単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡
Summary
単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis の重要な伝達物質です。単球のホーミングと腫瘍関連血管新生は、大腿動脈結紮マウスモデルにおける単球注入後基底膜のような行列と生体顕微鏡を使用して、このプロトコルを調査します。
Abstract
末梢動脈疾患と虚血性心疾患の治療の目的は、血行動態の狭窄による虚血性の領域への血流を増やすことです。血管手術は、痛み、重症虚血肢、または生活に大きな混乱を休むか、または作業の進行など手術の適応のない患者が選択した場合は、実行可能な選択肢は、彼らの病気を軽減するためのほとんどの可能性がありません。担保の形成の刺激による単球が強化された血流を介して細胞療法は、非侵襲的ないくつかのオプションの 1 つです。
当社グループは、後肢の虚血モデルを用いたマウスに単球移植後 arteriogenesis を調べます。以前は、破傷風刺激同系単球移植を使用して後肢灌流の改善を説明してきました。担保の形成に及ぼす影響、に加えて腫瘍の成長はこの療法にも影響が。これらの効果を調べるためには、大腿動脈の閉塞後マウスの側面に Engelbreth ・ ホルム群れ肉腫の細胞外マトリックスを注入することにより基底膜のようなマトリクス マウス モデルを使用します。
後人工腫瘍学、生体顕微鏡を使用して、生体内で腫瘍の血管新生と担保動脈内ホーミング球を検討します。以前の研究では、事後の成果物をその後の分析を前提とする動物モデルの組織学的検討を説明しています。我々 のアプローチ リアルタイム シーケンスで担保の領域に単球のホーミングを可視化する、実行するために簡単ですし、arteriogenesis と腫瘍血管新生の生体内のプロセスを調査。
Introduction
冠動脈疾患や末梢動脈疾患などの心血管疾患で死亡の最も一般的な原因は、グローバル1。細胞治療は、外科的介入を受けることができない人に特に心血管疾患の治療に有望なアプローチです。治療ツール2,3、灌流を改善し、虚血性と underperfused 組織の機能を維持する全体的な目標として細胞やその分泌物質を使用するいくつかのアプローチがあります。この目標を達成するために 1 つの試みは、担保動脈の開発を高める arteriogenesis を改善することです。単球は、担保に関連付けられている重要な細胞タイプです。当社グループは、特に虚血およびそれに続く炎症6を誘発する後肢虚血モデルを用いた単球の炎症4、5、地区の影響を研究に集中しています。単球の炎症の故郷であり、担保7の開発につながる複雑な全身反応を起こします。
生体顕微鏡を使って、我々 は、これらの細胞の生体内での挙動を調べるし、炎症の領域に注入された単球のホーミングを観察できます。ほとんどの元の研究では、事後解析、組織学的成果物および準備のために必要な動物の多数の導入を含む不利な点を保持するのみについて説明します。私たちのアプローチで免疫学プロセスを調べることができます、複数の時点で担保の形成を介してライブ イメージング。
担保動脈虚血領域での開発に加え単球も腫瘍の成長に影響します。これらのプロセスを調べるためには、Engelbreth ・ ホルム群マウス肉腫、腫瘍細胞外マトリックス蛋白質8で豊富なから抽出した基底膜のようなマトリクスを注入し、生体顕微鏡による分析します。この行列は内皮細胞ネットワーク形成や血管新生の抑制を介して抗腫瘍療法のスクリーン テストの分子に使用します。この場合、私たちは単球細胞療法9,10,11のための潜在的な腫瘍血管新生を評価します。
このプロトコルの目的は、生体内でモデルの虚血によって引き起こされる免疫学プロセスを勉強する簡単で効率的な方法を示すことです。事後筋肉組織の組織学的精密検査と比較して、現実的なテスト環境を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、担保動脈の開発、これらの血管の単球の挙動と arteriogenesis の過程に光を投げかけています。このプロトコルを適用するための手順が簡単に学び、科学の他の分野で使用することができます。これらの利点にもかかわらず、いくつかの欠点があります。例えば、顕微鏡装置は、記載された方法を実行する必要です。1 つの実験のための機器を取得は、デバイスを共有す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ELSE Kröner 財団によって支えられたと、 (ドイツ研究振興協会、ドイツ研究振興協会) DFG SFB 854 (Sonderforschungsbereich、共同研究センター)。ハンス ・ ホルガー ・ Gärtner、Audiovisuelles Medienzentrum、オットー ・ フォン ・ ゲーリケ大学マクデブルク Magdeburg, ドイツの, のおかげで特別なテクニカル サポート。
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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