Summary
Monocyter är viktiga mediatorer av arteriogenesis i samband med perifer arteriell sjukdom. Detta protokoll använder en basalmembranet-liknande matris och intravital mikroskopi, och undersöker monocyt homing och tumör-relaterade angiogenes efter monocyt injektion i lårbensartären ligering murina modellen.
Abstract
Det terapeutiska målet för perifer arteriell sjukdom och ischemisk hjärtsjukdom är att öka blodflödet till ischemiska områden orsakas av hemodynamiska stenos. Kärlkirurgi är ett gångbart alternativ i utvalda fall, men för patienter utan indikationer för kirurgi såsom progression att vila smärta, kritiska lem ischemi eller stora störningar liv eller arbete, finns det några möjligheter för att mildra deras sjukdom. Cellterapi via monocyt-förbättrad genomblödning genom stimulering av säkerheter bildandet är en av några icke-invasiva alternativ.
Vår grupp undersöker arteriogenesis efter monocyt transplantation i möss med bakbenet ischemi modell. Tidigare har vi visat förbättring i bakbenet perfusion med stelkramp-stimulerad syngena monocyt transplantation. Förutom effekterna på säkerheter bildandet, kan tumörtillväxt påverkas av denna terapi också. För att undersöka dessa effekter, använder vi en basalmembranet-liknande matris musmodell genom att injicera den extracellular matrisen av den Engelbreth-Holm-Swarm sarkom i flanken av musen, efter ocklusion av femoralartären.
Efter de konstgjorda tumör studierna, vi använder intravital mikroskopi för att studera i vivo tumör-angiogenes och monocyt homing inom säkerheter artärer. Tidigare studier har beskrivit en Histologisk undersökning av djurmodeller, vilket förutsätter efterföljande analys till obduktion artefakter. Vår strategi visualiserar monocyt homing rättsområden collateralization i realtid sekvenser, är lätt att utföra, och undersöker processen för arteriogenesis och tumör angiogenes i vivo.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdomar, inklusive kranskärlssjukdom eller perifer arteriell sjukdom, är de vanligaste orsakerna till dödsfall globalt1. Cellterapi är en lovande metod att behandla hjärt-kärlsjukdom, särskilt för människor som inte kan genomgå kirurgiska ingrepp. I området i närheten finns det flera metoder att använda celler eller deras utsöndras ämnen som ett terapeutiskt verktyg2,3, med det övergripande målet att förbättra perfusionen och upprätthålla funktion av ischemisk och underperfused vävnad. Ett försök att uppnå detta mål är att förbättra arteriogenesis, vilket stärker utvecklingen av säkerheter artärer. Monocyter är en viktig celltyp som är associerad med collateralization. Vår grupp har fokuserat på forska effekterna av monocyter i områden av inflammation4,5, i synnerhet med bakbenet ischemi modell för att inducera ischemi och efterföljande inflammation6. Monocyter hem till områdena av inflammation och orsaka komplexa systemiska reaktioner som leder till utveckling av collateralization7.
Med användning av intravital mikroskopi, kan vi studera beteendet hos dessa celler i vivo och observera homing av injicerade monocyter till områdena av inflammation. De flesta tidigare studier bara beskriva obduktion analyser, som hålla nackdelar inklusive en introduktion av histologiska artefakter och ett stort antal djur som krävs för preparat. Med vårt arbetssätt kan vi undersöka immunologiska processer och säkerheter bildning via live imaging vid flera tidpunkter.
Förutom utvecklingen av säkerheter artärer i ischemiska områden påverka monocyter också tumörens tillväxt. För att undersöka dessa processer, vi injicerar en basalmembranet-liknande matris utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom, en tumör som är rik på extracellulära matrix proteiner8, och analysera hjälp intravital mikroskopi. Denna matris används till provspelning molekyler för antingen endotelceller nätverk bildandet eller mot cancer terapier genom angiogena hämning; i detta fall kommer vi att bedöma tumör angiogena potential av monocyter för cell terapi9,10,11.
Syftet med detta protokoll är att demonstrera ett enkelt och effektivt sätt att studera immunologiska processer orsakas av ischemi i en in-vivo -modell. Vi kan skapa en mer realistisk testmiljö jämfört med histologiska workup av besiktning muskelvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
vår studie utfördes med tillåtelse av delstaten Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, enligt 8 § i den tyska lagen för djurskydd. (§ 8, punkt 1 i den tyska lagen för djurt skydd från 18.05.2016 - BGBI. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV från 13.08.2013).
