Summary
ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.
Abstract
המטרה הטיפולית של מחלת עורקים היקפית, מחלת לב איסכמית היא להגביר את זרימת הדם לאזורים איסכמי הנגרמת על ידי היצרות בגרימת. כירורגיית כלי דם היא אפשרות מעשית במקרים נבחרים, אך עבור חולים ללא אינדיקציות לניתוח כמו התקדמות לנוח כאב, איסכמיה איבר חיוני או השיבושים הגדולים החיים או לעבוד, יש כמה אפשרויות להקלת המחלה שלהם. טיפול בתאי דרך משופרת מונוציט זלוף באמצעות הגירוי של משני צורה היא אחת מתוך כמה אפשרויות לא פולשנית.
הקבוצה שלנו בוחן את arteriogenesis לאחר ההשתלה מונוציט לתוך עכברים באמצעות מודל איסכמיה hindlimb. בעבר, הראו שיפור זלוף hindlimb באמצעות השתלת מגורה-טטנוס מונוציט syngeneic. בנוסף, את ההשפעות על היווצרות משני הגידול יכולה להיות מושפעת גם טיפול זה. כדי לחקור תופעות אלה, אנו משתמשים דגם העכבר כמו קרום המרתף מטריקס באמצעות הזרקה של מטריצה חוץ-תאית סרקומה Engelbreth-הולם-נחיל לתוך האגף של העכבר, לאחר חסימה של עורק הירך.
לאחר הלימודים גידול מלאכותיים, אנו משתמשים במיקרוסקופ intravital ללמוד ויוו -אנגיוגנזה ו מונוציט ביות בתוך העורקים משני. מחקרים קודמים תיארו בחינה היסטולוגית של מודלים בבעלי חיים, אשר מובנית כבר חשפה לחפצים פוסט-מורטם . הגישה שלנו מדמיין מונוציט יונת לאזורים של collateralization רצפים בזמן אמת, קל לביצוע, והוא חוקר את התהליך של אנגיוגנזה arteriogenesis ואת הגידול בתוך vivo.
Introduction
מחלות לב וכלי דם, כולל מחלת לב כלילית או מחלת עורקים היקפית, הם הסיבות הנפוצות ביותר של מוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי היא גישה מבטיחה לטיפול במחלות לב וכלי דם, במיוחד עבור אנשים שאינם יכולים לעבור התערבויות כירורגיות. ישנן מספר גישות לשימוש תאים או חומרים מופרשים שלהם הכלי הטיפולי2,3, עם המטרה הכוללת לשפר את זלוף ולשמור על תפקוד לרקמות איסכמי, underperfused. ניסיון אחד כדי להשיג מטרה זו היא לשפר את arteriogenesis, אשר משפר את התפתחות משני העורקים. ומונוציטים הן סוג של תא חשובים הקשורים collateralization. הקבוצה שלנו התמקדה חוקרת את ההשפעות של monocytes באזורים של דלקת4,5, במיוחד באמצעות מודל איסכמיה hindlimb לזירוז איסכמיה ושלאחר דלקת6. ומונוציטים הביתה לאזורים של דלקת וגורמים תגובות מורכבות מערכתית להוביל להתפתחות של collateralization7.
עם השימוש של מיקרוסקופ intravital, אנחנו יכולים ללמוד את אופן הפעולה של אלה תאים ויוו ולבחון את יונת של monocytes שהוחדר לאזורים של דלקת. רוב המחקרים לשעבר לתאר רק אחרי המוות ניתוחים, המחזיקים חסרונות כולל הקדמה של חפצים היסטולוגית ומספרים גדולים של בעלי חיים נדרש על ההכנות. בגישה שלנו, אנחנו יכולים לחקור תהליכים אימונולוגי ולחיות משני צורה באמצעות הדמיה בנקודות זמן מרובים.
בנוסף התפתחות עורקים משני התחומים איסכמי, ומונוציטים גם להשפיע על הגידול. לחקור תהליכים אלו, אנו מזריקים מטריצה כמו קרום המרתף מופק סרקומה של העכבר Engelbreth-הולם-נחיל, גידול עשיר במטריצה חוץ-תאית חלבונים8, לנתח באמצעות מיקרוסקופ intravital. מטריצה זו משמשת ממבחן מולקולות או היווצרות רשת תא אנדותל או טיפולים אנטי סרטניים באמצעות עיכוב האנגיוגנזה; במקרה זה, ואנו נעריך את הפוטנציאל האנגיוגנזה הגידול של monocytes תא טיפול9,10,11.
המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין דרך קלה ויעילה ללמוד תהליכים אימונולוגי הנגרמת על ידי איסכמיה במודל ויוו . אנחנו יכולים ליצור סביבת בדיקה מציאותית יותר בהשוואה workup היסטולוגית של רקמת השריר לאחר המוות .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר שלנו בוצעה באישור מדינת סקסוניה-אנהלט, האלי Landesverwaltungsamt, על פי סעיף 8 לחוק הגרמני להגנת בעלי חיים. (§ 8, פסקה 1 של החוק הגרמני להגנת בעלי חיים מן 18.05.2016 - BGBI. אני S. רכבת 1206, 1313, § 31 TierSchVersV מ- 13.08.2013).
הערה: בשביל הניסויים כאן, שימשו 8-12 שבוע זכר BALB/c עכברים, ומונוציטים האנושי מתורמים דם שימשו את החזיית ומונוציטים באמצעות מיקרוסקופ intravital.
1. הכנה תא
הערה: לקבלת בידודו של monocytes, בבקשה ראה וידאו שפורסם הקודם שלנו על יופיטר לקבלת הוראות: " בידוד, תוך ורידי הזרקה של מאתר מח עצם נגזר ומונוציטים " על ידי. וגנר et al. 4
הערה: כאשר עובד עם התאים כל השלבים חייב להיות סטרילי כדי למנוע זיהום.
- תא מכתים עם 3,3 '-פרכלורט Dioctadecyloxacarbocyanine
- Resuspend התאים במדיום תרבות חופשית סרום, עם צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל.
הערה: רק בינוני חינם הנסיוב מאפשר יעיל מכתים, מאז לצבוע lipophilic אחרת כבר ייתפס על ידי מרכיבי הסרום lipophilic. - 5 להוסיף µL של 1 מ מ 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט ב dimethylformamide מ ל 1 של התליה תא, resuspend בזהירות.
- Incubate הפתרון תא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק.
- Centrifuge התאים ב 37 ° C ו- g x 500 עבור 5 דק.
- לסלק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים 37 ° C עגל עוברית חמים סרום שיושלם בינונית.
- חזור על השלבים 1.1.4 ו 1.1.5 פעמיים.
- לספור את התאים בנוסחה:
- resuspend התאים עם 150 µL 0.9% NaCl פתרון סטרילי.
- להזריק את התאים לתוך הווריד זנב של.
- Resuspend התאים במדיום תרבות חופשית סרום, עם צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל.
2. הרדמה
- באינהלציה הרדמה
- לאדות איזופלוריין בסיוע מכשיר אידוי באמצעות בריכוז 5% בתוך סל סגור תחת ברדס בטיחות כימית.
- להתמודד עם העכבר בזהירות ושים אותו לפח.
- להתמודד עם החיה בעור הצוואר האחורי, לאחר שהפסיק לנוע.
- הרדמה בקרום הבטן
הערה: שימוש איזופלוריין הרדמה, המתוארים תחת שלב 2.1, לבצע זריקה בקרום הבטן. עם שחזור מהיר, קצרת השפעה נרקוטית של ההרדמה איזופלוריין, קל יותר להתמודד עם העכבר, להזריק הרדמה בקרום הבטן.- להשתמש פתרון של 2.4 מ ל קטמין (10%), 0.8 מ ל חריגות השירותים הווטרינריים (2%) ו- mL 6.8 NaCl (0.9%) עבור הזריקה בקרום הבטן.
- שוקל את החיה לפני החלת הרדמה.
הערה: הנוסחה ההרדמה היא:
- להשתמש מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30 G כדי להזריק את הפתרון לתוך הבטן הרכה שמאלה.
- למקם העכבר בכלוב ולחכות השפעה נרקוטית.
הערה: השפעה נרקוטית בדרך כלל מופיע בתוך 5 דקות אם הזריקה הייתה מוצלחת. עומק ההרדמה הנכון יכול להיקבע על ידי העדר רפלקס המכסה או תגובה קמצוץ הבוהן, כמו גם קצב קבוע, מבוקר של נשימה.
