Beskrivna RNA i situ hybridisering protokollet tillåter påvisande av RNA i hela Drosophila embryon eller dissekerade vävnader. Med 96 brunnar mikrotiter plattor och tyramide signal förstärkning, kan avskrifter upptäckas på hög upplösning, känslighet och genomströmning och på en relativt låg kostnad.
I våra ansträngningar för att fastställa mönster av uttryck och subcellulär lokalisering av Drosophila RNAs på basis av genome-wide, och i en mängd olika vävnader, har vi utvecklat ett flertal ändringar och förbättringar till våra ursprungliga fluorescerande på plats hybridisering (FISH)-protokollet. För att underlätta genomströmning och kostnadseffektivitet, utförs alla steg, från sonden generation signal upptäckt, med exon 96 brunnar mikrotiter plattor. Digoxygenin (DIG)-märkta antisense RNA sonder tillverkas med hjälp av cDNA kloner eller genomiskt DNA som mallar. Efter vävnad fixering och permeabilisering, sonder är hybridiseras till avskrifter av intresse och sedan identifierade med hjälp av en rad anti gräva antikropp konjugerat med biotin, streptividin konjugerat med pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorescently konjugerade tyramide, som i närvaro av HRP, producerar en mycket reaktiva intermediären som binder till elektron tät regioner i omedelbart angränsande proteiner. Dessa förstärkning och lokalisering steg producera en robust och starkt lokaliserad signal som underlättar både cellulär och subcellulär avskrift lokalisering. De protokoll som har optimerats för att producera mycket specifika signaler i en mängd olika vävnader och utvecklingsstadier. Referenser finns också för ytterligare varianter som tillåter samtidig upptäckt av flera avskrifter, eller avskrifter och proteiner, på samma gång.
Ny genome-wide RNA upptäckt metoder såsom RNA-seq har kraftigt utökat vår kunskap om när och var generna uttrycks, och på vilka nivåer1. Dessa ger dock relativt dålig temporal och spatial upplösning. RNA in situ hybridisering tillåter rumslig distribution av avskrifter observeras visuellt i fasta vävnader, således avslöja detaljerna i cellulär och subcellulär lokalisering2. Med fluorescerande in situ hybridisering (FISH) tillåter ännu mer rumslig upplösning eftersom det tillåter användning av kraftfulla mikroskopi tekniker, såsom confocal och lätta blad mikroskopi3. Fluorescerande markörer såsom DAPI kan också användas för att fastställa subcellulär relationer4. FISK underlättar också observationen av flera RNAs och proteiner samtidigt med tydliga indikationer överlappning på subcellulär nivå. Unika reagenser och steg som krävs för dubbel-märkning kan hittas i följande referenser3,5.
De förfaranden som beskrivs här utnyttja 96 brunnar mikrotiter plattor för alla åtgärder, inklusive cDNA mall produktion (koloni PCR), RNA sonden produktion (med T7, T3 eller SP6 polymeras-beroende avrinning transkription), in situ hybridisering, och fluorescerande signal utveckling. Tillräckligt antal embryon eller vävnader läggs till var väl av plattan med 96 brunnar att möjliggöra bedömning av konsekvens och variabilitet. Var och en får väl sedan en annan sond. Efter signal utveckling, är embryon eller vävnader från varje brunn klädd på enskilda objektglas för Mikroskopisk analys.
Användning av tyramide signal amplifiering (TSA) för probe identifiering producerar robusta signaler med enastående subcellulär upplösning 5,6,7,8. Subcellulär lokalisering av RNAs är en viktig reglerande mekanism 9 som verkar uppstå med praktiskt taget alla RNAs 4,10,11. Dessa analyser har också visat att många avskrifter som inte upptäcks av RNA-seq upptäcks lätt genom fisk 8. Anpassning av RNA i situ hybridisering till 96 brunnar tillåter analys av upp till 96 gener av intresse samtidigt (mer om ytterligare plattor används), möjliggör analys av stora datamängder. Genom att minska plattorna i mindre delar, är metoden också enkelt anpassas efter bara några prover. Protokollet som är lämpliga för analys av RNA-distributioner i de flesta typer av vävnader. Även om det inte visas, är det anpassningsbar till icke –Drosophila vävnader samt.
