Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.
O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.
Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.
Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.
Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente1. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta o desenvolvimento das artérias colaterais. Os monócitos são um tipo de célula importante associado com collateralization. Nosso grupo centrou-se em Pesquisar os efeitos de monócitos em áreas de inflamação4,5, em particular, usando o modelo de isquemia do membro posterior para induzir isquemia e inflamação subsequentes6. Os monócitos lar de áreas de inflamação e causam respostas sistêmicas complexas que levam ao desenvolvimento de collateralization7.
Com o uso da microscopia intravital, podemos estudar o comportamento dessas células na vivo e observar a orientação de monócitos injetados para as áreas de inflamação. A maioria dos estudos anteriores descrevem apenas post-mortem de análises, que possuem desvantagens, incluindo uma introdução de artefatos histológicos e um grande número de animais necessários para preparações. Com nossa abordagem, podemos investigar processos imunológicos e formação colateral através de viver de imagem em múltiplos pontos de tempo.
Além do desenvolvimento das artérias colaterais em áreas isquêmicas, monócitos também influenciam o crescimento do tumor. Para investigar estes processos, injetamos uma matriz de membrana basal, como extraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame, um tumor rico em proteínas de matriz extracelular8e analisar usando microscopia intravital. Esta matriz é usada para teste de tela moléculas para formação de rede de células endoteliais ou terapias contra o cancro através da inibição angiogênico; Neste caso, vamos avaliar o potencial angiogênico de tumor de monócitos para celular terapia9,10,11.
O objectivo do presente protocolo é demonstrar uma maneira fácil e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo . Podemos gerar um ambiente de teste mais realista em relação ao exame histológico do post-mortem o tecido muscular.
O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar co…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela ELSE-Kröner-Stiftung e a DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fundação de pesquisa alemã) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro de pesquisa colaborativa). Agradecimento especial a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Universidade Otto-von-Guericke Magdeburg, Alemanha, para suporte técnico.
10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
Mouse restrainer | Various | ||
Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |