Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56301
Automatic Translation
1,6, 2, 3, 1, 4, 1, 1, 1, 5, 6, 2,7, 5, 6, 1,8
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Summary

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

Abstract

Mitochondriën zijn de krachtpatsers van cellen en cellulaire energie in de vorm van ATP produceren. Mitochondriale dysfunctie bijdraagt aan biologische veroudering en een breed scala aan aandoeningen waaronder neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), metabole ziekten en voortijdige veroudering syndromen. Onderhoud van mitochondriale gezondheid hangt af van mitochondriale biogenese en de efficiënte goedkeuring van disfunctionele mitochondria via mitophagy. Experimentele methoden te nauwkeurig detecteren autophagy/mitophagy, met name in diermodellen, hebben zijn uitdagend om te ontwikkelen. Recente vooruitgang op weg naar het begrip van de moleculaire mechanismen van mitophagy heeft de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken ingeschakeld. Hier introduceren we verschillende veelzijdige technieken voor het controleren van mitophagy in menselijke cellen, Caenorhabditis elegans (bijvoorbeeldRosella en DCT-1 / LGG-1 stammen), en muizen (mt-Keima). Een combinatie van deze mitophagy detectietechnieken, met inbegrip van cross-soorten evaluatie, zal de nauwkeurigheid van de metingen van de mitophagy verbeteren en leiden tot een beter begrip van de rol van mitophagy bij gezondheid en ziekte.

Introduction

Mitophagy is essentieel voor mitochondriale onderhoud. Mitochondriën kruisen meerdere cel signalering van trajecten en zijn universele sub cellulaire organellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire energieproductie, celstofwisseling en calcium homeostase1,2,3, 4. mitochondria voortdurend ervaring uitdagingen van endogene en exogene bronnen, zoals reactieve zuurstof soorten (ROS) en toxische stoffen in het mitochondriale, respectievelijk, die leiden tot de generatie van "leeftijd" en disfunctionele mitochondriën. Accumulatie van beschadigde mitochondriën verlaagt de efficiëntie van de ATP productie terwijl het verhogen van de hoeveelheid schadelijke ROS, en is gekoppeld aan de leeftijd gerelateerde ziekten zoals metabole ziekten, AD, en PD1,5,6 . Om te voorkomen dat mitochondriën geïnduceerde cellulaire dysfunctie, cellen moeten specifiek herkennen beschadigd mitochondriën en efficiënt verwijderen hen via een cellulaire proces genoemd mitochondriale autophagy (mitophagy). Dit toonde het belang aan van mitophagy in gezondheid en ziekte illustreert de behoefte aan nauwkeurige en efficiënte methoden voor het detecteren van mitophagy zowel in vitro als in vivo.

Mitophagy is een proces van meerdere stappen waarbij veel eiwitten en eiwit complexen5,7,8. Kortom, wordt een beschadigde mitochondrion eerst herkend en opgeslokt door een dubbel-membraned phagophore, die afkomstig van het plasmamembraan, endoplasmatisch reticulum, Golgi-complex, nucleus of mitochondrion zelf9,10 zijn kan. De sferische phagophore kieuwopeningenvorm en uiteindelijk zeehonden de mitochondriën binnen, vormen de mitochondriale autophagosome (mitophagosome). De mitophagosome combineert vervolgens met het lysosoom voor afbraak, vorming van een autolysosome waarin de beschadigde mitochondrion aangetast en gerecycleerde7,8 is. Grote autophagic eiwitten ook betrokken bij mitophagy omvatten: Autophagy verwante 7 (ATG7) en Beclin1 (initiatie), Microtubule-Associated eiwit 1A/1B-Light ketting 3 (LC3-II) (LGG-1 in C. elegans) en p62 (onderdelen van phagophore), en Lysosomale-geassocieerde membraan glycoproteïne 2 (LAMP2)6,7. Daarnaast zijn er verschillende essentiële eiwitten uniek voor mitophagy, met inbegrip van PTEN-geïnduceerde putatief Kinase 1 (roze-1), Parkin1, nucleaire Dot eiwit 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interactie eiwit 3 zoals (NIX/BNIP3L) (DCT-1 in C. elegans), o.a.5,6,11.

