Summary
Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.
Abstract
주변 동맥 질환과 허 혈 성 심장 질환에 대 한 치료 목표 hemodynamic 협 착 증으로 인 한 허 혈 성 영역에 혈액 흐름을 증가 하는. 혈관 수술은 가능한 옵션을 선택한 경우에만 통증, 중요 한 사지 허 혈, 또는 생활에 주요 중단 휴식 또는 작업 진행 등 수술을 위한 표시 없이 환자에 대 한, 그들의 질병을 완화 하기 위해 몇 가지 가능성이 있다. 부수적인 형성의 자극을 통해 관류 monocyte 강화 통해 세포 치료 비-침략 적 몇 가지 옵션 중 하나입니다.
우리의 그룹 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 마우스에 monocyte 이식 후 arteriogenesis을 검사 합니다. 이전에 우리 hindlimb 관류 syngeneic monocyte 파상풍 자극이 식을 사용 하 여 향상을 증명 하고있다. 부수적인 형성에 효과 뿐만 아니라 종양의 성장 뿐만 아니라이 치료에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 조사, 우리 후 대 퇴 동맥의 폐색, 마우스의 측면에 Engelbreth-Holm-떼 육의 기질을 주입 하 여 지하실 막 같은 매트릭스 마우스 모델을 사용 합니다.
인공 종양 연구 후 우리를 vivo에서 종양-신생 및 부수적인 동맥 내에서 귀환 하는 monocyte intravital 현미경 검사 법을 사용. 이전 연구는 사후 아티팩트에 후속 분석을 전제로 동물 모델의 조직학 검사를 설명 했습니다. 우리의 접근 지역 실시간으로 시퀀스에서 담보의 monocyte 유도 시각화, 수행, 쉽게 arteriogenesis 및 종양 혈관 신생 비보의 과정을 조사 하 고.
Introduction
심혈 관 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 말 초 동맥 질환을 포함 하 여 죽음의 가장 일반적인 원인은 세계적으로1. 세포 치료 외과 중재를 받을 수 없는 사람들을 위해 특히 심혈 관 질환을 치료 하는 유망한 접근 이다. 치료 도구2,3는 관류를 개선 하 고 허 혈 성 및 underperfused 조직의 기능을 유지 하는 전반적인 목표와 셀 또는 그들의 secreted를 사용 하 여 여러 접근이 있다. 이 목표를 달성 하기 위해 한 시도 arteriogenesis, 부수적인 동맥의 개발을 향상을 향상 시킬 것입니다. Monocytes는 담보와 관련 한 중요 한 세포 유형입니다. 우리의 그룹 허 혈 및 후속 염증6유도 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 특히 염증4,5의 분야에서 monocytes의 효과 연구에 집중 했다. Monocytes 염증의 지역를 담보7의 개발을 이끌어 내는 복잡 한 조직 반응 일으킬 합니다.
Intravital 현미경 검사 법의 사용, 우리는 이러한 세포에 vivo에서 의 동작을 연구 하 고 염증의 지역에 주입된 monocytes의 추적 관찰 수 있습니다. 대부분의 이전 연구는만 사후 분석, 조직학 아티팩트 및 준비에 필요한 동물의 많은 수의 소개를 포함 하 여 단점을 보유 하 고 있는 설명 합니다. 우리의 접근, 우리 면역 프로세스를 조사할 수와 여러 시간 점에서 통해 부수적인 형성 라이브 이미징.
부수적인 동맥 허 혈 성 지역에서의 개발 이외 monocytes는 또한 종양의 성장 영향. 이러한 프로세스를 조사, 우리 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종, 종양 세포 외 기질 단백질8, 풍부한에서 추출한 지하실 막 같은 매트릭스를 주사 하 고 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석. 이 행렬은 내 피 세포 네트워크 형성 또는 신생 억제;을 통해 항 암 치료에 대 한 스크린 테스트 분자에 사용 이 경우에, 우리는 세포 치료9,,1011monocytes의 종양 신생 잠재력을 평가할 것입니다.