Obs: 8 till 12 vecka gammal BALB/c hanmöss användes för de här experimenten, och humana monocyter från blodgivare användes för visualisering av monocyter via intravital mikroskopi.
1. cell förberedelse
Obs: för isolering av monocyter, vänligen se vår tidigare publicerade video på JoVE anvisningar: " isolering och intravenös injektion av murina benmärgen härledas Monocyter " av Wagner et al. 4
Obs: när du arbetar med celler alla åtgärder måste vara sterila att undvika kontaminering.
- Cell färgning med 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat
- Omsuspendera cellerna i serum gratis kultur medium med en densitet på 1 x 10 6 celler/mL.
Obs: Endast serum gratis medium möjliggör en effektiv färgning, eftersom lipofila färgämnet skulle annars redan fångas av lipofila komponenter av serumet. - Tillsätt 5 µL av 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat i dimetylformamid 1 ml cellsuspension och resuspendera noggrant.
- Inkubera i cell lösning vid 37 ° C i 20 min.
- Centrifugera cellerna vid 37 ° C och 500 x g för 5 min.
- Få bort supernatanten och återsuspendera cellerna med 37 ° C varma fostrets kalv serum kompletteras medium.
- Upprepa stegen 1.1.4 och 1.1.5 två gånger.
- Räkna cellerna med formeln:
- Omsuspendera cellerna med 150 µL steril 0,9% NaCl lösning.
- Injicera cellerna i svansen ven.
- Omsuspendera cellerna i serum gratis kultur medium med en densitet på 1 x 10 6 celler/mL.
2. Anestesi
- Inandning anestesi
- förånga isofluran med hjälp av en spridare med en koncentration av 5% i en sluten bin under huv kemikaliesäkerhet.
- Hantera musen försiktigt och Lägg den i papperskorgen.
- Hantera djuret genom huden på bakre halsen efter det har slutat flytta.
- Intraperitoneal anestesi
Obs: Använd isofluran anestesi, beskrivs under steg 2.1, att utföra en intraperitoneal injektion. Med snabb återhämtning och kortverkande narkotiska effekten av den isofluran anestesi är det lättare att hantera musen och injicera intraperitoneal anestesi.- Använda en lösning av 2,4 mL ketamin (10%), 0,8 mL xylazin (2%) och 6,8 mL NaCl (0,9%) för intraperitoneal injektion.
- Väger djuret innan du applicerar bedövningsmedel.
Anmärkning: Formeln för bedövningsmedlet är:
- Använd en 1 mL spruta av insulin med en 30 G nål för att injicera lösningen i vänster bukens.
- Placera musen i sin bur och vänta för narkotiska effekt.
Obs: Den narkotiska effekten visas normalt inom 5 min om injektionen var framgångsrik. Rätta djupet av anestesi kan bestämmas genom avsaknad av antingen locket reflex eller reaktion på tå nypa, samt en regelbunden, kontrollerade andelen andning.
3. Implantation av basalmembranet-like Matrix
Obs: denna metod används av vår grupp för att studera tumör angiogenes efter monocyt injektion. Beroende på experiment, kan tillväxtfaktorer läggas till basalmembranet-liknande matrisen. Vi genomförde lårbensartären ligering innan du injicerar tumören i flanket av musen. Matrisen måste ha en temperatur på 4 ° C för injektion. Vid denna temperatur är matrix vätska; gelen stelnar till en solid vid kroppstemperatur (37 ° C). För bättre synlighet av subkutan matris plugg, raka huden på musen vid injektionsstället.
Obs: valfritt: Tillsätt 100 ng basic fibroblast tillväxtfaktor, 300 ng vaskulär endotelial tillväxtfaktor och 26 IE heparin under sterila förhållanden i basalmembranet-liknande matrisen.
- Ladda 1 mL matris i en 30 G insulinspruta och lagra på is fram till användning.
- Lägga djuret på bordet och hålla huden på musen bredvid injektionsstället på flanken.
- Injicera 500 µL av basalmembranet-liknande matris subkutant.
Obs: Av praktiska skäl, det är nödvändigt att injicera matrisen basalmembranet-liknande kompakt på ett ställe att undvika subkutana spridning. Det blir lättare att få bort konstgjorda tumören från vävnaden efter att offra musen i slutet av experimentet.
