på 80 ° C. omedelbart cool på is för 5 min. Ta bort före hybridisering lösning från embryon eller vävnader. Lägg till denaturerat gen-specifika prober till varje prov, täck med tätningsband och hybridisera på 56 ° C i 16-18 h O/N, under metallkulor i torr bad värme affärsenhet

5. PROBE identifiering

  1. pre värma lösningarna i tabell 9 i enheten 56 ° C värme. Ta bort sonder från plattan.
    Obs: Sonder kan återanvändas mellan 2 - 3 gånger om lagras vid-80 ° C (aldrig store någon RNA prover i-20 ° C). Efter hybridisering, den dubbelsträngat RNA är mer stabil än enda strand RNA, och är mindre känsliga för nedbrytning, orsakad av RNase kontaminering.
    Om du använder en en flera dammsugarfilter plattsystem för vävnader, en samling platta bör ingå under filtret plattan att samla sonderna (se video för montering Detaljer). Hybridiserade vävnader kommer att behöva överföras från regelbundna 96 brunnar mikrotiterplattan används för hybridisering till en 1,2 µm porstorlek storlek PVDF hinnor på undersidan av varje brunn.
< t r >
steg före värmde lösning (56 ° C) tid Volym per brunn
1 Hybridisering lösning: PBTT (3:1) 15 min 100 μl
2 Hybridisering lösning: PBTT (3:1) 15 min 100 μl
3 Hybridisering lösning: PBTT (1:1) 15 min 100 μl
4 Hybridisering lösning: PBTT (1:3) 15 min 100 μl
5 PBTT 3 tvättar 5 min 100 μl

tabell 9: tvätta sonder efter hybridisering.

  1. om du använder normal plattor, tvätta prover enligt tabell 9 i ett värmeelement på 56 ° C. om använda vakuum grenrör, använda uppvärmda lösningar med vakuumsystem på bänken och ta bort lösningar omedelbart från nedan av vaccuum. Efter 3: e tvätten med 1 X PBTT, normala plätera kan tas bort från uppvärmningen affärsenhet
  2. Förbered antikroppar.
    1. Förbereda 11 mL primär antikropp lösning (2,5 µg/mL) från lager (1 mg/mL) genom att späda ut musen för biotin-konjugerad monoklonal anti gräva-antikropp (se material lista) i PBTTB (1: 400). Om bearbetning färre prover, justera volymerna.
    2. Förbereda 11 mL streptividin-HRP lösning (1 µg/mL) från lager (1 mg/mL) genom spädning 1: 1000 streptividin-HRP-konjugat (se material lista) i PBTTB. Om du använder färre prover, justera volymerna.
  3. Blockera embryon eller vävnader med PBTTB (1% skummjölk i 1 X PBTT) i 20 min på en bänk topp mixer på RT.
    Obs: Filter PBTTB med filterpapper (årskurs 3, 6 µm) innan du använder den på 96 brunnar filter plattor för att undvika igensättning av filter. I stället för PBTB, PBTTB (PBTB med ytterligare 0,3% Triton-X-100) används för alla vävnader under protokollet.
  4. Inkubera embryon eller vävnader i antikropp lösning (100 µL per brunn) för 2 h på bänk prov mixer. Skölj två gånger med 1 x PBTTB. Tvätta 3 X 5 min och 5 X 10 min med PBTTB. Inkubera embryon eller vävnader med streptividin-HRP-lösning (100 µL per brunn) för 1,5 tim med hjälp av en bänk prov mixer. Tvätta 2 X 5 min med PBTTB. Hålla prover i mörkret från denna punkt på.
    Obs: under alla antikropp tvättar, om vävnad förloras på grund av opacitet produceras av mjölk, prova tvätt utan mjölk (PBTT istället för PBTTB).
  5. Förbereda en DAPI lösning genom att späda 100 X DAPI i PBTTB (1: 100).
  6. Inkubera embryon eller vävnader med DAPI lösning (100 µL per brunn) för 15 min på en bänk prov mixer. Tvätta 4 X 10 min med PBTT. Lagra plattan med 96 brunnar med prover O/N vid 4 ° C eller Fortsätt till nästa steg.
    Obs: Förfarandet kan pausas här.

