Summary
Monocytter er viktig meglere på arteriogenesis i sammenheng med perifere arterial sykdom. Bruker en kjeller membran som matrise og intravital mikroskopi, undersøker denne protokollen monocytt homing og svulst-relaterte angiogenese etter monocytt injeksjon i femoral arterien ligation murine modellen.
Abstract
Den terapeutiske mål for perifere arterial sykdom og iskemisk hjertesykdom er å øke blodstrømmen til iskemiske områder skyldes hemodynamic stenose. Vaskulær kirurgi er et levedyktig alternativ i Utvalgte tilfeller, men for pasienter uten indikasjoner for kirurgi som progresjon å hvile smerte, kritisk lem iskemi eller store forstyrrelser livet eller arbeide er det få muligheter for begrensende sin sykdom. Cellen terapi via monocytt forbedret perfusjon gjennom stimulering av sivile formasjon er en av få ikke-invasiv.
Vår gruppe undersøker arteriogenesis etter monocytt transplantasjon i mus ved hjelp av hindlimb iskemi modellen. Tidligere har vi vist bedring i hindlimb perfusjon bruker stivkrampe-stimulert syngeneic monocytt transplantasjon. I tillegg til effekten på sivile dannelsen, kan tumorveksten bli påvirket av denne behandlingen. Undersøke effektene, bruker vi en kjeller membran som matrise musemodell ved å injisere den ekstracellulære matrisen av Engelbreth-Holm-sverm sarkomspesialitet inn flanken av musen, etter okklusjon av arterien femoral.
Etter kunstig svulst studiene, bruker vi intravital mikroskopi i vivo svulst-angiogenese og monocytt homing innen sikkerheter arterier. Tidligere studier har beskrevet histologiske undersøkelse av dyr modeller, som forutsetter påfølgende analyse obduksjon artefakter. Vår tilnærming visualiserer monocytt homing til områder av collateralization i sanntid sekvenser, er enkel å utføre, og undersøker prosessen med arteriogenesis og tumor angiogenese i vivo.
Introduction
Kardiovaskulære sykdommer, inkludert koronar hjertesykdom eller perifere arterial sykdom, er de vanligste årsakene til dødsfall globalt1. Cellen terapi er en lovende tilnærming til å behandle kardiovaskulær sykdom, spesielt for personer som ikke kan gjennomgå kirurgiske inngrep. Det er flere måter å bruke celler eller deres secreted stoffer som en terapeutisk redskap2,3, med det overordnede målet å forbedre perfusjonen og opprettholde funksjon av iskemiske og underperfused vev. Ett forsøk på å oppnå dette målet er å forbedre arteriogenesis, som forbedrer utviklingen av sikkerheter arterier. Monocytter er en viktig celle type assosiert med collateralization. Vår gruppe har fokusert på å undersøke effektene av monocytter i områder med betennelse4,5, spesielt med hindlimb iskemi modellen for å indusere iskemi og påfølgende betennelse6. Monocytter hjem til områder med betennelse og forårsake komplekse systemisk svar som fører til utvikling av collateralization7.
Med bruk av intravital mikroskopi, kan vi studere atferden til disse cellene i vivo og observere homing av injisert monocytter i områder med betennelse. De fleste tidligere studier bare beskrive post mortem analyser, som holder ulemper, inkludert en innføring av histologiske gjenstander og stort antall dyr kreves for forberedelser. Med vår tilnærming, vi kan undersøke immunologiske prosesser og sivile formasjon via live bildebehandling på flere tidspunkt.
I tillegg til utvikling av sikkerheter arterier i iskemiske områder påvirke monocytter også tumor vekst. For å undersøke disse prosessene, vi injisere en kjeller membran som matrise utvunnet fra Engelbreth-Holm-sverm musen sarkomspesialitet, en svulst rik på ekstracellulær matrix proteiner8, og analysere ved hjelp av intravital mikroskopi. Denne matrisen brukes til prøvefilme molekyler for endothelial celle nettverk formasjon eller anti-kreft terapi gjennom angiogenic hemming; i dette tilfellet vil vi vurdere svulst angiogenic potensialet av monocytter for cellen terapi9,10,11.
