Summary

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Published: August 26, 2017
doi:

Summary

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Abstract

O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.

Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.

Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.

Introduction

Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente1. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta o desenvolvimento das artérias colaterais. Os monócitos são um tipo de célula importante associado com collateralization. Nosso grupo centrou-se em Pesquisar os efeitos de monócitos em áreas de inflamação4,5, em particular, usando o modelo de isquemia do membro posterior para induzir isquemia e inflamação subsequentes6. Os monócitos lar de áreas de inflamação e causam respostas sistêmicas complexas que levam ao desenvolvimento de collateralization7.

Com o uso da microscopia intravital, podemos estudar o comportamento dessas células na vivo e observar a orientação de monócitos injetados para as áreas de inflamação. A maioria dos estudos anteriores descrevem apenas post-mortem de análises, que possuem desvantagens, incluindo uma introdução de artefatos histológicos e um grande número de animais necessários para preparações. Com nossa abordagem, podemos investigar processos imunológicos e formação colateral através de viver de imagem em múltiplos pontos de tempo.

Além do desenvolvimento das artérias colaterais em áreas isquêmicas, monócitos também influenciam o crescimento do tumor. Para investigar estes processos, injetamos uma matriz de membrana basal, como extraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame, um tumor rico em proteínas de matriz extracelular8e analisar usando microscopia intravital. Esta matriz é usada para teste de tela moléculas para formação de rede de células endoteliais ou terapias contra o cancro através da inibição angiogênico; Neste caso, vamos avaliar o potencial angiogênico de tumor de monócitos para celular terapia9,10,11.

O objectivo do presente protocolo é demonstrar uma maneira fácil e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo . Podemos gerar um ambiente de teste mais realista em relação ao exame histológico do post-mortem o tecido muscular.

Protocol

nosso estudo foi realizado com a permissão do estado de Saxônia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, de acordo com a seção 8 da lei alemã de proteção animal. (§ 8, n. º 1 da lei alemã de proteção animal de 18.05.2016 – BGBI. Eu s. 1206, 1313, § 31 de TierSchVersV de 13.08.2013). Nota: para os experimentos aqui, 8 a 12 camundongos BALB/c machos de semana foram utilizados, e monócitos humanos de doadores de sangue foram utilizados para a visualização de monócitos atrav?…

Representative Results

A microscopia intravital para o exame do tumor e o crescimento de vasos colaterais desencadeada por monócitos pode ajudar a revelar novos aspectos nos mecanismos moleculares de vasculogênese e arteriogenesis. As células devem ser preparadas e injetado cuidadosamente usando as etapas do protocolo. Diferenças podem levar a variações entre experiências simples. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso (Figura 1) para manter efeitos sistêmicos …

Discussion

O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela ELSE-Kröner-Stiftung e a DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação de pesquisa alemã) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). Agradecimento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidade Otto-von-Guericke Magdeburg, Alemanha, para suporte técnico.

Materials

10% fetal calf serum (FCS) Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe  Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice  Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany 29G, 30G
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium Manufactured by our group with single components Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream Veet, Mannheim, Germany
DiO Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10  Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan 
EDTA Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70% Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA Katalognummer: D-1819
Gloves Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad  Labotect GmbH, Göttingen, Germany  Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor Sigma Aldrich, Hamburg, Germany SRP3110 
Humane leucocyte filters Blood preservation
Incubator Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%) Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)  Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope  Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077 GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel  Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199  PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany Hera safe
Microscope slide Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit  Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer Manufactured by our group with single components PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer Various
Multi-photon microscope  Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%) Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber  Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective Leica, Wetzlar, Deutschland  Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll Manufactured by our group with single components 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes Eppendorf AG, Hamburg, Germany 10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany  Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit Integra bioscience, Fernwald, Germany Vacusafe comfort
Surgical scissors Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 % Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %) Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany

References

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Wagner, M., Baer, C., Zuschratter, W., Riek-Burchardt, M., Deffge, C., Weinert, S., Lee, J. C., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease. J. Vis. Exp. (126), e56290, doi:10.3791/56290 (2017).

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