Summary
Monocytter er vigtige formidlere af arteriogenesis i forbindelse med perifer arteriel sygdom. Ved hjælp af en basalmembran-lignende matrix og intravital mikroskopi, undersøger denne protokol monocyt målsøgende og tumor-relaterede angiogenese efter monocyt injektion i femorale arterie ligatur murine model.
Abstract
Det terapeutiske mål for perifer arteriel sygdom og iskæmisk hjertesygdom er at øge blodgennemstrømningen til iskæmiske områder forårsaget af hæmodynamiske stenose. Karkirurgi er en farbar vej i udvalgte tilfælde, men for patienter uden indikationer for kirurgi som progression til hvile smerte, kritiske lemmer iskæmi eller større forstyrrelser til liv eller arbejde, der er få muligheder for at mildne deres sygdom. Celleterapi via monocyt-forstærket perfusion gennem stimulering af sikkerhedsstillelse dannelse er en af et par ikke-invasiv muligheder.
Vores gruppe undersøger arteriogenesis efter monocyt transplantation ind i musene bruger hindlimb iskæmi model. Vi har tidligere vist forbedring i hindlimb perfusion ved hjælp af stivkrampe-stimuleret syngeneic monocyt transplantation. Ud over virkninger på sikkerhedsstillelse dannelse, kunne tumorvækst blive påvirket af denne terapi. For at undersøge disse effekter, bruger vi en basalmembran-lignende matrix musen model ved at indsprøjte den ekstracellulære matrix af Engelbreth-Holm-sværm sarkom ind i flanken på musen, efter okklusion af arteria femoralis.
Efter de kunstige tumor undersøgelser, vi bruger intravital mikroskopi til at studere i vivo tumor-angiogenese og monocyt homing inden for sikkerhedsstillelse arterier. Tidligere undersøgelser har beskrevet den histologiske undersøgelse af dyremodeller, hvilket forudsætter efterfølgende analyse til post mortem - artefakter. Vores tilgang visualiserer monocyt homing til områder af collateralization i realtid sekvenser, er nem at udføre, og undersøger processen af arteriogenesis og tumor angiogenese in vivo.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme, herunder koronar hjertesygdom eller perifer arteriel sygdom, er de mest almindelige dødsårsager globalt1. Celleterapi er en lovende metode til behandling af hjerte-kar-sygdom, især for folk, der ikke er i stand til at gennemgå kirurgiske indgreb. Der er flere måder at bruge celler eller deres udskilles stoffer som et terapeutisk værktøj2,3, med det overordnede mål at forbedre perfusion og opretholde funktion af iskæmisk og underperfused væv. Et forsøg på at nå dette mål er at forbedre arteriogenesis, hvilket styrker udviklingen af sikkerhedsstillelse arterier. Monocytter er en vigtig celletype forbundet med collateralization. Vores gruppe har fokuseret på at forske i virkningerne af monocytter i områder af betændelse4,5, navnlig ved hjælp af hindlimb iskæmi model til inducerer iskæmi og efterfølgende betændelse6. Monocytter hjem til områder af betændelse og forårsage komplekse systemisk svar, der fører til udvikling af collateralization7.
Med brugen af intravital mikroskopi, kan vi studere funktionen af disse celler i vivo og observere homing af injicerede monocytter til områder af betændelse. De fleste tidligere undersøgelser kun beskrive slagtningen analyser, som holder ulemper, herunder en introduktion af histologiske artefakter og det store antal dyr kræves for præparater. Med vores tilgang, vi kan undersøge immunologiske processer og sikkerhedsstillelse dannelse via live imaging på flere tidspunkter.
Ud over udvikling af sikkerhedsstillelse arterier i iskæmiske områder påvirke monocytter også tumorvækst. For at undersøge disse processer, vi indsprøjte en basalmembran-lignende matrix udvundet af Engelbreth-Holm-sværm mus sarkom, en rig på ekstracellulære matrix proteiner8, tumor og analysere ved hjælp af intravital mikroskopi. Denne matrix bruges til skærm test molekyler til enten endotel celle netværks dannelse eller anti-cancer terapi gennem angiogene hæmning; i dette tilfælde vil vi vurdere tumor angiogene potentiale af monocytter for celle terapi9,10,11.