Målet med denne protokollen er å demonstrere en lett og effektiv måte å studere immunologiske prosesser skyldes iskemi i en i vivo -modell. Vi kan generere et mer realistisk testmiljø sammenlignet histologiske workup av post mortem muskelvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
vår studie ble utført med tillatelse fra delstaten Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, ifølge den tyske loven for Dyrevern, avsnitt 8. (§ 8 punkt 1 i den tyske loven for dyr beskyttelse mot 18.05.2016 - BGBI. Jeg S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV fra 13.08.2013).
Merk: For eksperimentene her, 8 til 12 uke gamle mannlige BALB/c mus ble brukt, og menneskelig monocytter fra blodgivere ble brukt for visualisering av monocytter via intravital mikroskopi.
1. celle forberedelse
Merk: For isolering av monocytter, vennligst se vår tidligere publiserte video på JoVE instruksjoner: " isolasjon og intravenøs injeksjon av Murine benmarg avledet Monocytter " av Wagner et al. 4
Merk: når arbeider med celler alle trinn må sterilt å unngå forurensning.
- Celle farging med 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine-perklorat
- Resuspend cellene i serum fri kultur medium med en tetthet på 1 x 10 6 celler/mL.
Merk: Bare serum fri medium muliggjør en effektiv flekker, siden lipofile fargestoff ville ellers allerede være fanget av lipofile komponenter i serum. - Legge til 5 µL av 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine-perklorat i vannistedenfor til 1 mL av cellen suspensjon og resuspend nøye.
- Incubate celle løsning på 37 ° C i 20 min.
- Sentrifuge cellene på 37 ° C og 500 x g i 5 min.
- Dislodge nedbryting og resuspend cellene med 37 ° C varmt fosterets kalv serum supplert medium.
- Gjenta trinnene 1.1.4 og 1.1.5 to ganger.
- Telle celler med formelen:
- resuspend cellene med 150 µL sterile 0,9% NaCl løsning.
- Injisere cellene til halen venen.
- Resuspend cellene i serum fri kultur medium med en tetthet på 1 x 10 6 celler/mL.
2. Anestesi
- Innånding anestesi
- fordampe isoflurane ved hjelp av en vaporizer bruker en konsentrasjon av 5% i en lukket bin under kjemisk sikkerhet hette.
- Håndtere musen nøye og putte den i søppelkassen.
- Håndtere dyret av huden i bakre nakken etter det har sluttet å flytte.
- Intraperitoneal anestesi
Merk: Bruk isoflurane anestesi, beskrevet under trinn 2.1, til å utføre en intraperitoneal injeksjon. Med rask gjenoppretting og korttidsvirkende narkotisk effekt isoflurane bedøvelse er det enklere å håndtere musen og injisere intraperitoneal anestesi.- Bruker en løsning av 2,4 mL ketamin (10%), 0,8 mL Xylazine (2%) og 6.8 mL NaCl (0,9%) av intraperitoneal injeksjon.
- Veie dyret før anvende anesthetic.
Merk: Formelen for anesthetic er:
- bruker en 1 mL insulinsprøyte med en 30 G nål for å injisere løsningen i venstre underbelly.
- Plasser musen i buret sitt og vente på narkotisk effekt.
Merk: Narkotisk effekt vises vanligvis innen 5 min hvis injeksjon var vellykket. Riktig dybde på bedøvelse kan bestemmes ved fravær av enten lokket refleks eller reaksjon på tå knipe, samt en vanlig, kontrollert hastighet av pusting.
3. Implantering av kjelleren membran som matrise
Merk: denne metoden brukes av vår gruppe for å studere svulst angiogenese etter monocytt injeksjon. Avhengig av eksperimentene, kan vekst faktorer legges til kjelleren membran-lignende matrix. Vi utførte femoral arterien ligatur før injisere svulst i flanken av musen. Matrisen må ha en temperatur på 4 ° C for injeksjon. Ved denne temperaturen er matrix flytende; gel stivner til en solid kroppstemperatur (37 ° C). For bedre synlighet av subkutan matrix plugg, barbere huden av musen på injeksjonsstedet.
Merk: Valgfritt: legge til 100 ng grunnleggende fibroblast vekstfaktor, 300 ng vaskulær endotelial vekstfaktor og 26 IE heparin under sterile forhold til kjelleren membran-lignende matrix.
- Laste 1 mL av matrix i en 30 G insulin sprøyten og butikk på is inntil bruk.
- Lå dyret på bordet og holder huden av mus ved injeksjonsstedet på flanken.
- Injisere 500 µL av kjelleren membran-lignende matrix subcutaneously.