tabell 7: hybridisering lösning. 3. drosophila uppfödning och embryo, larv och vuxen vävnad samling. Obs: för både liten skala (flaskor) och vikt (lådor) flyga uppfödning, använder standard flyga lab protokoll på majsmjöl baserat mat på 25 ° C. hålla ordentlig vuxna och larver densitet och ger ytterligare aktiv jäst pulver på mat ytor. Samla embryon efter standardprotokoll. De stora steg för embryosamling illustreras i figur 3. Obs: Efter sköljning devitillinized embryon i metanol, fast embryon kan lagras vid-20 ° C i upp till ett år. Embryo permeabilisering och efter fixering utförs på dag 1 av protokollet fisk. Förbereda färska 40% PFA stamlösning. Förbered en nybryggd stamlösning av 40% PARAFORMALDEHYD (PFA) genom att blanda 10 mL DEPC behandlas ddH 2 O-3.68 g av PFA och 70 µL av 2N KOH i en 20 mL scintillation injektionsflaska av glas innehållande en liten uppståndelse baren Varning: PFA är mycket giftiga med potentiella akuta och kroniska hälsoeffekter. Läsa MSDS (Material säkerhetsdatablad) och använda med lämpligt skydd för ögon, hud och andningsorgan. i ett dragskåp, Värm och rör injektionsflaskan för 3-5 min på en värmeplattan vid 200 ° C tills PFA är helt upplöst. Ta bort PFA stamlösning från värmen så fort PFA är upplöst (inte överhettas). Cool upplöst 40% PFA stamlösning på is för 5 min och filtrera med en 0,2 µm filter och 10 mL spruta. Tredje instar larver (L3) eller adult vävnad fixering, snabbkylning och permeabilisering Obs: detta protokoll bör vara klar på en dag. Den innehåller vävnad dissektion, fixering, snabbkylning av endogena HRP, permeabilisering och efter fixering. Förbered fastställande lösningar (Fix-I och Fix-II) enligt tabell 8. Obs: pikrinsyra används som en ytterligare fixativ när vävnad har en känslig struktur som måste bevaras. Det är inte en bra fixativ när vävnad ultrastruktur måste bevaras för elektronmikroskopi (EM). Varning: pikrinsyra är instabil och har förmågan att reagera med andra material och skapa explosiva föreningar. Använda och förvara enligt säkerhetsriktlinjerna. Plats larver eller vuxna flugor i ett 50 mL plaströr som innehåller 10 mL kallt 1 X PBS och 100 µL av Fix-jag lösning. Chill på is i 2 min att minska larver eller vuxen fluga motilitet. Skär av spetsen på en 1 mL plastspets att skapa en 2-3 mm öppning. Överför 10-30 larver eller vuxen flyger med 1 mL spetsen i en petriskål (9 cm diameter) med ett ytligt lager av 1 X PBS från 50 mL röret (steg 3.3.2). Att lägga till lite av PBTT kan minska ytspänningen. Noggrant dissekera larver (öppna från främre och pressa vävnader från bakre till främre) eller vuxna vävnader av intresse med ett par vassa pincetten under en dissekera omfattning. Obs: Ca 200-300 larver eller vuxen testiklarna kan dissekeras och fast i en dag av erfarna individer. Överföring dissekeras vävnader med 200 µL pipett (med spetsen avskurna för att skapa en 2 mm diameter öppning) i en 1,5 mL tub och store på isen. Slutföra varje runda av dissektion inom 10-15 min innan du går vidare till nästa steg. Obs: Fortsätta med ytterligare rundor (inom en 2 h tidsramen) som krävs för att generera tillräckligt med material. Reparation av vävnader med 800 µL av Fix-jag lösning under 30 minuter på en bänk topp mixer. Skölj vävnader när med 800 µL 1 X PBTT och hålla rören på isen maximalt 2,5 h. på grund av de 30 min begränsa, detta måste utföras batch-wise tills tillräcklig vävnad har samlats. Pool alla dissekeras och fasta vävnader i ett enda 15 mL plaströr som innehåller mesh i locket (se figur 4 för röret design). Sug ut överflödig vätska genom maskorna i tube locket. Tvätta 3 X 5 min varje med 10 mL av 1 X PBTT. Skölj två gånger med 10 mL 1 X PBS ta bort rengöringsmedel. Detta förhindrar överflödigt bubblor i nästa steg. Obs: Om dissekerade vävnader sjunker till botten av röret, steg kan utföras i regelbundna mikrotiter plattor eller 0,5-1,5 mL mikrocentrifugrör (300-800 µL volym per rör). Släcka endogena HRP aktivitet med 5 mL 0,3% H 2 O 2 i PBS för 15 min på RT. Repeat en gång till. Hålla locket öppet