Intravital mikroskopi Monocyte Homing og svulst-relaterte angiogenese i en Murine modell av perifere Arterial sykdom
Summary
Monocytter er viktig meglere på arteriogenesis i sammenheng med perifere arterial sykdom. Bruker en kjeller membran som matrise og intravital mikroskopi, undersøker denne protokollen monocytt homing og svulst-relaterte angiogenese etter monocytt injeksjon i femoral arterien ligation murine modellen.
Abstract
Den terapeutiske mål for perifere arterial sykdom og iskemisk hjertesykdom er å øke blodstrømmen til iskemiske områder skyldes hemodynamic stenose. Vaskulær kirurgi er et levedyktig alternativ i Utvalgte tilfeller, men for pasienter uten indikasjoner for kirurgi som progresjon å hvile smerte, kritisk lem iskemi eller store forstyrrelser livet eller arbeide er det få muligheter for begrensende sin sykdom. Cellen terapi via monocytt forbedret perfusjon gjennom stimulering av sivile formasjon er en av få ikke-invasiv.
Vår gruppe undersøker arteriogenesis etter monocytt transplantasjon i mus ved hjelp av hindlimb iskemi modellen. Tidligere har vi vist bedring i hindlimb perfusjon bruker stivkrampe-stimulert syngeneic monocytt transplantasjon. I tillegg til effekten på sivile dannelsen, kan tumorveksten bli påvirket av denne behandlingen. Undersøke effektene, bruker vi en kjeller membran som matrise musemodell ved å injisere den ekstracellulære matrisen av Engelbreth-Holm-sverm sarkomspesialitet inn flanken av musen, etter okklusjon av arterien femoral.
Etter kunstig svulst studiene, bruker vi intravital mikroskopi i vivo svulst-angiogenese og monocytt homing innen sikkerheter arterier. Tidligere studier har beskrevet histologiske undersøkelse av dyr modeller, som forutsetter påfølgende analyse obduksjon artefakter. Vår tilnærming visualiserer monocytt homing til områder av collateralization i sanntid sekvenser, er enkel å utføre, og undersøker prosessen med arteriogenesis og tumor angiogenese i vivo.
Introduction
Kardiovaskulære sykdommer, inkludert koronar hjertesykdom eller perifere arterial sykdom, er de vanligste årsakene til dødsfall globalt1. Cellen terapi er en lovende tilnærming til å behandle kardiovaskulær sykdom, spesielt for personer som ikke kan gjennomgå kirurgiske inngrep. Det er flere måter å bruke celler eller deres secreted stoffer som en terapeutisk redskap2,3, med det overordnede målet å forbedre perfusjonen og opprettholde funksjon av iskemiske og underperfused vev. Ett forsøk på å oppnå dette målet er å forbedre arteriogenesis, som forbedrer utviklingen av sikkerheter arterier. Monocytter er en viktig celle type assosiert med collateralization. Vår gruppe har fokusert på å undersøke effektene av monocytter i områder med betennelse4,5, spesielt med hindlimb iskemi modellen for å indusere iskemi og påfølgende betennelse6. Monocytter hjem til områder med betennelse og forårsake komplekse systemisk svar som fører til utvikling av collateralization7.
Med bruk av intravital mikroskopi, kan vi studere atferden til disse cellene i vivo og observere homing av injisert monocytter i områder med betennelse. De fleste tidligere studier bare beskrive post mortem analyser, som holder ulemper, inkludert en innføring av histologiske gjenstander og stort antall dyr kreves for forberedelser. Med vår tilnærming, vi kan undersøke immunologiske prosesser og sivile formasjon via live bildebehandling på flere tidspunkt.
I tillegg til utvikling av sikkerheter arterier i iskemiske områder påvirke monocytter også tumor vekst. For å undersøke disse prosessene, vi injisere en kjeller membran som matrise utvunnet fra Engelbreth-Holm-sverm musen sarkomspesialitet, en svulst rik på ekstracellulær matrix proteiner8, og analysere ved hjelp av intravital mikroskopi. Denne matrisen brukes til prøvefilme molekyler for endothelial celle nettverk formasjon eller anti-kreft terapi gjennom angiogenic hemming; i dette tilfellet vil vi vurdere svulst angiogenic potensialet av monocytter for cellen terapi9,10,11.
Målet med denne protokollen er å demonstrere en lett og effektiv måte å studere immunologiske prosesser skyldes iskemi i en i vivo -modell. Vi kan generere et mer realistisk testmiljø sammenlignet histologiske workup av post mortem muskelvev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her kaster lys over utviklingen av sikkerheter arterier, virkemåten av monocytter i disse fartøyene, og prosessen med arteriogenesis. Trinnene for å bruke denne protokollen er lett å lære og kan brukes i andre felt av vitenskap. Til tross for disse fordelene er det noen ulemper. For eksempel er mikroskopiske utstyr nødvendig å utføre beskrevet teknikker. Å skaffe utstyr for et eksperiment er uholdbar, så det er viktig å samarbeide med andre institusjoner å dele enhetene.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av ellers-Kröner-Stiftung og DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, tysk Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, forskningssamarbeid center). Spesiell takk til Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto von Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Tyskland, kundestøtte.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
