Summary

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Published: August 26, 2017
doi:

Summary

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Abstract

Terapötik periferik arter hastalığı ve iskemik kalp hastalığı için iskemik alanları tarafından hemodinamik darlığına neden kan akışını artırmak için hedeftir. Damar cerrahisi seçili durumda, ama ilerleme gibi cerrahi için belli olmayan hastalar ağrı, kritik uzuv iskemi veya hayat büyük kesintileri dinlenme ya da iş için uygun bir seçenek, kendi hastalık Azaltıcı için birkaç olasılık vardır. Hücre tedavisi monosit gelişmiş perfüzyon teminat oluşumu uyarılması yoluyla üzerinden birkaç non-invaziv seçeneklerden biri.

Bizim grup monosit nakli hindlimb iskemi modeli kullanarak fare içine sonra arteriogenesis inceliyor. Daha önce hindlimb perfüzyon syngeneic monosit tetanoz uyarılmış nakli kullanarak artış göstermiştir. Teminat oluşumu üzerine etkisi yanı sıra, tümör büyüme bu terapi tarafından etkilenebilir. Bu etkileri araştırmak için biz Engelbreth-Holm-Swarm sarkomu hücre dışı matriks fareyi, kanat femoral arter tıkanıklığı sonra enjekte edilerek bir membran benzeri matris fare modeli kullanın.

Yapay tümör çalışmaları sonra biz intravital mikroskobu vivo içinde tümör-anjiogenez ve Kollateral damar içinde homing monosit incelemek için kullanın. Önceki çalışmalarda hayvan modelleri, öldükten sonra yapılara daha sonraki analiz gerektirir histolojik incelenmesi anlatmıştık. Yaklaşımımız monosit posta collateralization gerçek zamanlı sekanslarında bölgelerine görüntüler, gerçekleştirmek, kolay ve arteriogenesis ve tümör angiogenez içinde vivosüreci inceler.

Introduction

Kalp-damar hastalıkları koroner kalp hastalığı veya periferik arter hastalığı, dahil olmak üzere, genel olarak ölüm en yaygın nedeni vardır1. Hücre tedavisi ve cerrahi müdahaleler geçmesi mümkün olmayan insanlar için özellikle kalp-damar hastalıkları, tedavi etmek için umut verici bir yaklaşımdır. Hücreleri ya da onların salgılanan maddeler olarak bir tedavi aracı2,3, perfüzyon geliştirmek ve iskemik ve underperfused doku fonksiyonu sağlamak için genel amacı ile kullanmak için birkaç yaklaşım vardır. Bu hedefe ulaşmak için bir girişim arteriogenesis, Kollateral damar gelişimini artırır geliştirmektir. Monosit collateralization ile ilişkili bir önemli hücre türü vardır. Bizim grup alanlarında inflamasyon4,5, monosit etkilerini araştırma özellikle iskemi ve sonraki iltihap6ikna etmek için hindlimb iskemi modeli kullanarak odaklanmıştır. Monosit ve inflamasyon bölgelerine ev collateralization7gelişmesine yol karmaşık sistemik tepkiler.

İntravital mikroskobu kullanımı ile bu hücrelerin içinde vivo davranışını çalışma ve inflamasyon bölgelerine enjekte monosit posta gözlemlemek. En eski çalışmaları sadece post mortem analizleri, histolojik eser ve çok sayıda hayvan ürünleri için gerekli bir giriş de dahil olmak üzere dezavantajları tutun tarif. Yaklaşımımız, immünolojik süreçleri araştırabilirsiniz ve teminat oluşumu ile canlı görüntüleme birden fazla zaman noktalarda.

Kollateral damar iskemik alanlarda geliştirme ek olarak, monosit da tümör büyümesini etkiler. Bu işlemler araştırmak için Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu, bir tümör hücre dışı matriks proteinleri8‘ de, zengin çıkarılan bir membran benzeri matris enjekte edip intravital mikroskobu kullanarak analiz. Bu matris ekran test moleküllerine endotel hücre ağ oluşumu veya anjiogenik inhibisyonu yoluyla anti-kanser tedavileri için kullanılır; Bu durumda, monosit hücre terapisi9,10,11tümör anjiogenik potansiyelinin değerlendirecek.

Bu iletişim kuralı, immünolojik süreçleri içinde vivo modelinde iskemi neden eğitim için kolay ve verimli bir şekilde göstermek için amaçtır. Post mortem kas dokusu histolojik testleri için karşılaştırıldığında daha gerçekçi bir test ortamı oluşturabilirsiniz.

Protocol

bizim çalışma Bölüm 8 hayvan koruma için Alman hukuk göre Saxony-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, durumunu izni ile gerçekleştirildi. (§ 8, paragraf 1 Alman hukuk hayvan 18.05.2016 – BGBI korunmak için. 1206, S. 1313, § 31 TierSchVersV 13.08.2013 gelen). Not: burada deneyler için 8-12 hafta yaşlı erkek BALB/c fareler kullanıldı ve kan bağış insan monosit monosit intravital mikroskobu ile görselleştirme için kullanıldı. 1. hücre …

Representative Results

Tümör ve monosit tarafından tetiklenen Kollateral damar büyüme incelenmesi için intravital mikroskobu tümör anjiogenez ve arteriogenesis moleküler mekanizmaları yeni yönlerini ortaya çıkarmak yardımcı olabilir. Hücreleri hazır olmalı ve dikkatlice adımları protokolü kullanarak enjekte. Farklılıklar arasında tek deneyler varyasyonları için yol açabilir. Monosit Venöz sistem (sistemik etkileri korumak ve emboli, eğer enjeksiyon Arteryel sistemde yapılır hangi …

Discussion

Burada açıklanan yöntemi Kollateral damar, monosit bu damarları davranışını ve arteriogenesis sürecinin geliştirilmesi ışık tutuyor. Bu iletişim kuralı uygulamak için belgili tanımlık merdiven are basit-e doğru öğrenmek ve diğer bilim alanlarında kullanılabilir. Bu avantajlara rağmen bazı dezavantajları vardır. Örneğin, mikroskobik ekipman açıklanan teknikleri yürütmek için gereklidir. Aygıtların paylaşmak için diğer kuruluşlarla işbirliği yapmak önemlidir bu yüzden bir deneme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser ELSE-Kröner-Stiftung tarafından desteklenen ve DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, ortak araştırma merkezi). Teknik destek için özel Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya, teşekkürler.

Materials

10% fetal calf serum (FCS) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe  Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 29G, 30G
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium Manufactured by our group with single components Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
DiO Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA Katalognummer: D-1819
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Humane leucocyte filters Blood preservation
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%) Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)  Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope  Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077 GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel  Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199  PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Microscope slide Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit  Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer Manufactured by our group with single components PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer Various
Multi-photon microscope  Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%) Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber  Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll Manufactured by our group with single components 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany  Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 % Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %) Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany

References

  1. Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
  2. Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
  3. Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
  4. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
  5. Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
  6. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
  7. . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
  8. Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
  9. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
  10. Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
  11. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
  12. Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
  13. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).

Play Video

Cite This Article
Wagner, M., Baer, C., Zuschratter, W., Riek-Burchardt, M., Deffge, C., Weinert, S., Lee, J. C., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease. J. Vis. Exp. (126), e56290, doi:10.3791/56290 (2017).

View Video