under detta steg utan att blanda. Skölj två gånger med 10 mL 1 X PBTT. Tvätta två gånger för 5 min med 10 mL av 1 X PBTT. Permeabilize vävnader med 10 mL 80% aceton (-20 ° C, före kylda) vid-20 ° C i 10 min. Vänd tuben två gånger under inkubationstiden. Tvätta två gånger i 10 min med 10 mL av 1 X PBTT att rehydrera vävnader. Skölj med 10 mL blandning av 5 ml PBTT plus 5 ml hybridisering lösning (1:1). Kassera mix och Ersätt med 10 ml hybridisering lösning. Prover kan förvaras vid-20 ° C tills den behövs. För bästa resultat, inte lagra prover för mer än en vecka. komponent fixa jag (10 ml) fixa II (10 ml) 40% PFA lager 1 ml 1 ml PBTT 8,99 ml 9 ml pikrinsyra lösning 10 μl –
tabell 8: fastställande lösningar för vävnader. 4. in situ hybridisering Obs: denna del av protokollet kräver minst 2 dagar, med provberedning, före hybridisering och hybridisering tar plats på dag 1 och sonden upptäckt på dag 2. Om antalet prov är relativt hög, om obekanta med protokollet, eller en hel dag är inte möjligt, bör protokollet utföras i 3 dagar med steg av probe identifiering och signal förstärkning uppdelad i 2 dagar. Stort antal embryon eller dissekerade vävnadsprover kan också kräva ytterligare dagar att behandla. För dissekerade vävnadsprover, ersätta 1 X PBT med 1 X PBTT i alla steg, om inte annat anges. Det extra rengöringsmedlet krävs för penetration av många larver och vuxna vävnader, såsom hjärnan och testiklarna. Även om inte testade, 1 kan X PBTT också användas för embryon. Använd 100 µL per brunn för 96 brunnar och 800 µL för 1,5 mL rör. Pre hybridisering och hybridisering Obs: steg 4.1.1-4.1.6.2 är för embryo i situ hybridisering. För larver eller adult vävnad i situ hybridizations, hoppa över dessa steg. Ta bort 2 mL av fasta embryon (lagrade i metanol vid-20 ° C) till en ny 15 mL tub. Tvätta embryon två gånger för 7 min med 10 mL metanol i varje tvätt. WASH embryon för 7 min med 10 mL blandning av metanol och 1 X PBTT (1:1). Tvätta embryon två gånger för 7 min med 10 mL av 1 X PBTT att rehydrera. För embryo permeabilisering, förbereda en mellanliggande proteinas K lösning (40 µL/mL) genom spädning 1: 500 från stamlösning (20 mg/mL). Förvaras vid -20 ° C. gör en fungerande proteinas K lösning genom att späda ut mellanliggande proteinas K lösningen 1/15 i 1 X PBTT för en slutkoncentration arbetar på 2.667 ug/mL. Permeabilize embryon med 10 mL arbetar proteinas K lösning (Använd mindre för mindre antal embryon). Inkubera röret på RT för 13 min. Vänd försiktigt röret 4 gånger under ruvningen. Inkubera proverna i proteinas K lösning på is för 1 h utan blandning. Obs: Denna relativt lång inkubation med utspädd proteinas K säkerställer reproducibly enhetliga permeabilisering och efterföljande färgning. Medan embryon permeabilize, göra en 2 mg/mL glycin lösning från 10 X lager (20 mg/mL) i 1 X PBTT för en total volym på 30 mL. Ta bort proteinas K lösning, skölj med 10 mL glycin lösning (2 mg/mL) och tvätta två gånger under 2 min varje. Skölj tre gånger med 10 mL 1 X PBTT att ta bort glycin. Efter fixering av embryon. Bereda 10 mL 4% PFA (1 mL av 40% PFA i 9 mL PBTT, filtreras genom 0.45 µm filter). Inkubera proverna i 4% PFA för 20 min. Tvätta 3 X 2 min varje med PBTT. Att förbereda denaturerat hybridisering lösning, koka hybridisering lösningen för 5 min. För en fullständig 96 brunnar plåt, Använd tre rör med 12 mL. Cool på is omedelbart för 5 min. Skölj embryon en gång med 10 mL 1 X PBTT: hybridisering lösning (1:1). Skölj två gånger med 5 mL hybridisering lösning. Alikvotens ~ 20 µL per brunn fast embryon (30-40 embryon) eller fasta vävnader i en PCR-plattan med 96 brunnar på is. Ta bort hybridisering lösning från vävnader eller embryon med hjälp av en 8-kanals grenrör pipett ( figur 1 / video). Obs: Grenrör pipetten har en ‘ stoppa ’ som förhindrar tips från att gå till botten av brunnarna och ta bort provet. För experiment med hjälp av vävnader som flyta, ta bort vätska noggrant med 100 µL pipett uppifrån. Tillsätt 100 µL av denaturerat hybridisering lösningen till