Formålet med denne protokol er at vise en nem og effektiv måde at studere immunologiske processer forårsaget af iskæmi i en i vivo model. Vi kan skabe et mere realistisk testmiljø i forhold til histologisk workup af slagtningen muskelvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
vores undersøgelse blev udført med tilladelse fra delstaten Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, efter § 8 i den tyske lov til beskyttelse af dyr. (§ 8, stk. 1, i den tyske lov til beskyttelse af dyr fra 18.05.2016 - BGBI. Jeg S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV fra 13.08.2013).
NOTE: til forsøg her, 8 til 12 uge gammel mandlige BALB/c mus blev brugt, og humane monocytter fra bloddonorer blev brugt til visualisering af monocytter via intravital mikroskopi.
1. celle forberedelse
Bemærk: til isolering af monocytter, se venligst vores tidligere offentliggjorte video på JoVE instruktioner: " Isolation og intravenøs injektion af Murine knoglemarv afledt Monocytter " af Wagner et al. 4
Bemærk: Hvornår arbejder med celler alle trin skal være steril at undgå kontaminering.
- Celle farvning med 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat
- Resuspend celler serum gratis dyrkningsmedium med en densitet på 1 x 10 6 celler/mL.
Bemærk: Kun serum gratis medium muliggør en effektiv farvning, da den lipofile farvestof ville ellers allerede erobret af lipofile komponenter af serum. - Tilføje 5 µL af 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat i dimethylformamid til 1 mL af cellesuspension og resuspend omhyggeligt.
- Incubate celle løsning ved 37 ° C i 20 min.
- Centrifugeres cellerne ved 37 ° C og 500 x g i 5 min.
- Løsne supernatanten og resuspend celler med 37 ° C varm føtal kalv serum suppleret medium.
- Gentag trin 1.1.4 og 1.1.5 dobbelt.
- Tælle celler med formlen:
- resuspend celler med 150 µL sterilt 0,9% NaCl opløsning.
- Indsprøjtes cellerne i halen vene.
- Resuspend celler serum gratis dyrkningsmedium med en densitet på 1 x 10 6 celler/mL.
2. Anæstesi
- Inhalation anæstesi
- fordampe isofluran ved hjælp af en vaporizer, ved hjælp af en koncentration på 5% i en lukket bin under en kemisk sikkerhed hætte.
- Håndterer musen omhyggeligt og sætte det ind i bin.
- Håndtere dyret i huden af den bageste hals, efter det er stoppet bevæger sig.
- Intraperitoneal anæstesi
Bemærk: Brug isofluran anæstesi, beskrevet under trin 2.1, til at udføre en intraperitoneal injektion. Med hurtig genopretning og kortvarigt virkende narkotisk virkning af isofluran anæstesi er det nemmere at håndtere musen og injicere intraperitoneal anæstesi.- Brug en opløsning af 2,4 mL ketamin (10%), 0,8 mL xylazin (2%) og 6,8 mL NaCl (0,9%) for intraperitoneal injektion.
- Vejer dyret før du anvender bedøvelsesmiddel.
Bemærk: Formel for narkose er:
- bruge en 1 mL insulin sprøjte med 30 G nål til at injicere løsningen i den venstre underbelly.
- Placere musen i sit bur og vente på narkotisk virkning.
Bemærk: Den narkotiske effekt normalt vises inden for 5 min. Hvis injektion var vellykket. Den korrekte dybde af anæstesi kan bestemmes ved fravær af enten låg refleks eller reaktion på tå knivspids, samt en regelmæssig, kontrolleret sats af vejrtrækning.
3. Implantation af basalmembranen-lignende Matrix
Bemærk: denne metode er brugt af vores gruppe til at studere tumor angiogenese efter monocyt injektion. Afhængigt af forsøgene, kan vækstfaktorer føjes til matrixen basalmembranen-lignende. Vi udførte femorale arterie ligatur før injektion tumor i flanke af musen. Matrixen skal have en temperatur på 4 ° C for injektion. Ved denne temperatur er matrix væske; gelen hærder til en solid ved kropstemperatur (37 ° C). For bedre synlighed den subkutane matrix stik, barbere huden af mus på injektionsstedet.
note: valgfri: tilføje 100 ng basic fibroblast vækstfaktor, 300 ng vaskulær endotel vækstfaktor, og 26 IE heparin under sterile forhold til basalmembranen-lignende matrix.
- Indlæse 1 mL af matrix i en 30 G insulin sprøjte og butik på køl indtil brug.
- Lå dyret på bordet og holde huden af musen ud for injektionsstedet på flanken.
- Indsprøjtes 500 µL af matrixen basalmembranen-lignende subkutant.