Merk: Praktiske årsaker er det nødvendig å injisere kjelleren membran-lignende matrix kompakt på ett sted å unngå subkutan spredning. Det vil være lettere å dislodge kunstig svulsten fra vevet etter at musen på slutten av eksperimentet.
4. Hale vene injeksjon
Merk: praksis hale blodåre injeksjon NaCl løsning på test dyr før eksperimentering. Hvis monocytter ikke tilstrekkelig injiseres i halen blodåre, blir det ingen systemisk effekt på collateralization. I denne protokollen injisert vi 2,5 millioner monocytter. Prøv å injisere ikke mer enn 5 µL/g av kroppsvekt.
- Bruker monocytt løsning utarbeidet under trinn 1.1.8 som inneholder 2,5 millioner monocytter.
- Bruke en 30 G sprøytespiss en 1 mL insulin injeksjon.
- Nøye håndtere musen, holde dyr i restrainer, og kontroller at musen ikke er skadet og har tilstrekkelig plass til å puste.
- Sette i restrainer på varmeputen slik at halen kan kontakte platen.
- Identifisere hale venene, som er plassert på den laterale siden av halen.
- Slå halen 90 °, så hale venen vises på oversiden av halen.
- Desinfisere injeksjon siden før injisere monocytter.
- Prøver å injisere monocytt løsningen i en flat vinkel med skråkant nålen vender opp
NOTE: Opphøre injeksjon hvis en blemme vises, da dette er et tegn på en mislykket injeksjon. Prøv fremgangsmåten nytt mer proximally. - Stoppe blødninger på injeksjonsstedet ved å bruke lett trykk på halen for ca 60s.
- Observere dyret i 30 min å overvåke systemisk bivirkninger og Plasser musen i buret sitt etter dyret har fullstendig gjenopprettet.
5. Intravital mikroskopi
- forberedelse
- plasserer bedøvet musen på oppvarming pad (37 ° C) å holde en konstant temperatur og fikse labber på plass med teip.
- Rense huden på stedet av benet eller flanke som brukes for mikroskopi.
- Barbere regionen rundt for bedre håndtering og for å unngå interferens med hår.
- Avgiftsdirektoratet huden med en bakteriefri skalpell og fine tang i et kvadrat 0.5 x 0,5 cm.
Merk: Det er viktig å holde området rundt fuktig; ellers blir kvaliteten på bilder og vev kompromittert. NaCl løsning kan brukes til å fukte området. - Plasserer beinet mellom to justerbare frimerker og Plasser et cover glass på frimerker.
- Vev våt og er i kontakt med glasset.
- Inject 50 µL rhodamine dekstran retrobulbar i det venøse systemet for bedre synlighet av fartøyene.
- Start mikroskopi og justere plasseringen av beinet hvis nødvendig.
- Intravital mikroskopi innstillinger
- slå på mikroskopet, datamaskinen, elektronisk grensesnitt og lasere.
- Slå på oppvarming enheten inkubasjon kammer og/eller oppvarming scenen (plate/pad), og Still inn temperaturen til 37 ° C.
- Start oppkjøpet programvare. Hvis mikroskopet er utstyrt med en resonant skanner, Velg denne rask skanningsmodus.
- Vent til temperaturen når et konstant nivå (35-37 ° C)
Merk: En stabil temperatur er viktig for: (a) mus, som under narkose ikke kan styre kroppstemperatur, og (b) unngå eller minst minimere fokal drift. Dette kan ta 1 h flere timer, avhengig av forholdene (f.eks, klimaanlegg og antall varmekilder i rommet, inkludert mennesker). Hvis nedsenkning mål, er sonen kontakt mellom linsen og dekke glass (eller vev) en vanlig kilde til ustabilitet. Varme linsen med en objektiv varmtvannsberederen kan hjelpe; eventuelt et mikroskop med et autofokussystem anbefales. - Velg en forstørrelse linse med en høy numeriske blenderåpning som oppfyller kravene oppløsning av eksperimentet (se merknad på slutten av denne delen).
- Optimalisere mikroskop innstillingene med hensyn til gevinst, Kanalinnstillinger, skannehastighet, pikslers oppløsning, dybde volum, steg størrelse og snitt før du plasserer det eksperimentelle dyr på scenen.
- Scan bidirectionally oppkjøpet å.