varje brunn. Pre hybridisera embryon för minst 2,5-3 h vid 56 ° C med en torr bad värme enhet som innehåller metall pärlor (se material och figur 1). Denaturera 100 µL av den beredda sonden i en PCR-plattan med 96 brunnar med en termocykler för 5 min på 80 ° C. omedelbart cool på is för 5 min. Ta bort före hybridisering lösning från embryon eller vävnader. Lägg till denaturerat gen-specifika prober till varje prov, täck med tätningsband och hybridisera på 56 ° C i 16-18 h O/N, under metallkulor i torr bad värme affärsenhet 5. PROBE identifiering pre värma lösningarna i tabell 9 i enheten 56 ° C värme. Ta bort sonder från plattan. Obs: Sonder kan återanvändas mellan 2 – 3 gånger om lagras vid-80 ° C (aldrig store någon RNA prover i-20 ° C). Efter hybridisering, den dubbelsträngat RNA är mer stabil än enda strand RNA, och är mindre känsliga för nedbrytning, orsakad av RNase kontaminering. Om du använder en en flera dammsugarfilter plattsystem för vävnader, en samling platta bör ingå under filtret plattan att samla sonderna (se video för montering Detaljer). Hybridiserade vävnader kommer att behöva överföras från regelbundna 96 brunnar mikrotiterplattan används för hybridisering till en 1,2 µm porstorlek storlek PVDF hinnor på undersidan av varje brunn. steg före värmde lösning (56 ° C) tid Volym per brunn 1 Hybridisering lösning: PBTT (3:1) 15 min 100 μl 2 Hybridisering lösning: PBTT (3:1) 15 min 100 μl 3 Hybridisering lösning: PBTT (1:1) 15 min 100 μl 4 Hybridisering lösning: PBTT (1:3) 15 min 100 μl 5 PBTT 3 tvättar 5 min 100 μl tabell 9: tvätta sonder efter hybridisering. om du använder normal plattor, tvätta prover enligt tabell 9 i ett värmeelement på 56 ° C. om använda vakuum grenrör, använda uppvärmda lösningar med vakuumsystem på bänken och ta bort lösningar omedelbart från nedan av vaccuum. Efter 3: e tvätten med 1 X PBTT, normala plätera kan tas bort från uppvärmningen affärsenhet Förbered antikroppar. Förbereda 11 mL primär antikropp lösning (2,5 µg/mL) från lager (1 mg/mL) genom att späda ut musen för biotin-konjugerad monoklonal anti gräva-antikropp (se material lista) i PBTTB (1: 400). Om bearbetning färre prover, justera volymerna. Förbereda 11 mL streptividin-HRP lösning (1 µg/mL) från lager (1 mg/mL) genom spädning 1: 1000 streptividin-HRP-konjugat (se material lista) i PBTTB. Om du använder färre prover, justera volymerna. Blockera embryon eller vävnader med PBTTB (1% skummjölk i 1 X PBTT) i 20 min på en bänk topp mixer på RT. Obs: Filter PBTTB med filterpapper (årskurs 3, 6 µm) innan du använder den på 96 brunnar filter plattor för att undvika igensättning av filter. I stället för PBTB, PBTTB (PBTB med ytterligare 0,3% Triton-X-100) används för alla vävnader under protokollet. Inkubera embryon eller vävnader i antikropp lösning (100 µL per brunn) för 2 h på bänk prov mixer. Skölj två gånger med 1 x PBTTB. Tvätta 3 X 5 min och 5 X 10 min med PBTTB. Inkubera embryon eller vävnader med streptividin-HRP-lösning (100 µL per brunn) för 1,5 tim med hjälp av en bänk prov mixer. Tvätta 2 X 5 min med PBTTB. Hålla prover i mörkret från denna punkt på. Obs: under alla antikropp tvättar, om vävnad förloras på grund av opacitet produceras av mjölk, prova tvätt utan mjölk (PBTT istället för PBTTB). Förbereda en DAPI lösning genom att späda 100 X DAPI i PBTTB (1: 100). Inkubera embryon eller vävnader med DAPI lösning (100 µL per brunn) för 15 min på en bänk prov mixer. Tvätta 4 X 10 min med PBTT. Lagra plattan med 96 brunnar med prover O/N vid 4 ° C eller Fortsätt till nästa steg. Obs: Förfarandet kan pausas här. 6. Påvisande av antikroppar med hjälp av tyramide (se figur 5) Obs: här hemmagjord cyanin 3-konjugerad tyramide användes, som utarbetades enligt protokollet beskrivs i 12 . Om utför många experiment eller tester många prover, detta sparar en betydande mängd pengar och är effektiv jämfört med kommersiella reagenser (av erfarenhet). För färre experiment och prov, kommersiellt tillgängliga cyanin 3-tyramide kan användas (se material). Tvätta provet plattor 