NOTE: Af praktiske grunde, det er nødvendigt at injicere basalmembranen-lignende matrix kompakt på ét sted at subkutan undgås. Det vil være lettere at løsne den kunstige tumor fra vævet efter ofrer mus i slutningen af forsøget.
4. Hale vene injektion
Bemærk: praksis hale vene injektion med NaCl løsning på forsøgsdyr før eksperimenter. Hvis monocytter ikke tilstrækkeligt injiceres i halen vene, bliver der ingen systemisk effekt på collateralization. I denne protokol sprøjtet vi 2,5 millioner monocytter. Prøv at injicere ikke mere end 5 µL/g legemsvægt.
- Anvendes en monocyt opløsning fremstillet under trin 1.1.8 indeholdende 2,5 millioner monocytter.
- Bruger en 30 G kanyle og en 1 mL insulin sprøjte den injektionsvæske.
- Omhyggeligt håndtere musen, dy dyret i Tilbageholderen, og sørg for, at musen ikke er skadet og har tilstrækkelig plads til vejrtrækning.
- Sætte Tilbageholderen på den hede afrivningsblok, således at halen kan kontakte pladen.
- Identificere hale vener, som er placeret på den laterale side af halen.
- Stikke halen 90 °, så den hale vene vises på oversiden af halen.
- Desinficere injektion side før injektion af monocytter.
- Prøv at injicere monocyt løsning i en flad vinkel med facet af nålen står op.
Bemærk: Stoppe injektion, hvis en blister vises, da dette er et tegn på en mislykket injektion. Forsøge proceduren igen mere proksimalt. - Stoppe blødninger ved injektionsstedet ved at anvende blid pres på halen for omkring 60 erne.
- Observere dyret i 30 min til at overvåge for systemiske bivirkninger og placere musen i sit bur, efter at dyret er fuldt genoprettet.
5. Intravital mikroskopi
- forberedelse
- opstille den bedøvede mus på varmepude (37 ° C) til at holde en konstant temperatur og lave poter på plads med selvklæbende tape.
- Desinficere huden i stedet for ben eller flanke, der bruges til mikroskopi.
- Barbere region af interesse for bedre håndtering og for at undgå interferens med hår.
- Punktafgifter huden med en steril skalpel og fine pincet i et firkantet område af 0,5 x 0,5 cm.
Bemærk: Det er vigtigt at holde område af interesse fugtig; ellers vil være kompromitteret kvalitet billeder og væv. NaCl løsning kan bruges til at fugte området. - Placer ben mellem to justerbare frimærker og placere et cover glas oven på frimærkerne.
- Sikre væv er vådt og er i kontakt med glasset.
- Inject 50 µL rodamin dextran retrobulbær i det venøse system for bedre synlighed af fartøjerne.
- Start mikroskopi og justere placeringen af benet, hvis nødvendigt.
- Intravital mikroskopi indstillinger
- tænde mikroskopet, computer, elektroniske grænseflader og lasere.
- Slår varmeenhed inkubation kammer og/eller varme fase (plade/pad), og Indstil temperaturen til 37 ° C.
- Start erhvervelse software. Hvis mikroskop er udstyret med en resonant scanner, skal du vælge denne hurtige scannetilstand.
- Vent indtil temperaturen når et konstant niveau (35-37 ° C)
Bemærk: En stabil temperatur er vigtigt for: (a) de mus, som under anæstesi ikke kan styre sin kropstemperatur, og (b) at undgå eller i det mindste minimere fokale drift. Dette kan tage 1 time til flere timer, afhængigt af de omgivende betingelser (fx, klimaanlæg og antallet af varmekilder i værelset, herunder mennesker). Hvis nedsænkning mål bruges, er zonen kontakt mellem objektivet og dække glas (eller væv) en typisk kilde til ustabilitet. Varme linsen med en objektiv vandvarmer kan hjælpe; Alternativt, et mikroskop med en autofokussystem anbefales. - Vælg en forstørrelse linsen med en høj talord blænde, der opfylder kravene til opløsning af eksperimentet (se note i slutningen af dette afsnit).
- Optimere indstillingerne mikroskop gevinst, kanalindstillinger, scanning hastighed, pixel opløsning, dybde volumen, skridt nummer, og gennemsnit før du placerer det eksperimentelle dyr på scenen.
- Scanne begge veje til at reducere erhvervelse tid.
- Opstille den bedøvede mus på stadiet forvarmet mikroskop efter mikroskop har nået stabil betingelser og indstillinger er blevet testet ved hjælp af en dummy.
- Bringe region af interesse inden for matrixen basalmembranen-lignende i fokus ved hjælp af lyse lys belysning og inspicere kortvarigt kapillærerne af ultraviolet lys med passende filterindstillinger for den anvendte fluorophores.
- Skifter til scannetilstand; starte scanning på lav opløsning 256 x 256 og styrke gevinst og laser magten indtil et signal er observeret på monitoren.
- Fokus på strukturen af interesse. Zoome ind, indtil alle detaljer er synlige.
- Definer " starter " og " slutningen " positioner i aksial retning.
- Stopper scanning.
- Definerer stepping størrelse (fx, 0,5 µm) og antallet af focal fly (f.eks. 10-20).
- Kontakten til den endelige pixel opløsning (512 x 512 eller 1.024 x 1.024) afhængigt af hastigheden af den bevægende subcellulært strukturer eller celler og vælg scanningen hastighed (scan frekvens) der passer bedst til bevægelser. Tovejs scanning anbefales til at fastgøre erhvervelse af stakke.
Bemærk: Vælg den højeste søgehastighed af scanning, der giver tilstrækkelig billedkvalitet. Typiske punkt scannere giver hastigheder mellem 400 Hz og 1,4 kHz. Resonant scannere giver en yderligere 8 kHz eller 12 kHz. Ved at reducere antallet af linjer i y-retning, søgehastigheden kan øges yderligere (typiske værdier er 512 x 512, 512 x 256 eller 512 x 200 pixel opløsning). Afhængigt af signal-støj-forhold, kan man forsøge at forbedre billedkvaliteten ved at tilføje linjen gennemsnit mellem 2 og 4. Typisk, en indstilling af 512 x 200 med ingen gennemsnit resulterer i en erhvervelse/tidsramme 18 MS i den torettede tilstand med en 8 KHz resonant scanner; med 512 x 200 og 4 x gennemsnit, det bremser ned til 56 ms pr. ramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi for undersøgelse af tumor og sikkerhedsstillelse fartøj vækst udløst af monocytter kan hjælpe med at afsløre nye aspekter i de molekylære mekanismer af tumor angiogenese og arteriogenesis. Celler skal forberedes og injiceres omhyggeligt ved hjælp af trinene i protokollen. Forskelle kan føre til variationer mellem enkelt eksperimenter. Monocytter skal injiceres i det venøse system (figur 1) for at fastholde systemiske virkninger og undgå emboli, som kan opstå, hvis injektionen foregår i det arterielle system.
Hvis basalmembranen-lignende matrix bruges, indsprøjte langsomt for at undgå spredning vil hjælpe med plug explantation for yderligere histologisk undersøgelse (figur 2, figur 3). Efter at gå på kompromis med musen, vil være explanted basalmembranen-lignende matrix stikket fra flanke af musen. Inden for basalmembranen-lignende matrix stikket, kan vi måle vascularization ved at tælle kapillærer inden for forskellige eksperimentelle indstillinger (figur 4, figur 5).
En anden forudsætning for vellykkede eksperimenter er indstillingen mikroskop, som afhænger af software, hardware og animalske forberedelse (figur 6). Hvis subcellulært strukturer (< 2 µm) skal identificeres, en opretstående mikroskop med 2-Photon-excitation og vand fordybelse mål (20 X eller 25 X, talord blænde 1.0) med lange arbejde afstand (> 2 mm) er tilrådeligt. Da vand fordybelse mål med høj talord blænde er ekstremt følsomme over for brydningsindekset variationer, skal den optimale billedopløsning og lysstyrke justeres ved at flytte en korrektion krave på målet. Justering af hånd er desværre ret vanskelig på grund af begrænset plads. Derfor tilbydes dyre mål med en motoriseret krave korrektion af mikroskop producenter.
Hvis cellulære opløsning (5-10 µm) er tilstrækkelig, en 10 x tør linsen med et talord blænde 0,4 eller højere og en lang arbejde afstand (> 2 mm) anbefales. I dette tilfælde kan en opretstående eller en inverteret mikroskopholderen vælges. Live celle imaging med en 10 X tør linse (talord blænde 0,4) ved højere zoom faktorer (> 3) er meget lettere og billigere fordi klassisk Konfokal laser scanning mikroskopi (dvs., 1 Photon excitation) kan bruges til at opnå billedstakke med tilstrækkelig opløsning. Hvis der kræves meget tid for erhvervelse af billeder, nedsætter mængden af rhodaminfilteret dextran inden for fartøjet. For en bedre synlighed af fartøjerne, injektion af fluorophore skal gentages (figur 7).