- Plasserer bedøvet musen på prewarmed mikroskop scenen etter mikroskopet har nådd stabile forhold og innstillingene er testet ved hjelp av en attrapp.
- Bringe regionen rundt i kjelleren membran-lignende matrisen i fokus ved hjelp av lys lys belysning og inspisere kort kapillærene av ultrafiolett lys med tilstrekkelig filterinnstillinger for den anvendt fluorophores.
- Bytte til skannemodus; starte skanning på lav oppløsning 256 x 256 modus og forbedre gevinst og laser makt til et signal er observert på skjermen.
- Fokus på strukturen av interesse. Zoom inn til alle detaljer vises.
- Definer " starte " og " slutten " posisjoner i aksial retning.
- Opphøre skanning.
- Definere stepping størrelse (f.eks, 0,5 µm) og antall fokal fly (f.eks 10-20).
- Bytte til endelige pikslers oppløsning (512 x 512 eller 1024 x 1024) avhengig av bevegelige subcellular strukturer eller celler og velg Skann hastighet hastigheten (skanning frekvens) som passer best til bevegelser. Toveis skanning anbefales å feste oppkjøpet av stabler.
Merk: Velg høyeste avsøkingshastigheten skanning som gir tilstrekkelig bildekvalitet. Typisk punkt skannere gir hastigheter mellom 400 Hz og 1,4 kHz. Resonans skannere gir en ekstra 8 kHz eller 12 kHz. Ved å redusere antall linjer i y-retningen, avsøkingshastigheten kan være ytterligere økt (verdiene er 512 x 512, 512 x 256 eller 512 x 200 pixel resolution). Avhengig av signal-til-støy-forhold, kan man prøve å forbedre bildekvaliteten ved å legge til linjen snitt mellom 2 og 4. Vanligvis en innstilling på 512 x 200 uten snitt resultater i en anskaffelse/tidsramme av 18 ms i toveis modus med en 8 KHz resonans skanner; med 512 x 200 og 4 x gjennomsnitt, den bremser ned 56 ms per bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi for undersøkelse av svulsten og sivile fartøy vekst utløst av monocytter kan bidra til å avsløre nye aspekter i molekylære mekanismer av svulst angiogenese og arteriogenesis. Cellene må være forberedt og injisert forsiktig med trinnene i protokollen. Forskjellene kan føre til variasjoner mellom enkelt eksperimenter. Monocytter må være injisert i det venøse systemet (figur 1) å opprettholde systemiske effekter og unngå emboli, som kan oppstå hvis injeksjon er gjennomført i arterielle systemet.
Hvis kjelleren membran som matrise, injisere sakte for å unngå spredning hjelper med plugg explantation for ytterligere histologiske eksamen (figur 2, Figur 3). Etter ofre musen, vil kjelleren membran som matrise pluggen være explanted fra flanken av musen. I kjelleren membran som matrise pluggen, kan vi måle endometrial blodkar ved å telle kapillærene i annerledes eksperimentell innstillinger (Figur 4, figur 5).
En annen forutsetning for vellykket eksperimenter er innstillingen mikroskop, som avhenger av programvare, maskinvare og dyr forberedelse (figur 6). Hvis subcellular strukturer (< 2 µm) trenger å bli identifisert, en oppreist mikroskop med 2-fotonet-eksitasjon og vann nedsenking mål (20 X eller 25 X numeriske blenderåpning 1.0) med lange arbeidsavstand (> 2 mm) anbefales. Siden vann nedsenking mål med høy numeriske blenderåpning er svært følsom for brytningsindeks varianter, justeres den optimale oppløsningen og lysstyrke ved å flytte en korreksjon krage på målet. Dessverre er justering for hånd ganske vanskelig på grunn av begrenset plass. Derfor tilbys dyre mål med en motorisert krage rettelsen av mikroskopet produsenter.
Hvis mobilnettet oppløsning (5-10 µm) er tilstrekkelig, 10 x tørr linsen med en numeriske blenderåpning 0,4 eller høyere og en lang arbeidsavstand (> 2 mm) anbefales. I dette tilfellet kan en oppreist eller en invertert mikroskopstativet velges. Live celle bildebehandling med en 10 X tørr linsen (numeriske blenderåpning 0,4) på høyere zoom faktorer (> 3) er mye lettere og billigere fordi klassisk AC confocal laserskanning mikroskopi (dvs., 1 Foton eksitasjon) kan brukes til å få bildestakker med tilstrekkelig oppløsning. Hvis mye tid er nødvendig for oppkjøpet av bilder, redusere mengden av rhodamine dekstran i fartøyet. For en bedre synlighet av fartøyene, injeksjon av fluorophore må gjentas (figur 7).
Det er mest effektivt å prøve forskjellige justeringer og bestemme best mulig bildekvalitet. Bruk av positiv sonder for celler eller kjelleren membran-lignende matrix (uten transplantasjon) kan hjelpe få optimale innstillinger. Vi kan finne merket monocytter via intravital microcopy innenfor av blodet flyt og muskelvev (Figur 8, figur 9). Histologiske undersøkelse av vev deler bekrefter våre funn (Figur 10).
Figur 1 : Injeksjon av 2,5 millioner monocytter i halen venen. Vener finnes på den laterale siden av halen, arterier på rygg og ventral side. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Injeksjon av kjelleren membran som matrise. Håndtere huden av mus og injisere kjelleren membran-lignende matrix i flanken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Explanted matrise pluggen fra flanken av musen (se punkt 3.5). Innlemmet fartøy fem dager etter monocytt transplantasjon via hale venen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sammenligning av endometrial blodkar i kjelleren membran-lignende matrix ( 
+ SD, n = 3 i hver gruppe). Fartøy i kjelleren membran som matrise pluggen, med ingen vekstfaktor lagt (rød linje), sammenlignet med skip av kjelleren membran som matrise med vekstfaktor lagt. Tilskudd av kjelleren membran som matrise med vekstfaktor fører til økt fartøyet vekst. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Fartøy i kjelleren membran som matrise pluggen. Visualisering av blodet flyter (rød) i fartøy (piler) og monocytt homing (grønn) i kjelleren membran som matrise pluggen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Mus forberedt for bildeopptak. Labber er løst med teip og et cover glass er plassert på toppen av to justerbare frimerker. Regionen rundt ble excised med skalpell. NaCl brukes til å fukte området slik at kvaliteten på bilder og vev ikke blir svekket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Redusert synligheten av fartøy. 3, 3-Dioctadecyloxacarbocyanine-perklorat farget monocytter (piler) i kjelleren membran som matrise ved siden av et fartøy (langsgående delen *). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Monocyte skylles inn fartøyet. I vivo visualisering av 3, 3-Dioctadecyloxacarbocyanine-perklorat farget og transplantert monocytt (grønn, pil) innen sikkerhet arterien (*). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Intravital mikroskopi. 3, 3-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat farget monocytter (piler) i sivile skip med typiske korketrekker dannelse (*) med rhodamine dekstran. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Immunohistological farging av låret muskulaturen. Fartøy (rød: alpha glatt muskel begrepsordbok, *), makrofager (grønn: 3, 3-Dioctadecyloxacarbocyanine-perklorat, piler), cellekjernen (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her kaster lys over utviklingen av sikkerheter arterier, virkemåten av monocytter i disse fartøyene, og prosessen med arteriogenesis. Trinnene for å bruke denne protokollen er lett å lære og kan brukes i andre felt av vitenskap. Til tross for disse fordelene er det noen ulemper. For eksempel er mikroskopiske utstyr nødvendig å utføre beskrevet teknikker. Å skaffe utstyr for et eksperiment er uholdbar, så det er viktig å samarbeide med andre institusjoner å dele enhetene.
Det er andre problemer forbundet med denne protokollen som kan unngås med praksis. I begynnelsen, det kan være problemer med plassere musen under mikroskopet og bildekvalitet kan lide under disse omstendighetene. En annen kritisk punkt er halen blodåre injeksjon. Monocytter kan bare sees i venene hvis injisert riktig. Derfor anbefales det å praktisere injeksjon før du plasserer musen.
Monocytt isolasjon er også kritisk. Monocytter kan isoleres fra ulike arter med flere protokoller, som ofte fører til ulike resultater og celle gir12,13,14. Det er nødvendig å arbeide i sterile forhold å unngå forurensning. Celleskader skulle være forhindret av pipettering nøye og opprettholde konstant temperatur.
Til tross for disse ulempene er denne metoden praktisk og enkel å utføre, muliggjør brukernes å belyse svulst angiogenese og grunnleggende mekanismene bak perifere arterial sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av ellers-Kröner-Stiftung og DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, tysk Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, forskningssamarbeid center). Spesiell takk til Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Tyskland, kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