3. השרשה של קרום המרתף כמו מטריקס
הערה: בשיטה זו משתמשים על-ידי הקבוצה שלנו ללמוד אנגיוגנזה לאחר ההזרקה מונוציט. בהתאם הניסויים, גורמי גדילה יכולים להתווסף אל המטריקס כמו קרום המרתף. ביצענו מצדו עורק הירך לפני הזרקת הגידול באגפים של העכבר. המטריקס חייב להיות לטמפרטורה של 4 ° C עבור ההזרקה. בטמפרטורה זו, המטריקס היא נוזל; הג'ל מחזק למצב מוצק בטמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס). עבור ניראות טובה יותר של המטריקס תת עורית פלאג, לגלח את העור של העכבר באתר הזרקת.
הערה: אופציונלי: להוסיף 100 ng בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה 300 ng כלי הדם צמיחה אנדותל, הפארין 26 I.U. בתנאים סטריליים למטריקס כמו קרום המרתף.
- לטעון 1 מ"ל של מטריקס לתוך מזרק אינסולין 30 G ואת החנות על הקרח עד שימוש.
- שכב החיה על השולחן והחזק את העור של העכבר ליד ההזרקה לאגף.
- להזריק µL 500 של המטריקס, כמו קרום המרתף subcutaneously.
הערה: מטעמים פרקטיים, יש צורך להזריק את המטריקס, כמו קרום המרתף ברוחבו במיקום אחד כדי למנוע פיזור תת עורית. זה יהיה קל יותר מכך הגידול מלאכותי של הרקמות לאחר הקרבת את העכבר בסוף הניסוי.
4. זנב הווריד הזרקת
הערה: לתרגל את הזריקה וריד הזנב עם פתרון NaCl על מבעלי החיים לפני ניסויים. אם ומונוציטים לא יכול להיות מוזרק במידה מספקת את תקחי את הזנב, תהיה השפעה מערכתית על collateralization. ב פרוטוקול זה, היינו מזריקים גם ומונוציטים 2.5 מיליון. נסה להחדיר µL לא יותר מ 5/g של bodyweight.
- להשתמש הפתרון מונוציט מוכן תחת שלב 1.1.8 המכילה 2.5 מיליון ומונוציטים.
- השתמש מחט 30 G ומזרק אינסולין 1 מ"ל על הזריקה.
- בקפידה להתמודד עם העכבר לרסן את החיה restrainer, ודא העכבר אינו נפגע, יש מרחב הולם עבור הנשימה.
- לשים את restrainer על כרית החימום כך הזנב יכולים לפנות את הצלחת.
- לזהות את הוורידים הזנב, אשר ממוקמים על הצד הלטראלי של הזנב.
- להפוך את הזנב 90 מעלות, כך הווריד הזנב מופיע בחלק העליון של הזנב.
- לחטא את הצד הזרקה לפני הזרקת את ומונוציטים.
- לנסות להזריק את הפתרון מונוציט ב זווית שטוחה עם שפוע של המחט פונה למעלה
הערה: לעצור את הזריקה אם שלפוחית מופיע, כמו זה סימן של זריקת שנכשלו. ניסיון ההליך שוב הציר הקרוב יותר. - להפסיק הדימום באתר הזרקת על ידי הפעלת לחץ עדין על הזנב בשביל בערך בשנות ה-60.
- להתבונן החיה למשך 30 דקות לפקח על תופעות לוואי מערכתית ומקם את העכבר בכלוב שלו אחרי החיה הוא החלים לחלוטין.
5. מיקרוסקופ intravital
- הכנת
- למקם העכבר anesthetized על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת חום קבועה ולתקן את כפות רגליו במקום עם דבק.
- לחטא את העור באתר של הרגל או האגף המשמשת עבור מיקרוסקופ.
- לגלח את האזור עניין טיפול טוב יותר, כדי למנוע הפרעה עם שיער.
- לסלק את העור עם האזמל סטרילי, מלקחיים בסדר באזור הכיכר של 0.5 x 0.5 ס מ.
הערה: חשוב לשמור על האזור עניין לח; אחרת, איכות התמונות ואת הרקמה יפגע NaCl פתרון יכול לשמש כדי להרטיב את האזור. - למקם את הרגל בין שתי בולים מתכווננת ומקם זכוכית מכסה על גבי הבולים.