6. Påvisande av antikroppar med hjälp av tyramide (se figur 5)

Obs: här hemmagjord cyanin 3-konjugerad tyramide användes, som utarbetades enligt protokollet beskrivs i 12 . Om utför många experiment eller tester många prover, detta sparar en betydande mängd pengar och är effektiv jämfört med kommersiella reagenser (av erfarenhet). För färre experiment och prov, kommersiellt tillgängliga cyanin 3-tyramide kan användas (se material).

  1. Tvätta provet plattor 3 X 5 min med 1 X PBTT.
  2. Förbered tyramide aktiveringen buffert (aktivering buffert) innehållande 0,006% H 2 O 2 i PBTT (utspädd 30% (w/w) H 2 O 2 lager 1: 5000).
  3. < lJag > skölj plåtarna med aktiveringen bufferten.
  4. Förbered cyanin 3-tyramide lösning genom att späda ut det i aktiveringen buffert i en 15 mL tub.
    1. För embryon, använda 1: 80 utspädning (137 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). För larval vävnader, använda 1:150 utspädning (73 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). För vuxna testiklarna, använda 1: 200 utspädning (55 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). Använd 1:300 utspädning (36 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert) för vuxen äggstockar,.
  5. Inkubera prover med cyanin 3-tyramide-lösning för 2 h på bänk prov mixer. Skölj fyra gånger med PBTT. Tvätta 6 X 10 min med PBTT. Tvätta 3 X 5 min med PBS ta bort rengöringsmedlet.
  6. Tillsätt 150 µL per brunn av anti fade montering media. Hålla prover O/N vid 4 ° C att tillåta vävnader eller embryon att sjunka till botten av röret. Montera prover på objektglas (under dissekera omfattning för vävnader) och täck med täckglas. Försegla kanterna av täckglaset med genomskinligt nagellack.
  7. Bild med fluorescens Mikroskop.
    Obs: analysera negativ kontroll först för att få en uppfattning om ‘ icke-specifik ’ bakgrund.

Representative Results

Figur 6 visar exempel på resultat som erhållits med den här proceduren. De översta 3 panelerna visar exempel på tidiga Drosophila embryon (figur 6, paneler A-C), den nästa 3 paneler visar exempel sen Drosophila embryon med signaler i olika vävnader (amnioserosa, muskler och nervsystemet, respektive (figur 6, paneler D-F). Nästa är exempel från 3rd instar larval vävnader (figur 6, paneler G-J). Paneler K och L visar representativa bilder från vuxna könskörtlarna (äggstockar och testiklar, respektive). Hundratals bilder har laddats upp och kommenterad i vår sökbara 'fluorescerande i situ bananflugan databas' (flugfiska (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).

Figure 1
Figur 1. Disposition av fluorescerande i situ hybridisering (FISH) protokollet och nyckel utrustning. (A) PCR-amplifiering av cDNA. (B) In vitro transkription att generera gen-specifika antisense gräva - märkt RNA sonder i en plattan med 96 brunnar (foto av plattan visas i b). (C) och (D): vuxna (kvinnliga: manliga baserat 2:1. 300-400 flugor/flaska) flugor tillåts att para för 3-4 dagar. Embryon från en övernattning samling på standard majsmjöl mat vid 25 ° C överförs till en välventilerad plastlåda (1 L av majsmjöl mat i en container storlek: 8 ”X 8” X 3 ”LWH) eller till nya flaskor hålla en ordentlig larval densitet. För insamling av vävnad, bör aktiv jäst pulver strös ovanpå maten vid 24, 48 h efter värpning (AEL). (E-H): Fluorescerande i situ hybridisering experiment utförs över 3 dagar. Använd en PCR-plattan med 96 brunnar för embryon eller vävnader som inte flyter som visas i fotografiet b med 8-kanals hygienfilter (bild c). Vävnader som flyta, som de flesta larver vävnader, använder en filter-botten platta (fotografi i d) och ta bort vätska från botten med ett grenrör hygienfilter med lågt tryck (fotografi i e). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Bestämning av RNA sonden avkastning. Nyligen syntetiseras antisense RNA sonder observerats på en 1% agarosgel (5 µL/lane). Avkastningen kan kategoriseras (baserat på intensiteten i bandet) som 'låg avkastning' Lanes 3 och 10, ”typiska avkastning' Lanes 1, 4, 5, 6 och 8 eller 'hög kapacitet' i körfält 2, 7, 9, 11 och 12. För prover med 'typisk avkastning', Använd 10-15 µL av sonden utspädd i 100 µL av hybridisering lösning för varje i situ -experiment. Späd prover med 'hög avkastning' i sonden med ytterligare hybridisering lösning enligt bandet intensiteten i förhållande till en 'typisk sonden' intensitet. Sikta på att ha ungefär lika slutliga sonden koncentrationer i varje brunn. Pilen pekar mot en av de 'RNA sonderna', högre bandet på varje lane är den ursprungliga DNA-mallen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Stora steg för en storskalig embryosamlingsgrupper och fixering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Hemmagjord tube för att ta bort vätska från larver eller flytande vävnader. Vissa larver och vuxna vävnader flyta i lösningen under fixering. Detta enkla verktyg består av en nylon mesh innehas av en 200 µL skuren spets, följt av en 1 mL spets som en adapter för att ansluta till en insugningsventil. Vätska kan tas bort utan att förlora någon vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Tyramide Signal amplifiering. (1) gräva-märkt antisense RNA sond hybridizes med endogena känsla RNA. (2) Immuno-affinitet mellan biotin-konjugerad primär antikropp och gräva-UTP. (3) HRP konjugerat streptividin binder biotin. (4) HRP katalyserar cyanin 3-tyramide och väteperoxid reaktionen för att bilda kortlivade cyanin 3-tyramide radikaler. (5) cyanin 3-tyramide radikaler binda till tyrosin rester på närliggande proteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Representant i situ hybridisering bilder. Varje panel visar ett exempel på en olika RNA (visas i Cyan) och atomkärnor fläckade DAPI (visas i rött). (A-C) Exempel på tidiga Drosophila embryon. (D, F) Exempel på sena Drosophila embryon. (G-J) Exempel på 3rd instar Drosophila larval vävnader (malphigian tubuli, midgut, spottkörtel och muskel respektive). (K) vuxen äggstocken. (L) vuxen testiklarna. Varje panel visar namnet på den gen som sonden korsa till. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Protokollet beskrivs ger en mycket reproducerbara, känslig och ekonomisk metod för detektion av de flesta RNAs i fasta Drosophila embryon eller vävnader. Även om något mer komplicerat än mer traditionellt används alkaliskt fosfatas metod för identifiering av sonden, upplösningen erhålls genom fisk är långt större och känsligheten är jämförbara eller förbättrade 7,8. Med hjälp av helt eller delvis mikrotiter plattor, kan protokoll som användas för storskalig eller begränsade analyser av gener av intresse. Det bör noteras att de sonder som genereras kan upptäcka alla eller flera avskrift splice bildar såvida sonder är mer specifikt utformade (dvs enda exoner). Även om vi har testat sonder så liten som 200 nukleotider med rimlig framgång, mindre sonder tenderar att vara mindre effektiv och kan vara mindre specifik. Klart, detta protokoll är inte lämplig för detektering av små introner, exoner, eller bearbetade mikroRNA.

Även om detta tillvägagångssätt använder ett enzymatiska steg för att öka styrkan av signaler, tycks signalintensitet stå i proportion till målet genuttryck i ett relativt linjär och brett utbud av uttrycksnivåerna. Vid högre förstoring, signalen ses som puncta eller prickar inom celler och vävnader. För relativt sällsynta avskrifter ses endast några små puncta. Som avskrift överflöd ökar, växer dessa i antal och storlek. Som med enda molekyl fisk (smFISH), enstaka små puncta kan också motsvara enda RNAs och bör också lätt kvantifieras med hjälp av programvaran imaging och informatik. Jämförelser av publicerade bilder tagna med smFISH med bilder som vi har curerat för samma mål föreslår att den totala, känslighet och upplösning av de två metoderna är relativt lika, även om detta bör testas av strängare jämförelser. Med tanke på den mycket högre kostnaden av smFISH, bör den metod som anges här ge liknande resultat till en bråkdel av kostnaden. Om målet är att upptäcka små avskrifter, eller separata delar av avskrifter, rekommenderas dock smFISH.