4. Svans ven injektion
Obs: öva svans ven injektion med NaCl-lösning på försöksdjur innan experiment. Om monocyter inte kan tillräckligt injiceras i svansen anda, blir det ingen systemisk effekt på collateralization. I detta protokoll injiceras vi 2,5 miljoner monocyter. Prova att injicera mer än 5 µL/g kroppsvikt.
- Använda den monocyt-lösning som beretts under steg 1.1.8 innehållande 2,5 miljoner monocyter.
- Använda en 30 G nål och en 1 mL spruta av insulin för injektionen.
- Noggrant hantera musen, hålla djuret i fasthållning och kontrollera musen inte skadas och har tillräckligt med utrymme för att andas.
- Sätta fasthållning på värmedyna så att svansen kan kontakta plattan.
- Identifiera svans venerna, som ligger på den laterala sidan av svansen.
- Aktivera svansen 90 °, så att svansen venen visas på ovansidan av svansen.
- Desinficera injektionsstället sidan innan du injicerar monocyter.
- Försöker injicera monocyt lösningen i en platta vinkel med nedåtlutande kanylen pekandes upp
Obs: Stoppa injektionen om en blåsa visas, eftersom detta är ett tecken på en misslyckad injektion. Nytt försök förfarandet mer proximalt. - Stoppa blödning vid injektionsstället genom att tillämpa mild tryck på svansen för ca 60s.
- Observera djuret för 30 min att övervaka för systemiska biverkningar och Placera musen i sin bur efter djuret har återhämtat sig helt.
5. Intravital mikroskopi
- beredning
- Placera den sövda musen på den värmedyna (37 ° C) att hålla en konstant temperatur och fixa tassarna på plats med tejp.
- Desinficera huden på platsen för benet eller flanken som används för mikroskopi.
- Raka regionen av intresse för bättre hantering och att undvika störningar med hår.
- Punktskatter huden med en steril skalpell och fin pincett i en kvadrat område av 0,5 x 0,5 cm.
Obs: Det är viktigt att hålla regionen av intresse fuktig; annars kommer att äventyras kvaliteten på bilder och vävnad. NaCl-lösning kan användas för att fukta området. - Placera benet mellan två justerbara frimärken och placera ett lock glas ovanpå stämplarna.
- Säkerställa vävnaden är våt och är i kontakt med glaset.
- InjECT 50 µL rodamin dextran retrobulbär i det venösa systemet för bättre synlighet av fartygen.
- Starta mikroskopi och justera positionen på benet om det behövs.
- Intravital mikroskopi inställningar
- slå på mikroskopet, datorn, elektroniska gränssnitt och lasrar.
- Aktivera värme enheten för inkubation kammare eller uppvärmning stage (plattan/pad) och Ställ in temperaturen till 37 ° C.
- Starta programvaran förvärvet. Om mikroskopet är utrustad med en resonant scanner, Välj detta snabb sökningsläge.
- Vänta tills temperaturen når en konstant nivå (35-37 ° C)
Obs: En stabil temperatur är viktigt för: (a) mus, vilken under narkos inte kan kontrollera sin kroppstemperatur, och (b) att undvika eller åtminstone minimera fokal drift. 1 h kan ta flera timmar, beroende på de omgivande villkor (t.ex., luftkonditioneringssystem och antalet värmekällor i rummet, inklusive människor). Om nedsänkning mål används är zonen kontakt mellan linsen och skyddsglaset (eller vävnad) en typisk källa till instabilitet. Värme linsen med en objektiva värmare kan hjälpa; Alternativt ett Mikroskop med ett autofokussystem rekommenderas. - Välj en förstoring lins med en hög siffra bländare som uppfyller kraven på om experimentet (se not i slutet av detta avsnitt).
- Optimera Mikroskop inställningar med avseende på vinst, kanalinställningar, scan hastighet, pixel beslutsamhet, djup volym, stegstorlek och genomsnitt innan du placerar det experimentella djuren på scenen.
- Skanna dubbelriktat att minska förvärv tid.
- Placerar sövda musen på förvärmd Mikroskop scenen efter mikroskopet har nått stabila förhållanden och inställningarna har testats med hjälp av en dummy.
- Sätta regionen av intresse inom matrisen basalmembranet-liknande i fokus med hjälp av ljusa ljus belysning och inspektera kort kapillärerna av ultraviolett ljus med adekvat filterinställningar för den tillämpade fluorophores.
- Växla till sökningsläge; Starta skanning på läget låg upplösning 256 x 256 och förbättra vinst och laser power tills en signal observeras på bildskärmen.
- Fokus på strukturera av intresse. Zooma in tills alla detaljer syns.
- Definiera " börja " och " slutet " positioner i den axiella riktningen.
- Stoppa skanning.
- Definiera stegmotor storlek (t.ex., 0,5 µm) och antalet fokal flygplan (t.ex., 10-20).
- Switch till slutliga PIXELupplösning (512 x 512 eller 1 024 x 1 024) beroende på hastigheten på den rörliga subcellulära strukturer eller celler och välj scan hastighet (skanningsfrekvens) som passar bäst till rörelser. Dubbelriktad skanning rekommenderas att fästa förvärvet av stackar.
Obs: Välj den högsta avsökningshastighet av skanning som ger tillräcklig bildkvalitet. Typisk punkt skannrar ger hastigheter mellan 400 Hz och 1.4 kHz. Resonant skannrar ger en ytterligare 8 eller 12 kHz. Genom att minska antalet rader i y-riktningen, samplingshastighet kan ökas ytterligare (typiska värden är 512 x 512, 512 x 256 eller 512 x 200 pixel beslutsamhet). Beroende på signal-brus-förhållandet, kan man försöka förbättra bildkvaliteten genom att lägga till raden i genomsnitt mellan 2 och 4. Typiskt, 512 x 200 med ingen genomsnitt inställningen resulterar i en förvärv/tidsram av 18 ms i dubbelriktade läget med en 8 KHz resonant scanner; med 512 x 200 och 4 x i genomsnitt, det saktar ner till 56 ms per bildruta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi för undersökning av tumören och säkerheter fartyget tillväxt utlöses av monocyter kan hjälpa till att avslöja nya aspekter i molekylära mekanismer för tumör angiogenes och arteriogenesis. Cellerna måste vara beredd och injiceras noggrant anvisningarna i protokollet. Skillnader kan leda till variationer mellan enda experiment. I monocyter måste injiceras i venösa systemet (figur 1) för att upprätthålla systemiska effekter och undvika embolier, vilket kan inträffa om injektionen sker i de arteriella systemet.
Om basalmembranet-liknande matris används, injicera långsamt för att undvika spridning hjälper med plug explantation för ytterligare Histologisk undersökning (figur 2, figur 3). Efter att offra musen, kommer att basalmembranet-liknande matris kontakten vara explanted från flanken av musen. Inom i basalmembranet-liknande matris kontakten, kan vi mäta vaskularisering genom att räkna kapillärer inom olika experimentella inställningar (figur 4, figur 5).
En annan förutsättning för framgångsrika experiment är inställningen Mikroskop, som beror på programvara, maskinvara och djur förberedelse (figur 6). Om subcellulära strukturer (< 2 µm) behöver identifieras, ett upprätt Mikroskop med 2-Photon-excitation och vatten nedsänkning mål (20 X eller 25 X, sifferformat bländare 1.0) med långa arbetsavstånd (> 2 mm) är lämpligt. Eftersom vatten nedsänkning mål med hög siffra bländare är extremt känsliga för brytningsindex variationer, måste den optimala upplösning och ljusstyrka justeras genom att flytta en korrigering krage på målet. Justering för hand är tyvärr ganska svårt på grund av begränsat utrymme. Därför erbjuds dyra mål med en motoriserad krage korrigering av mikroskopet tillverkare.
Om cellulära upplösning (5-10 µm) räcker, en 10 x torka linsen med en siffer bländare 0,4 eller högre och en lång arbetsavstånd (> 2 mm) rekommenderas. I det här fallet kan en upprätt eller en inverterad mikroskopstativet väljas. Levande cellen imaging med en 10 X torr lins (siffran bländare 0,4) på högre zooma faktorer (> 3) är mycket enklare och billigare eftersom klassiskt confocal laserscanning mikroskopi (dvs, 1 Photon excitation) kan användas för att erhålla bildstaplar med tillräcklig upplösning. Om det krävs mycket tid för förvärvet av bilder, minskar rodamin dextran inom fartyget. För en bättre synlighet av fartygen, injektion av fluorophore måste upprepas (figur 7).