Det er mest effektivt at prøve forskellige justeringer og bestemme den bedste mulige billedkvalitet. Brugen af positiv sonder til celler eller basalmembranen-lignende matrix (uden transplantation) kan hjælpe med at få optimale indstillinger. Vi kunne opdage mærket monocytter via intravital microcopy inden for blod-flow og muskel væv (figur 8, figur 9). Histologiske undersøgelse af væv sektioner kontrollerer vores resultater (figur 10).
Figur 1 : Injektion af 2,5 millioner monocytter i halen vene. Vener er placeret på den laterale side af halen, med arterier på dorsal og ventral side. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Injektion af basalmembranen-lignende matrix. Håndtere huden af musen og injicere basalmembranen-lignende matrix i flanken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksplanterede matrix plug fra flanke af musen (se punkt 3.5). Indbygget fartøjer fem dage efter monocyt transplantation via hale vene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Sammenligning af vascularization inden for matrixen basalmembranen-lignende ( 
+ SD, n = 3 i hver gruppe). Fartøjer inden for de basalmembranen-lignende matrix plug, med ingen vækst faktor tilføjet (rød bar), sammenlignet med fartøjer fra basalmembranen-lignende matrix plug med vækst faktor tilføjet. Tilskud af basalmembranen-lignende matrix med vækstfaktor fører til øget fartøj vækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Fartøjer inden for basalmembranen-lignende matrix plug. Visualisering af blood flow (rød) inden for fartøjer (pile) og monocyt homing (grønne) inden for basalmembranen-lignende matrix plug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Musen forberedt til billede erhvervelse. Poterne er fast med dobbeltklæbende tape og en cover glas er placeret på toppen af to justerbare frimærker. Regionen af interesse var skåret ud med en skalpel. NaCl bruges til at fugte området, så kvaliteten af billeder og væv ikke vil blive kompromitteret. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Faldt synlighed af fartøjer. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat farves monocytter (pile) i kælderen membran-lignende matrix ved siden af et fartøj (længdesnit, *). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Monocyt skyllet i fartøj. In vivo visualisering af 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat farves og transplanteret monocyt (grøn, pil) inden for den sikkerhedsstillelse arterie (*). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Intravital mikroskopi. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat farves monocytter (pile) inden for sikkerhedsstillelse fartøjer med typiske proptrækker dannelse (*) farves med rodamin dextran. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Immunohistological farvning af låret muskulatur. Fartøjer (rød: alpha glat-muskel aktin, *), makrofager (grøn: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat, pile), cellekernen (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet her kaster lys over udviklingen af sikkerhedsstillelse arterier, opførsel af monocytter i disse fartøjer, og processen med arteriogenesis. Trin for at anvende denne protokol er nemme at lære og kan bruges i andre områder af videnskab. På trods af disse fordele er der nogle ulemper. For eksempel, er mikroskopiske udstyr forpligtet til at udføre de beskrevne teknikker. At få udstyr til et eksperiment er uholdbar, så det er vigtigt at samarbejde med andre institutioner til at dele enhederne.
Der er andre problemer forbundet med denne protokol, der kan undgås med praksis. I begyndelsen, der kan være problemer med positionering musen under mikroskopet og billedkvaliteten kan lider under disse omstændigheder. Et andet kritisk punkt er hale vene injektion. Monocytter kan kun ses i venerne, hvis sprøjtes korrekt. Derfor er det tilrådeligt at praktisere injektion før du placerer musen.
Monocyt isolation er også kritisk. Monocytter kan isoleres fra forskellige arter ved hjælp af flere protokoller, som ofte fører til forskellige resultater og celle udbytter12,13,14. Det er nødvendigt at arbejde under sterile forhold til at undgå forurening. Celleskader skal forebygges ved pipettering omhyggeligt og opretholdelse af konstant temperatur.
Trods disse ulemper er denne metode praktisk og let at udføre, muliggører brugernes hen til kaste lys over de grundlæggende mekanismer bag perifer arteriel sygdom og tumor angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af ELSE-Kröner-Stiftung og den DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, tysk Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, forskningssamarbejde center). Særlig tak til Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke Universitet Magdeburg, Magdeburg, Tyskland, for teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