이 프로토콜의 목표는 vivo에서 모델에서 허 혈에 의해 발생 하는 면역 과정을 공부 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 보여 줍니다. 우리는 사후 근육 조직의 조직학 검사 결과에 비해 더 현실적인 테스트 환경을 생성할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
우리의 연구 동물 보호에 대 한 독일 법의 섹션 8에 따라 작센-안할트, Landesverwaltungsamt 할리 상태의 권한으로 수행 되었다. (§ 8, 18.05.2016-BGBI에서에서 동물 보호에 대 한 독일 법의 단락 1. 나 S. 1206, 1313, 13.08.2013에서 § 31 TierSchVersV).
참고: 여기 실험에 대 한 8 12 주 오래 된 남성 BALB/c 마우스 사용 되었다, 및 혈액 기증자 로부터 인간 monocytes intravital 현미경 검사 법을 통해 monocytes의 시각화를 위해 사용 되었다.
1. 셀 준비
참고: monocytes의 격리를 참조 하십시오 우리의 이전 게시 된 비디오 정돈에 지침에 대 한: " 절연 및 정 맥 주입의 Murine 골 파생 Monocytes " 바그너 외. 여 4
참고: 때 셀 모든 단계 작업 것이 오염을 피하기 위하여 살 균 되어야 합니다.
- 셀 3, 3으로 얼룩 '-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염
- Resuspend 1 x 10 6 셀/mL의 농도와 혈 청 무료 문화 매체에 셀.
참고:만 혈 청 자유로운 매체 수는 효율적인 얼룩, 닥터지 염료 이미 혈 청의 질 성 구성 요소에 의해 캡처 그렇지 않으면 것 때문. - 1 m m 3, 3의 추가 5 µ L '-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 dimethylformamide 셀 서 스 펜 션의 1 ml에 신중 하 게 resuspend와.
- 품 20 분 동안 37 ° C에서 셀 솔루션
- 37 ° C에서 5 분에 대 한 500 x g 세포를 원심
- 는 상쾌한을 꺼내 려 하 고 37 ° C 따뜻한 태아 종 아리 보충 하는 혈 청 매체와 셀 resuspend.
- 1.1.4와 1.1.5 단계를 반복 하 여 두 번.
- 수식 가진 셀의 개수:
- 150 µ L 살 균 0.9 %NaCl 용액으로 세포를 resuspend.
- 꼬리 정 맥에 주입 셀.
- Resuspend 1 x 10 6 셀/mL의 농도와 혈 청 무료 문화 매체에 셀.
2. 마 취
- 흡입 마 취
- isoflurane 화학 안전 후드 닫힌된 빈에 5%의 농도 사용 하 여 기화 기의 도움으로 증발.
- 마우스를 신중 하 게 처리 하 고 빈에 넣어.
- 이동 중지 되었습니다 후 후부 목의 피부에 의해 동물 처리.
- 복 마 취
참고: 사용 isoflurane 마 취, 단계 2.1, 복 주사를 수행 하려면 아래 설명 된. 빠른 복구와 isoflurane 마 취의 짧은 연기 마약 효과, 마우스를 처리 하 여 복 마 취 주사 쉽습니다.- 2.4 mL 마 취 제 (10%), 0.8 mL Xylazine (2%), 및 6.8 mL NaCl (0.9%)의 솔루션을 사용 하 여 복 주입을 위해.
- 무게 동물 마 취 제를 적용 하기 전에.
참고: 마 취에 대 한 공식 이다:
- 30g 바늘 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 왼쪽된 하복 부에 주입 솔루션.
- 마우스의 장에 놓고 마약 효과 기다립니다.
참고: 마약 효과 일반적으로 나타납니다 5 분 이내 주사 된 경우. 마 취의 정확한 깊이 뚜껑 반사 또는 발가락을 꼬집어, 반응 없는 호흡의 일반, 제어 속도 의해 결정 수 있습니다.
3. 지하실 막 같은 매트릭스의 주입
참고:이 메서드는 monocyte 주입 후 종양 혈관 신생 연구 우리의 그룹에 의해 사용 됩니다. 실험에 따라 성장 요인 지하실 막 같은 매트릭스를 추가할 수 있습니다. 우리는 마우스의 측면에서 종양을 주입 하기 전에 대 퇴 동맥 결 찰을 수행. 매트릭스는 주입을 위해 4 ° C의 온도가지고 있어야 합니다. 이 온도에, 행렬은 액체; 젤은 체온 (37 ° C)에 고체를 견고 하 게. 피하 매트릭스의 더 나은 시정을 위한 플러그, 사출 사이트에서 마우스의 피부를 면도.
참고: 옵션: 추가 100 ng 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 300 ng 혈관 내 피 성장 인자, 및 지하실 막 같은 매트릭스를 무 균 조건 하에서 26 I.U. 덤플링을.
- 30 G 인슐린 주사기를 얼음에 저장소 사용까지 매트릭스의 1 mL 로드.
- 동물 테이블에 누워 누르고 있으면 마우스의 피부 측면에 주사 부 옆.
- 지하실 막 같은 매트릭스의 500 µ L를 피하 주사.
주: 실제적인 이유를 위해 그것은 피하 분산을 피하기 위해 한 위치에서 조밀 하 게 지하실 막 같은 매트릭스를 삽입 하는 데 필요한. 실험의 끝에 마우스를 희생 후 조직에서 인공 종양을 꺼내 려 하는 것이 쉬울 것 이다.
4. 정 맥 주입 꼬리
참고: 꼬리 정 맥 주입 실험 하기 전에 시험 동물에 NaCl 솔루션 연습. Monocytes는 적절 하 게 꼬리 정 맥에 주입 수 없습니다, 아무 조직의 효과 담보에 있을 것입니다. 이 프로토콜에서 2.5 백만 monocytes 주입 하 고. Bodyweight의 더 이상 5 µ L/g를 주사 하려고.
- 준비 단계 1.1.8 2.5 백만 monocytes를 포함 하는 monocyte 솔루션을 사용 하 여.
- 30g 바늘과 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 주입을 위해.
- 신중 하 게 마우스를 처리, restrainer에서 동물을 제 지 하 고 마우스 감염 되지 및 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있는지 확인 하십시오.
- 꼬리 접시에 게 연락할 수 있도록 난방 패드는 restrainer 넣어.
- 꼬리 정 맥, 꼬리의 측면에 있는 식별.
- 90 °, 꼬리 꼬리 정 맥 꼬리의 위 부분에 나타나도록 설정.
- 주입 사이드는 monocytes를 주입 하기 전에 소독.
- 세를 직면 하는 바늘의 경사와 평면 각도에 monocyte 솔루션을 주입 하려고
참고: 중지 주사 물집이 나타나면 이것이 실패 한 주입의 징조. 절차를 다시 시도 더 proximally. - 주사 사이트에서 약 60에 대 한 꼬리에 부드러운 압력을 적용 하 여 출혈을 멈추게.
- 을 조직의 부작용에 대 한 모니터링 마우스 그것의 감 금에 있는 동물에는 완 치 후 30 분 동안 동물 관찰.
5. Intravital 현미경
- 준비
- 접착 테이프를 가진 일정 한 온도 유지 하 고 자리에는 발을 해결을 열 패드 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.
- 다리 또는 현미경에 사용 되는 측면의 사이트에서 피부를 소독.
- 머리 간섭을 유발 하지 않도록 더 나은 처리에 대 한 관심의 영역을 면도.
- 삭제할 살 균 메스와 0.5 x 0.5 cm의 사각형 영역에 미세 집게 피부.
참고: 그것은 촉촉한; 관심 영역을 유지 하는 것이 중요 그렇지 않으면, 이미지와 조직의 품질 손상 될 것 이다. NaCl 솔루션 영역을 축 축 하 게 사용할 수 있습니다. - 두 조정 가능한 우표 사이 다리를 놓고 우표 위에 커버 글라스를 위치.