3 X 5 min med 1 X PBTT. Förbered tyramide aktiveringen buffert (aktivering buffert) innehållande 0,006% H 2 O 2 i PBTT (utspädd 30% (w/w) H 2 O 2 lager 1: 5000). skölj plåtarna med aktiveringen bufferten. Förbered cyanin 3-tyramide lösning genom att späda ut det i aktiveringen buffert i en 15 mL tub. För embryon, använda 1: 80 utspädning (137 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). För larval vävnader, använda 1:150 utspädning (73 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). För vuxna testiklarna, använda 1: 200 utspädning (55 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert). Använd 1:300 utspädning (36 µL av cyanin 3-tyramide i 11 mL aktiveringen buffert) för vuxen äggstockar,. Inkubera prover med cyanin 3-tyramide-lösning för 2 h på bänk prov mixer. Skölj fyra gånger med PBTT. Tvätta 6 X 10 min med PBTT. Tvätta 3 X 5 min med PBS ta bort rengöringsmedlet. Tillsätt 150 µL per brunn av anti fade montering media. Hålla prover O/N vid 4 ° C att tillåta vävnader eller embryon att sjunka till botten av röret. Montera prover på objektglas (under dissekera omfattning för vävnader) och täck med täckglas. Försegla kanterna av täckglaset med genomskinligt nagellack. Bild med fluorescens Mikroskop. Obs: analysera negativ kontroll först för att få en uppfattning om ‘ icke-specifik ’ bakgrund.
Protokollet beskrivs ger en mycket reproducerbara, känslig och ekonomisk metod för detektion av de flesta RNAs i fasta Drosophila embryon eller vävnader. Även om något mer komplicerat än mer traditionellt används alkaliskt fosfatas metod för identifiering av sonden, upplösningen erhålls genom fisk är långt större och känsligheten är jämförbara eller förbättrade 7,8. Med hjälp av helt eller delvis mikrotiter plattor, kan protokoll som användas för storskalig eller begränsade analyser av gener av intresse. Det bör noteras att de sonder som genereras kan upptäcka alla eller flera avskrift splice bildar såvida sonder är mer specifikt utformade (dvs enda exoner). Även om vi har testat sonder så liten som 200 nukleotider med rimlig framgång, mindre sonder tenderar att vara mindre effektiv och kan vara mindre specifik. Klart, detta protokoll är inte lämplig för detektering av små introner, exoner, eller bearbetade mikroRNA.
Även om detta tillvägagångssätt använder ett enzymatiska steg för att öka styrkan av signaler, tycks signalintensitet stå i proportion till målet genuttryck i ett relativt linjär och brett utbud av uttrycksnivåerna. Vid högre förstoring, signalen ses som puncta eller prickar inom celler och vävnader. För relativt sällsynta avskrifter ses endast några små puncta. Som avskrift överflöd ökar, växer dessa i antal och storlek. Som med enda molekyl fisk (smFISH), enstaka små puncta kan också motsvara enda RNAs och bör också lätt kvantifieras med hjälp av programvaran imaging och informatik. Jämförelser av publicerade bilder tagna med smFISH med bilder som vi har curerat för samma mål föreslår att den totala, känslighet och upplösning av de två metoderna är relativt lika, även om detta bör testas av strängare jämförelser. Med tanke på den mycket högre kostnaden av smFISH, bör den metod som anges här ge liknande resultat till en bråkdel av kostnaden. Om målet är att upptäcka små avskrifter, eller separata delar av avskrifter, rekommenderas dock smFISH.
På grund av den mindre storleken av vissa fisk-sonder, kan denna metod också vara bättre på penetrerande vävnader som är stora eller har betydande hinder. Vår användning av högre tvättmedel och vävnad fixering och permeabilisering tweaks verkar dock har löst problemet. Slutligen även utvecklat för Drosophila vävnader, bör de höga rengöringsmedel buffertar som beskrivs här för dissekerade vävnader också arbeta för Drosophila embryon samt de flesta andra organismer och vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering av stöd till detta projekt var som ett bidrag till HMK av kanadensiska institut för hälsa forskning (bevilja MOP 133473).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |