Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu
Summary
Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.
Abstract
Terapötik periferik arter hastalığı ve iskemik kalp hastalığı için iskemik alanları tarafından hemodinamik darlığına neden kan akışını artırmak için hedeftir. Damar cerrahisi seçili durumda, ama ilerleme gibi cerrahi için belli olmayan hastalar ağrı, kritik uzuv iskemi veya hayat büyük kesintileri dinlenme ya da iş için uygun bir seçenek, kendi hastalık Azaltıcı için birkaç olasılık vardır. Hücre tedavisi monosit gelişmiş perfüzyon teminat oluşumu uyarılması yoluyla üzerinden birkaç non-invaziv seçeneklerden biri.
Bizim grup monosit nakli hindlimb iskemi modeli kullanarak fare içine sonra arteriogenesis inceliyor. Daha önce hindlimb perfüzyon syngeneic monosit tetanoz uyarılmış nakli kullanarak artış göstermiştir. Teminat oluşumu üzerine etkisi yanı sıra, tümör büyüme bu terapi tarafından etkilenebilir. Bu etkileri araştırmak için biz Engelbreth-Holm-Swarm sarkomu hücre dışı matriks fareyi, kanat femoral arter tıkanıklığı sonra enjekte edilerek bir membran benzeri matris fare modeli kullanın.
Yapay tümör çalışmaları sonra biz intravital mikroskobu vivo içinde tümör-anjiogenez ve Kollateral damar içinde homing monosit incelemek için kullanın. Önceki çalışmalarda hayvan modelleri, öldükten sonra yapılara daha sonraki analiz gerektirir histolojik incelenmesi anlatmıştık. Yaklaşımımız monosit posta collateralization gerçek zamanlı sekanslarında bölgelerine görüntüler, gerçekleştirmek, kolay ve arteriogenesis ve tümör angiogenez içinde vivosüreci inceler.
Introduction
Kalp-damar hastalıkları koroner kalp hastalığı veya periferik arter hastalığı, dahil olmak üzere, genel olarak ölüm en yaygın nedeni vardır1. Hücre tedavisi ve cerrahi müdahaleler geçmesi mümkün olmayan insanlar için özellikle kalp-damar hastalıkları, tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Hücreleri ya da onların salgılanan maddeler olarak bir tedavi aracı2,3, perfüzyon geliştirmek ve iskemik ve underperfused doku fonksiyonu sağlamak için genel amacı ile kullanmak için birkaç yaklaşım vardır. Bu hedefe ulaşmak için bir girişim arteriogenesis, Kollateral damar gelişimini artırır geliştirmektir. Monosit collateralization ile ilişkili bir önemli hücre türü vardır. Bizim grup alanlarında inflamasyon4,5, monosit etkilerini araştırma özellikle iskemi ve sonraki iltihap6ikna etmek için hindlimb iskemi modeli kullanarak odaklanmıştır. Monosit ve inflamasyon bölgelerine ev collateralization7gelişmesine yol karmaşık sistemik tepkiler.
İntravital mikroskobu kullanımı ile bu hücrelerin içinde vivo davranışını çalışma ve inflamasyon bölgelerine enjekte monosit posta gözlemlemek. En eski çalışmaları sadece post mortem analizleri, histolojik eser ve çok sayıda hayvan ürünleri için gerekli bir giriş de dahil olmak üzere dezavantajları tutun tarif. Yaklaşımımız, immünolojik süreçleri araştırabilirsiniz ve teminat oluşumu ile canlı görüntüleme birden fazla zaman noktalarda.
Kollateral damar iskemik alanlarda geliştirme ek olarak, monosit da tümör büyümesini etkiler. Bu işlemler araştırmak için Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu, bir tümör hücre dışı matriks proteinleri8‘ de, zengin çıkarılan bir membran benzeri matris enjekte edip intravital mikroskobu kullanarak analiz. Bu matris ekran test moleküllerine endotel hücre ağ oluşumu veya anjiogenik inhibisyonu yoluyla anti-kanser tedavileri için kullanılır; Bu durumda, monosit hücre terapisi9,10,11tümör anjiogenik potansiyelinin değerlendirecek.
Bu iletişim kuralı, immünolojik süreçleri içinde vivo modelinde iskemi neden eğitim için kolay ve verimli bir şekilde göstermek için amaçtır. Post mortem kas dokusu histolojik testleri için karşılaştırıldığında daha gerçekçi bir test ortamı oluşturabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemi Kollateral damar, monosit bu damarları davranışını ve arteriogenesis sürecinin geliştirilmesi ışık tutuyor. Bu iletişim kuralı uygulamak için belgili tanımlık merdiven are basit-e doğru öğrenmek ve diğer bilim alanlarında kullanılabilir. Bu avantajlara rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, mikroskobik ekipman açıklanan teknikleri yürütmek için gereklidir. Aygıtların paylaşmak için diğer kuruluşlarla işbirliği yapmak önemlidir bu yüzden bir deneme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ELSE-Kröner-Stiftung tarafından desteklenen ve DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, ortak araştırma merkezi). Teknik destek için özel Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya, teşekkürler.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