På grund av den mindre storleken av vissa fisk-sonder, kan denna metod också vara bättre på penetrerande vävnader som är stora eller har betydande hinder. Vår användning av högre tvättmedel och vävnad fixering och permeabilisering tweaks verkar dock har löst problemet. Slutligen även utvecklat för Drosophila vävnader, bör de höga rengöringsmedel buffertar som beskrivs här för dissekerade vävnader också arbeta för Drosophila embryon samt de flesta andra organismer och vävnader.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Finansiering av stöd till detta projekt var som ett bidrag till HMK av kanadensiska institut för hälsa forskning (bevilja MOP 133473).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB15-500 Certified DNase and RNase free
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) Biomart (Canada) 141106-1K Certified DNase and RNase free
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes Frogga Bio TB50-500 Certified DNase and RNase free
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane EMD MILLIPORE MSBVS1210 Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues
96-well PCR plate (200 μl) Denville C18096-10
Acrodisc syringe filter (0.2 u) PALL PN4612
Acrodisc syringe filter (0.45 u) PALL PN4614
Agarose Bioshop AGA002.500
AXYGEN 96-well assay storage plates UltiDent Scientific 24-P96-450V-C To store bacterial glycerol stocks
AXYGEN Aluminum Plate Seals UltiDent Scientific 24-PCR-AS-200 To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) UltiDent Scientific 24-T205-WB-C To transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin Jackson ImmunoResearch Lab 200062156 Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution.
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) BrandTech Scientific Inc. 704526 To remove liquids from the top of 96-well PCR plates
Chloramphenicol Sigma-aldrich C1919 Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000)
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) Home made Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) Sigma-aldrich D2522 Antifade reagent in mounting media
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate Roche 11-209-256-910
Embryo collection cage Home made N/A Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate
Eppendorf centrifuge 5804 Eppendorf Model 5804 Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor
Formamide Bioshop FOR001.500
Glycerol Bioshop GLY002.4
Glycine Bioshop GLN001.500
Heparin Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution
Lab Armor Beads DiaMed LAA42370-001 Fill in heating unit
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer Fisher Scientific 50-998-347 Sample mixing
Mesh - 100 micons FlyStuff 57-103 For collecting embryos
Mesh - 800 microns SEFAR - Nytex 06-780/53 For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4.
Micro Cover Glasses VWR 48366-067 Size: 22 X 22 mm
Micro slides,frstd VWR 48312-003 Size: 25 X 75 mm
Multi-Well Plate Vacuum Manifold Pall Corporation P/N 5017 Remove liquid from bottom of 96-well filter plate
Paraformaldehyd (PFA) Bioshop PAR070.500 Fixation
PCR machine Bio-Rad Model: DNA Engine PTC-200 96-well plate PCR and probe denature
Picric acid solution Sigma-aldrich 80456 For tissue fixation I solution
Potassium Chloride (KCL) Bioshop POC308
PP lid for 96-well plates, 100/case UltiDent Scientific 24-P-LID-PP Lid for storing plates
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) UltiDent Scientific 825-1-50-5S Liquid handling
Progene Pierceable Aluminum Foil UltiDent Scientific 87-CFILM-AL Seal 96-well plate, DNase and RNase free
Proteinase K Sigma-aldrich P2308- 5MG Embryo permeabilization
RiboLock Ribonuclease Inhibitor Thermo Scientific EO0381 40 Unit/ul
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set Roche 11277057001 RNA probe sythesis
RNase free water GIBCO 10977015-500ml RNA probe sythesis
RNaseZap Ambion AM9780 Remove RNase contamination
Single stranded DNA from salmon testes Sigma-aldrich D9156 For hybridization solution
Skim milk (non fat power) Bioshop SKI400.500 Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) Bioshop SAA333 Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation
SP6 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0131 20 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand Bath VWR 13259-274. To fill the heating unit
Stereomicroscope & gooseneck light source Leica Model: MZ6 Tissue dissection and mounting
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate Molecular Probes S911 Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ.
T3 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0101 20 Unit/ul
T7 RNA Polymerase Thermo Scientific EP0111 20 Unit/ul
Tip station (10 ul) Axygen T-300-STK-S Certified DNase and RNase free
Tip station (200 ul) Sorbio 27770T Certified DNase and RNase free
Tips ( 1ml) Sorbio 10200 Certified DNase and RNase free
TRITON X-100 Bioshop TRX506 Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ
Tween 20 Bioshop TWN510 Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 Sigma-aldrich WHA1003917
Name Company Catalog Number Comments
Solutions Preparation
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C
1 X PBT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L) 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBT
1 X PBTTB (1L) 1 % Skim milk in 1 X PBTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
Hög upplösning fluorescerande <em>In Situ</em> hybridisering i <em>Drosophila</em> embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).More

Jandura, A., Hu, J., Wilk, R., Krause, H. M. High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification. J. Vis. Exp. (128), e56281, doi:10.3791/56281 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter