Summary

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

Published: August 26, 2017
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Summary

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis の重要な伝達物質です。単球のホーミングと腫瘍関連血管新生は、大腿動脈結紮マウスモデルにおける単球注入後基底膜のような行列と生体顕微鏡を使用して、このプロトコルを調査します。

Abstract

末梢動脈疾患と虚血性心疾患の治療の目的は、血行動態の狭窄による虚血性の領域への血流を増やすことです。血管手術は、痛み、重症虚血肢、または生活に大きな混乱を休むか、または作業の進行など手術の適応のない患者が選択した場合は、実行可能な選択肢は、彼らの病気を軽減するためのほとんどの可能性がありません。担保の形成の刺激による単球が強化された血流を介して細胞療法は、非侵襲的ないくつかのオプションの 1 つです。

当社グループは、後肢の虚血モデルを用いたマウスに単球移植後 arteriogenesis を調べます。以前は、破傷風刺激同系単球移植を使用して後肢灌流の改善を説明してきました。担保の形成に及ぼす影響、に加えて腫瘍の成長はこの療法にも影響が。これらの効果を調べるためには、大腿動脈の閉塞後マウスの側面に Engelbreth ・ ホルム群れ肉腫の細胞外マトリックスを注入することにより基底膜のようなマトリクス マウス モデルを使用します。

後人工腫瘍学、生体顕微鏡を使用して、生体内で腫瘍の血管新生と担保動脈内ホーミング球を検討します。以前の研究では、事後の成果物をその後の分析を前提とする動物モデルの組織学的検討を説明しています。我々 のアプローチ リアルタイム シーケンスで担保の領域に単球のホーミングを可視化する、実行するために簡単ですし、arteriogenesis と腫瘍血管新生の生体内のプロセスを調査。

Introduction

冠動脈疾患や末梢動脈疾患などの心血管疾患で死亡の最も一般的な原因は、グローバル1。細胞治療は、外科的介入を受けることができない人に特に心血管疾患の治療に有望なアプローチです。治療ツール2,3、灌流を改善し、虚血性と underperfused 組織の機能を維持する全体的な目標として細胞やその分泌物質を使用するいくつかのアプローチがあります。この目標を達成するために 1 つの試みは、担保動脈の開発を高める arteriogenesis を改善することです。単球は、担保に関連付けられている重要な細胞タイプです。当社グループは、特に虚血およびそれに続く炎症6を誘発する後肢虚血モデルを用いた単球の炎症45、地区の影響を研究に集中しています。単球の炎症の故郷であり、担保7の開発につながる複雑な全身反応を起こします。

生体顕微鏡を使って、我々 は、これらの細胞の生体内での挙動を調べるし、炎症の領域に注入された単球のホーミングを観察できます。ほとんどの元の研究では、事後解析、組織学的成果物および準備のために必要な動物の多数の導入を含む不利な点を保持するのみについて説明します。私たちのアプローチで免疫学プロセスを調べることができます、複数の時点で担保の形成を介してライブ イメージング。

担保動脈虚血領域での開発に加え単球も腫瘍の成長に影響します。これらのプロセスを調べるためには、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫、腫瘍細胞外マトリックス蛋白質8で豊富なから抽出した基底膜のようなマトリクスを注入し、生体顕微鏡による分析します。この行列は内皮細胞ネットワーク形成や血管新生の抑制を介して抗腫瘍療法のスクリーン テストの分子に使用します。この場合、私たちは単球細胞療法9,10,11のための潜在的な腫瘍血管新生を評価します。

このプロトコルの目的は、生体内でモデルの虚血によって引き起こされる免疫学プロセスを勉強する簡単で効率的な方法を示すことです。事後筋肉組織の組織学的精密検査と比較して、現実的なテスト環境を生成します。

Protocol

ドイツ動物保護法の第 8 章によるとザクセン = アンハルト州 Landesverwaltungsamt ハレの状態の許可を得て本研究を行った。(8、18.05.2016 – BGBI から動物保護のためのドイツの法律の項を参照。1206 を s. 13.08.2013 からの § 31 TierSchVersV 1313). 注: ここで実験のため 12 週古い男性 balb/c マウスに 8 が使用されたと献血者からひと単球使用した生体顕微鏡による単球の可視化。…

Representative Results

生体顕微鏡を用いた腫瘍と単球によって引き起こされる血管成長の検討は、arteriogenesis と腫瘍血管新生の分子機構の新局面を明らかに助けることができます。セルは準備する必要があります、プロトコルの手順を慎重に使用を注入します。違いは単一の実験の間のバリエーションにつながります。単球は、静脈システム (図 1) 全身の効果を維持?…

Discussion

ここで説明する方法は、担保動脈の開発、これらの血管の単球の挙動と arteriogenesis の過程に光を投げかけています。このプロトコルを適用するための手順が簡単に学び、科学の他の分野で使用することができます。これらの利点にもかかわらず、いくつかの欠点があります。例えば、顕微鏡装置は、記載された方法を実行する必要です。1 つの実験のための機器を取得は、デバイスを共有す?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ELSE Kröner 財団によって支えられたと、 (ドイツ研究振興協会、ドイツ研究振興協会) DFG SFB 854 (Sonderforschungsbereich、共同研究センター)。ハンス ・ ホルガー ・ Gärtner、Audiovisuelles Medienzentrum、オットー ・ フォン ・ ゲーリケ大学マクデブルク Magdeburg, ドイツの, のおかげで特別なテクニカル サポート。

Materials

10% fetal calf serum (FCS) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe  Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 29G, 30G
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium Manufactured by our group with single components Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
DiO Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA Katalognummer: D-1819
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Humane leucocyte filters Blood preservation
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%) Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)  Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope  Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077 GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel  Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199  PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Microscope slide Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit  Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer Manufactured by our group with single components PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer Various
Multi-photon microscope  Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%) Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber  Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll Manufactured by our group with single components 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany  Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 % Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %) Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany

References

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Wagner, M., Baer, C., Zuschratter, W., Riek-Burchardt, M., Deffge, C., Weinert, S., Lee, J. C., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease. J. Vis. Exp. (126), e56290, doi:10.3791/56290 (2017).

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