- להבטיח הרקמה רטוב והוא במגע עם הכוס.
- הפצוע למרכז הרect 50 µL rhodamine retrobulbar לתוספי לתוך מערכת ורידים עבור ניראות טובה יותר של כלי.
- להתאים את המיקום של הרגל במידת הצורך ומתחילים מיקרוסקופ.
- הגדרות מיקרוסקופ intravital
- הפעלת מיקרוסקופ, במחשב, ממשקים אלקטרוניים, וכן לייזרים.
- להפעיל יחידת החימום של דגירה קאמרית ו/או חימום שלב (צלחת/מקלדת) והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס.
- להתחיל את רכישת התוכנה. אם המיקרוסקופ הינו מצויד עם סורק תהודה, בחר במצב סריקה מהירה זה.
- לחכות עד שהטמפרטורה מגיע רמה קבועה (35-37 מעלות צלזיוס)
הערה: טמפרטורה יציבה חשוב עבור: (א) את העכבר, אשר תחת הרדמה לא יכול לשלוט טמפרטורת הגוף שלה, ואת הסחף מוקד (ב) הימנעות או לפחות למזער. זה יכול לקחת 1 h מספר שעות, בהתאם לתנאי הסביבה (למשל, מערכת מיזוג אוויר ואת מספר מקורות חום בחדר, כולל אנשים). אם מטרות טבילה משמשים, אזור קשר בין העדשה ואת כיסוי זכוכית (או רקמות) הוא מקור טיפוסי של חוסר יציבות. חימום העדשה עם חימום אובייקטיבית עשויה לעזור; לחלופין, מיקרוסקופ עם מערכת פוקוס אוטומטי ומומלץ- - בחר עדשה הגדלה עם צוהר ספרתיות גבוהות שתספק את הדרישות ברזולוציה של הניסוי (ראו הערה בסוף סעיף זה).
- למטב את הגדרות מיקרוסקופ ביחס לרווח, הגדרות הערוצים, מהירות סריקה, פיקסל ברזולוציה, נפח עומק, שלב בגודל בממוצע לפני הצבת החיה ניסיוני על הבמה.
- סרוק ההכפלה כדי לצמצם את זמן רכישת.
- למקם את העכבר anesthetized על הבמה מיקרוסקופ prewarmed אחרי המיקרוסקופ הגיעה תנאים יציבים, ההגדרות נבדקו בעזרת בובה.
- להביא את האזור של עניין בתוך המטריצה כמו קרום המרתף להתמקד באמצעות תאורה אור בהיר ולבדוק בקצרה הנימים באור אולטרה סגול עם הגדרות המסנן נאותה אפלייד fluorophores.
- לעבור סריקה מצב; להפעיל סריקה ברזולוציה נמוכה 256 x 256 ב"מוד ולא רווח ולשפר לייזר כוח עד אות נצפית על המסך.
- פוקוס על המבנה של ריבית. תקריב עד כל הפרטים גלויים.
- הגדר " להתחיל " ו- " סיום " עמדות לכיוון צירית.
- לעצור את הסריקה.
- הגדרת הגודל דריכה (למשל, 0.5 מיקרומטר) ומספר מטוסים נקודתית (למשל, 10-20). מהירות
- מתג עד רזולוציה פיקסל הסופי (512 x 512 או 1,024 x 1,024) בהתאם למהירות של מבנים subcellular נע או תאים, בחר הסריקה (תדירות סריקה) שמתאים כמיטב יכולתה התנועות. דו-כיווני סריקה מומלצת, כדי להדק את הרכישה של ערימות.
הערה: בחר את קצב הסריקה הגבוהה ביותר של סריקת שנותן מספקת איכות תמונה. נקודת טיפוסי סורקים לספק מהירויות בין 400 Hz-1.4 kHz. סורקים תהודה מספקים של 8 kHz או 12 kHz נוספים. על-ידי הפחתת מספר השורות בכיוון-y, קצב הסריקה יכול להיות גדל עוד יותר (ערכים אופייניים הם 512 x 512, 512 x 256 או 512 x 200 פיקסלים ברזולוציה). בהתאם יחס אות לרעש, אפשר לנסות לשפר את איכות התמונה על ידי הוספת קו ממוצע של בין 2 ל-4. בדרך כלל, הגדרה של 512 x 200 ללא תוצאות חישוב ממוצע רגיל רכישה/מסגרת זמן של ms 18 במצב דו-כיוונית עם סורק תהודה 8 קילו-הרץ; עם 512 x 200 ו- 4 x בממוצע, מאט ל ms 56 לכל מסגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital מיקרוסקופ לבדיקה של גידול וצמיחה משני כלי המופעלות על-ידי ומונוציטים יכול לעזור לגלות אספקטים חדשים בהמנגנון המולקולרי של אנגיוגנזה, arteriogenesis. התאים חייב להיות מוכן, מוזרק בזהירות באמצעות השלבים של הפרוטוקול. ההבדלים יכול להוביל וריאציות בין ניסויים יחיד. ומונוציטים חייב להיות מוזרק לתוך מערכת ורידים (איור 1) כדי לשמור על תופעות מערכתיות למנוע תסחיף, אשר יכול להתרחש אם ההזרקה מתבצעת במערכת העורקים.
אם קרום המרתף כמו מטריקס, הזרקת באיטיות כדי למנוע פיזור יעזור עם תקע explantation לבדיקה היסטולוגית נוסף (איור 2, איור 3). לאחר הקרבת את העכבר, explanted את התקע קרום המרתף כמו מטריקס מן האגף של העכבר. בתוך התקע קרום המרתף כמו מטריקס, אנו יכולים למדוד vascularization על ידי ספירת נימים בתוך הגדרות ניסיוני שונות (איור 4, איור 5).
תנאי נוסף עבור ניסויים מוצלחים הוא ההגדרה מיקרוסקופ, אשר תלויה בתוכנה או בחומרה, הכנת בעלי חיים (איור 6). אם המבנים subcellular (< 2 מיקרומטר) צריך להיות מזוהה, מיקרוסקופ זקוף עם 2-פוטון-עירור ומים טבילה יעדים (20 X או 25 X, צמצם ספרתיות 1.0) עם זמן ומרחק עבודה (> 2 מ מ) הם רצוי. מאז מטרות טבילה במים עם הפתח ספרתיות גבוהות רגישים במיוחד וריאציות שבירה, רזולוציית תמונה אופטימלית והבהירות שתישמר על-ידי הזזת קולר תיקון בנקודת היעד. למרבה הצער, התאמת ביד קשה למדי עקב שטח מוגבל. לכן, מטרות יקר עם תיקון צווארון ממונע מוצעים על-ידי יצרני מיקרוסקופ.
אם רזולוציית הסלולר (5-10 מיקרומטר) מספיק, סימן x 10 יבש עדשה עם הפתח ספרתיות 0.4 ומעלה, הרבה זמן ומרחק עבודה (> 2 מ מ) מומלץ. במקרה זה, ניתן לבחור ישר או דוכן של מיקרוסקופ הפוכה. בהופעה תא הדמיה עם 10 X עדשה יבש (ספרתיות צמצם 0.4) גורמים זום גבוה יותר (> 3) הוא הרבה יותר קל וזול. כי קלאסית לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (קרי, עירור פוטון 1) יכול לשמש כדי להשיג את אוספי תמונות עם מספיק רזולוציה. אם הרבה זמן נדרש לצורך רכישת תמונות, מפחיתה מכמות לתוספי rhodamine בתוך הכלי. נראות טוב יותר של כלי, ההזרקה של fluorophore חייב להיות חוזרות (איור 7).
זה הוא היעיל ביותר לטעום התאמות שונות ולהחליט את איכות התמונה המיטבית אפשרי. השימוש של הגששים חיובי עבור תאים או קרום המרתף כמו מטריקס (ללא השתלת) יכול לעזור לקבל את הגדרות אופטימלי. אנחנו יכולים לזהות ומונוציטים שכותרתו ויה microcopy intravital בתוך הדם זרימת ואת שריר רקמת (איור 8, איור 9). בדיקה היסטולוגית של מקטעי רקמת מאמת את הממצאים שלנו (איור 10).
איור 1 : הזרקה של 2.5 מיליון ומונוציטים לווריד הזנב. ורידים ממוקמים בצד הלטראלי של הזנב עם עורקים בצד הגבי של הגחון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הזרקה של מטריקס, כמו קרום המרתף. להתמודד עם העור של העכבר ולהזריק את המטריקס, כמו קרום המרתף באגפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Explanted מטריקס תוסף מבית האגף של העכבר (ראה הצבע 3.5). כלי incorporated חמישה ימים לאחר ההשתלה מונוציט דרך הווריד של הזנב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : השוואה של vascularization בתוך המטריצה כמו קרום המרתף ( 
+ SD, n = 3 בכל קבוצה). כלי בתוך קרום המרתף כמו מטריקס בתקע, עם אין צמיחה גורם נוסף (בר אדום), לעומת כלי של הכנס כמו קרום המרתף מטריצה עם פקטורי גדילה הוסיף. תוספת של קרום המרתף דמוי מטריצה עם פקטורי גדילה מוביל גידול כלי מוגברת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : כלי בתוך התקע מטריקס כמו קרום המרתף. ויזואליזציה של הדם לזרום (אדום) בתוך כלי (חיצים), מונוציט ביות (ירוק) בתוך התקע קרום המרתף כמו מטריקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : העכבר שהוכנו עבור רכישת התמונה. תפרים קבועים עם דבק, כוס הכיסוי ממוקם בראש שתי בולים מתכווננת. האזור של הריבית הייתה טוחנות עם אזמל. NaCl משמש כדי להרטיב את האזור כך איכות התמונות ואת הרקמה לא תיחשף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : ירד ניראות של כלי. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט צבעונית ומונוציטים (חיצים) בתוך קרום המרתף כמו מטריקס ליד קיבול (חתך, *). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8 : מונוציט לרוקן לתוך כלי הקיבול. In vivo ויזואליזציה של 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט צבעונית, מושתלים מונוציט (חץ ירוק) בתוך העורק משני (*). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9 : מיקרוסקופ intravital. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט צבעונית ומונוציטים (חיצים) בתוך כלי משני עם היווצרות העקלתונית טיפוסי (*) מוכתם לתוספי rhodamine. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10 : Immunohistological מכתים של מערכת השרירים הירך. כלי (אדום: שריר חלק אלפא אקטין, *), מקרופאגים (ירוק: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט, חצים), גרעין התא (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן שופך אור על התפתחות משני העורקים, את אופן הפעולה של monocytes בכלי האלה, ואת התהליך של arteriogenesis. השלבים על יישום פרוטוקול זה הם קל ללמוד והוא יכול לשמש גם בתחומים אחרים של המדע. למרות היתרונות הללו, ישנם כמה חסרונות. למשל, מיקרוסקופיים ציוד נדרש לבצע את הטכניקות המתואר. קבלת ציוד עבור ניסוי אחד בלתי נסבלת, לכן חשוב לשתף פעולה עם מוסדות אחרים לחלוק את המכשירים.
ישנם קשיים אחרים הקשורים פרוטוקול זה כי ניתן למנוע עם תרגול. בהתחלה, יכולות להיות בעיות עם מיקום העכבר מתחת למיקרוסקופ, איכות התמונה עלולים לסבול גם בנסיבות אלו. נקודה קריטית נוספת היא הזריקה וריד הזנב. ומונוציטים רק ניתן לראות את הוורידים אם מזריקים אותו כראוי. לכן, מומלץ לתרגל את הזריקה לפני מיקום העכבר.
מונוציט הבידוד גם היא קריטית. ומונוציטים ניתן לבודד ממינים שונים באמצעות פרוטוקולים מרובים, אשר לעיתים קרובות להוביל לתוצאות שונות תא התשואות12,13,14. זה הכרחי לעבודה בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום. יש למנוע נזק לתאים pipetting בקפידה, שמירה על טמפרטורה קבועה.
למרות חסרונות אלה, שיטה זו היא פרקטית וקלה לביצוע, המאפשר למשתמשים לשפוך אור על אנגיוגנזה ולפי המנגנון הבסיסי מאחורי מחלת עורקים היקפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אחרת-Kröner-Stiftung ו SFB DFG (פתוח, קרן מחקר גרמני) 854 (Sonderforschungsbereich, מרכז מחקר שיתופי). תודה מיוחדת הנס-הולגר Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, אוטו-פון-Guericke אוניברסיטת מגדבורג, מגדבורג, גרמניה, לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