- 조직과 젖어 유리 접촉 확인.
- Inj혈관의 더 나은 시정을 위한 정 맥 체계로 요법 50 µ L rhodamine dextran retrobulbar.
- 현미경 검사 법을 시작 하 고 필요한 경우 다리의 위치를 조정.
- Intravital 현미경 설정
- 현미경, 컴퓨터, 전자 인터페이스와 레이저.
- 보육 실의 난방 단위 설정 또는 난방 (플레이트/패드), 무대 설정 온도 37 ° c.
- 수집 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 공명 스캐너를 갖춘 경우이 빠른 스캐닝 모드 선택.
- 온도가 일정 수준 (35-37 ° C) 도달할 때까지 기다렸다가
참고: 안정 온도 대 한 중요 하다: (a) 마우스, 마 취의 밑에 그것의 온도, 및 (b) 피하 또는 적어도 최소화 초점 드리프트를 제어할 수 없습니다. 이 주변 조건 (예를 들어, 에어컨 시스템 및 사람들을 포함 한 방에 열원 수)에 따라 몇 시간 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 침수 목적 사용 하는 경우 렌즈와 커버 유리 (또는 조직) 사이의 접촉 영역 불안정의 전형적인 소스입니다. 렌즈는 객관적인 히터 난방 도움이 될 수 있습니다; 또는, 자동 초점 시스템 현미경 좋습니다. - 실험의 확인 요구 사항을 충족 높은 숫자 조리개와 확대 렌즈 선택 (이 섹션의 끝에 참고).
- 이득, 채널 설정, 검사 속도, 픽셀 해상도, 깊이 볼륨, 스텝 크기 및 단계에 실험 동물을 배치 하기 전에 평균 현미경 설정을 최적화.
- 수집 시간을 줄이기 위해 양방향으로 스캔.
- 현미경에는 안정적인 상태에 도달 했습니다 및 설정을 dummy의 도움으로 테스트 후 마 취 마우스 prewarmed 현미경 스테이지에 배치.
- 관심 영역 지하실 막 같은 매트릭스 내의 초점으로 밝은 빛 조명 사용 하 여 가져오고 간단히 적용된 fluorophores에 대 한 적절 한 필터 설정으로 자외선에 의해 모 세관 검사.
- 스캐닝 모드; 전환 낮은 해상도 256 x 256 모드에서 검색을 시작 하 고 이득을 강화 하 고 레이저 출력 신호 모니터에 관찰 때까지.
- 관심의 구조에 초점입니다. 모든 세부 사항을 볼 수 있습니다 때까지 확대.
- 정의 " 시작 " 및 " 끝 " 축 방향에 위치.
- 검색 중지.
- 스테핑 크기 (예를 들어, 0.5 µ m) 및 초점 비행기 (예를 들어, 10-20)의 수 정의.
- 스위치 이동 subcellular 구조 또는 셀 선택 검사의 속도 따라 최종 픽셀 해상도 (512 x 512 또는 1024 x 1024) 속도 (스캔 주파수) 움직임에 가장 맞는. 스택의 인수를 고정 권장 양방향 검색.
참고: 충분 한 이미지 품질을 제공 하는 검색의 높은 스캔 속도 선택 합니다. 전형적인 포인트 스캐너 400 Hz 및 1.4 kHz 사이 속도 제공합니다. 공 진 스캐너 추가 8 kHz 또는 12 kHz를 제공합니다. Y-방향으로 줄 수를 줄이면, 스캔 속도 증가 될 수 있다 추가 (일반적인 값은 512 x 512, 512 x 256 또는 512 x 200 픽셀 해상도). 신호 대 잡음 비율에 따라 하나 2와 4 사이 평균 라인을 추가 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 시도할 수 있습니다. 일반적으로, 8 KHz 공명 스캐너; 양방향 모드에서 18 ms의 인수 시간/프레임에 결과 없이 평균 512 x 200의 설정 512 x 200과 x 평균 4 프레임 당 56 ms 아래로 느려집니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital 현미경 종양 성장과 부수적인 선박 monocytes에 의해 실행의 시험에 대 한 종양 혈관 신생 및 arteriogenesis의 분자 메커니즘에 새로운 측면을 보여줄 수 있습니다. 셀 준비 되어야 하 고 신중 하 게 프로토콜의 단계를 사용 하 여 주입. 차이 단일 실험 사이 변이 발생할 수 있습니다. 정 맥 시스템 (그림 1) 조직의 효과 유지 하 고 주입 동맥 시스템에서 실시 하는 경우 발생할 수 있는 혈을 방지 하는 monocytes는 주입 해야 합니다.
지하실 막 같은 매트릭스를 사용 하는 경우 분산을 피하기 위해 천천히 주입 플러그 explantation 추가 조직학 검사에 대 한 도움이 될 것입니다 (그림 2, 그림 3). 마우스를 희생, 후 지하실 막 같은 매트릭스 플러그는 마우스의 측면에서 explanted 것입니다. 지하실 막 같은 매트릭스 플러그 내 우리 다른 실험 설정 (그림 4, 그림 5) 내 모세 혈관을 계산 하 여 vascularization를 측정할 수 있습니다.
성공적인 실험에 대 한 또 다른 상태는 소프트웨어, 하드웨어, 그리고 동물 준비 (그림 6)에 따라 현미경 설정입니다. 경우 subcellular 구조 (< 2 µ m) 확인 될 필요가, 2 광자 여기와 물 침수 목표 (20 X 또는 25 X, 숫자 조리개 1.0) 긴 작동 거리와 수직 현미경 (> 2 m m)는 것이 좋습니다. 높은 숫자 조리개와 물 침수 목표 굴절률 변화에 매우 민감한 때문에, 목표에서 수정 목걸이 이동 하 여 최적의 이미지 해상도 밝기를 조정 해야 합니다. 불행 하 게도, 손으로 조정 제한 된 공간이 꽤 어렵습니다. 따라서, 자동화 된 칼라 보정으로 비싼 목표 현미경 제조 업체에 의해 제공 됩니다.
충분 한 세포 해상도 (5-10 µ m) 이면 10 배 건조 0.4 이상 숫자 조리개와 렌즈 및 긴 작동 거리 (> 2 m m) 것이 좋습니다. 이 경우에 직 립 또는 거꾸로 한 현미경 스탠드를 선택할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 건조 렌즈 (숫자 조리개 0.4) X 10 높은 확대/축소 요인에서 (> 3) 이므로 훨씬 쉽고 저렴 클래식 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (즉, 1 광자 여기)와 충분 한 이미지 스택을를 사용할 수 있습니다 해상도입니다. 많은 시간에 필요한 경우 이미지의 수집, 선박 내 rhodamine dextran의 양을 줄인다. 혈관의 더 나은 시정는 fluorophore의 주입 해야 합니다 (그림 7) 반복.
다른 조정 샘플 가능한 최상의 이미지 품질을 결정 하 고 가장 효과적입니다. 셀 또는 (이식) 없이 지하실 막 같은 매트릭스에 대 한 긍정적인 프로브를 사용 하 여 최적의 설정을 가져올 수 있습니다. 우리는 (그림 8, 그림 9) 혈액 흐름 및 근육 조직 내 intravital microcopy 통해 레이블이 monocytes를 검출할 수 있었다. 조직 단면도의 조직학 검사 결과를 (그림 10)을 확인합니다.
그림 1 : 2.5 백만 monocytes의 꼬리 정 맥으로 주입. 정 맥 동맥 등 쪽과 복 부 쪽으로 꼬리의 측면에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 지하실 막 같은 매트릭스의 주입. 마우스의 피부를 처리 하 고 측면에 지하실 막 같은 매트릭스를 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 마우스의 측면에서 explanted 매트릭스 플러그 (참조 포인트 3.5). 법인된 선박 꼬리 정 맥을 통해 monocyte 이식 후 5 일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Vascularization 지하실 막 같은 매트릭스 내에서 비교 ( 
+ SD, n = 각 그룹에 3). 지하실 막 같은 매트릭스 플러그, 아니 성장 인자 추가 (빨간 막대)와 성장 인자 추가 지하실 막 같은 매트릭스 플러그의 혈관에 비해 내 선박. 성장 인자와 지하실 막 같은 매트릭스의 완보 증가 배 성장을 이끌어 낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 지하실 막 같은 매트릭스 플러그 내 혈관. 혈액의 흐름 혈관 (화살표) 및 monocyte 지하실 막 같은 매트릭스 플러그 내 (녹색) 귀환 (빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 마우스 이미지 수집에 대 한 준비. 발 접착 테이프로 고정 되 고 커버 유리는 2 개의 조정 가능한 우표 상단 배치. 관심 영역 메스와 excised 했다. NaCl은 이미지와 조직의 품질 훼손 되지 않을 것 이다 그래서 영역을 축 축 하 게 하는 데 사용 됩니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 선박의 시정 감소. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 monocytes (화살표) 그릇 옆 지하실 막 같은 매트릭스 내에서 스테인드 (경도 섹션, *). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : Monocyte 혈관으로 플러시. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염의 시각화 vivo에서 얼룩이 고 부수적인 동맥 (*) 내 monocyte (녹색 화살표)를 이식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : Intravital 현미경 검사 법. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 스테인드 monocytes (화살표) 일반적인 코르크 마 개 뽑 형성 (*)와 부수적인 선박 이내 rhodamine dextran 스테인드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10 : Immunohistological 허벅지 근육의 얼룩. 선박 (빨간색: 평활 근 알파 걸, *), 대 식 세포 (녹색: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염, 화살표), 세포 핵 (파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기 설명 하는 방법을 부수적인 동맥의 개발이이 선박에 monocytes의 동작 및 arteriogenesis의 과정에 빛이 나. 이 프로토콜을 적용 하기 위한 단계는 쉽게 학습과 과학의 다른 분야에서 사용 될 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 현미경 장비 설명된 기법을 실행 해야 합니다. 한 실험에 대 한 장비를 얻는 하는 것은 장치를 공유 하는 다른 기관과 협력 하는 것이 중요 하다 그래서 지속 가능한, 하지입니다.
다른 어려움 연습 피할 수 있는이 프로토콜 연결을 확인 하 고 있습니다. 처음에는, 현미경, 마우스 위치에 대 한 문제가 있을 수 있습니다 그리고 이미지 품질은 이러한 상황에서 고통을 수 있습니다. 또 다른 중요 한 점은 꼬리 정 맥 주입입니다. Monocytes 제대로 주입 하는 경우는 혈관에 볼 수만 있습니다. 따라서, 그것은 마우스를 위치 하기 전에 주사를 실행 하는 것이 좋습니다.
Monocyte 절연은 또한 중요 합니다. Monocytes는 종종 다양 한 결과 셀 수익률12,,1314이어질 여러 프로토콜을 사용 하 여 다른 종 으로부터 격리 될 수 있습니다. 그것은 오염을 피하기 위하여 메 마른 조건에서 작동 해야 합니다. 세포 손상 pipetting 신중 하 게 하 고 일정 온도 유지 하 여 방지 되어야 한다.
이러한 단점에도 불구 하 고이 방법은 실용적이 고, 실행 하기 쉬운 종양 신생 및 주변 동맥 질병의 뒤에 기본 메커니즘에 빛을 발산 하는 사용자입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 ELSE Kröner 재단에 의해 지원 되었다 그리고 DFG (도이치 가운데, 독일 연구 재단) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터). 특별 기술 지원에 대 한 한스-홀거 Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, 오토 폰 Guericke 대학 마그데부르크, 마그데부르크, 독일, 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