Det är mest effektivt att prova olika justeringar och välja den bästa bildkvaliteten som möjligt. Användningen av positiva sonder för celler eller basalmembranet-liknande matris (utan transplantation) kan hjälpa till att erhålla optimala inställningar. Vi kunde upptäcka märkt monocyter via intravital microcopy inom blod flöde och muskel vävnad (figur 8, bild 9). Histologisk undersökning av vävnadssnitt kontrollerar våra fynd (figur 10).
Figur 1 : Injektion av 2,5 miljoner monocyter i svansen ven. Vener är belägna på den laterala sidan av svansen, med artärer på rygg- och ventrala sida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Injektion av basalmembranet-liknande matris. Hantera huden på musen och injicera basalmembranet-liknande matris i flanken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Explanterad matrix plug från flanken av musen (se punkt 3.5). Bolagiserade fartyg fem dagar efter monocyt transplantation via svans venen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförelse av vaskularisering inom matrisen basalmembranet-liknande ( 
+ SD, n = 3 i varje grupp). Fartyg inom i basalmembranet-liknande matris kontakten, med ingen tillväxtfaktor som lagt till (röd stapel), jämfört med fartyg av basalmembranet-liknande matris plug med tillväxtfaktor lagt till. Komplettering av basalmembranet-liknande matris med tillväxtfaktor leder till ökad fartyget tillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Fartyg inom basalmembranet-liknande matris kontakten. Visualisering av blod flöda (röd) inom fartyg (pilar) och monocyt homing (grön) inom basalmembranet-liknande matris kontakten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Mus förberedd för bild förvärvandet. Tassarna är fast med tejp och en skyddsglaset är placerad på toppen av två justerbara frimärken. Regionen av intresse var censurerade med en skalpell. NaCl används för att fukta området så kvaliteten på bilder och vävnad inte kommer att äventyras.
Figur 7 : Minskade synlighet fartyg. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat målat monocyter (pilar) i basalmembranet-liknande matris bredvid ett fartyg (längdsnitt, *). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Monocyt spolas in kärlet. In vivo visualisering av 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat färgas och transplanteras monocyt (grön pil) i säkerheter artär (*). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9 : Intravital mikroskopi. 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat målat monocyter (pilar) inom säkerheter fartyg med typiska korkskruv bildandet (*) färgas med rodamin dextran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Immunohistological färgning av Lårmuskulatur. Fartyg (röd: alfa smooth muscle aktin, *), makrofager (grön: 3, 3'-Dioctadecyloxacarbocyanine perklorat, pilar), cellkärnan (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här belyser utvecklingen av säkerheter artärer, uppförandet av monocyter i dessa fartyg, och processen för arteriogenesis. Stegen för tillämpningen av detta protokoll är lätt att lära sig och kan användas inom andra områden av vetenskap. Trots dessa fördelar finns det några nackdelar. Exempelvis är mikroskopisk utrustning krävs för att köra teknikerna som beskrivs. Att skaffa utrustning för ett experiment är ohållbar, så det är viktigt att samarbeta med andra institutioner att dela enheter.
Det finns andra svårigheter i samband med detta protokoll som kan undvikas med praktiken. I början, det kan finnas problem med positionering musen under mikroskopet och bildkvalitet kan lida under dessa omständigheter. En annan kritisk punkt är svansen ven injektionen. Monocyter kan endast ses i venerna om injiceras korrekt. Därför är det tillrådligt att öva injektion innan du placerar musen.
Monocyt isolering är också kritisk. Monocyter kan isoleras från olika arter använder flera protokoll, vilket ofta leder till olika resultat och cell avkastning12,13,14. Det är nödvändigt att arbeta i sterila förhållanden att undvika kontaminering. Cellskador bör förhindras genom pipettering noggrant och upprätthålla konstant temperatur.
Trots dessa nackdelar är denna metod praktiska och enkla att utföra, så att användarna kan belysa tumör angiogenes och grundläggande mekanismerna bakom perifer arteriell sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den ELSE-Kröner-Stiftung och den DFG (Deutsche Forschungsgemeinschafts, tyska Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, collaborative research center). Speciellt tack till Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Tyskland, för teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- Matrigel Matrix. , https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017).
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. oA., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