Een gemeenschappelijke methode voor de opsporing van wijzigingen in niveaus van autophagy is door de verhouding tussen LC3-II/LC3-I of LC3-II/actine. Deze methode is echter niet-specifieke, zoals een toename van deze verhouding kan een verhoogde initiatie of een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan samensmelting van mitophagosome en lysosoom12weerspiegelen. Een andere methode is het evalueren van de colocalization tussen een autophagy marker (bijvoorbeeldLC3) en een mitochondriale eiwit (bijvoorbeeldTranslocase van buitenste mitochondriale membraan 20 (TOMM20, die kan worden afgebroken door Proteasomen)). Echter, dit kan alleen veranderingen in de totale mitophagy aangeven en kan geen onderscheid maken de stappen welke blokkade optreedt. Dit kan worden verduidelijkt met behulp van lysosomale remmers (bijvoorbeeld, E64d + Pepstatin A, zogenaamde EP) parallel aan de accumulatie van mitophagosomes veroorzaken. Het verschil tussen het aantal mitophagosomes op de basislijn en het aantal mitophagosomes na behandeling met EP kan duiden op mitophagy. Deze beperkingen hebben gevraagd de ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken. Met het oog op de toenemende relevantie van mitophagy in een breed spectrum van ziekten bij de mens presenteren wij verschillende robuuste mitophagy detectietechnieken die nuttig voor onderzoekers zijn kunnen. Wij dekken zowel in vitro als in vivo technieken en adviseren combineren meerdere technieken om te controleren of de wijzigingen van de mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieren (mannelijke en vrouwelijke muizen) werden geboren en getogen in een geaccrediteerde dier faciliteit, overeenkomstig en goedkeuring van het NIH Animal Care en gebruik Comité. Euthanasie methoden moeten verenigbaar zijn met alle nationale en institutionele regelgeving.

1. detectie van Mitophagy in menselijke cellen

  1. Detectie van mitophagy met behulp van mt-Keima plasmide
    Opmerking: Het Keima eiwit, gesmolten in een mitochondrium doel signaal, vereenvoudigd als mt-Keima, is nuttig voor in vivo mitophagy detectie gebleken. MT-Keima is een ratiometric pH-gevoelige fluorescerende eiwit dat groene fluorescentie (excitatie 458 nm) in basic of neutrale voorwaarden en rode fluorescentie (excitatie 561 nm) in zure omstandigheden vertoont. Gezonde mitochondriën gedijen in basic of neutrale voorwaarden (pH 7-8) en groene fluorescentie wanneer transfected met mt-Keima worden aangeduid. Als mitochondriën ondergaan van mitophagy fuse met zure lysosomen, de pH druppels naar 4.5 en mitochondriën met mt-Keima vertonen rode fluorescentie6,13,14. Nog belangrijker is, is de mt-Keima resistent tegen lysosomale proteasen, inschakelen van de evaluatie van de mitophagy over langere perioden. Het onderstaande protocol is ontworpen voor 6-Wells-platen.
    1. Dag 1: Primaire menselijke cellen (bv, fibroblasten) of vereeuwigd menselijke cellen (bv, Hela cellen of U2OS cellen) gebruiken. Zaad ongeveer 0,3-1 × 10-6 cellen/well (afhankelijk van de snelheid van de groei cel om cellen te 70% confluentie bereiken op de volgende dag) in een 6-well-plate. Handhaven van de cellen in de volledige cel kweekmedium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) medium aangevuld met 10% FBS, en 1% gemengde oplossing van penicilline-streptomycine), en broeden in een cel cultuur incubator bij 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Voeg 1 mL volledige cel kweekmedium per putje in een 6-well-plate.
      Opmerking: Gene overexpressie/knockdown of drug behandelingen kunnen worden gedaan op deze fase6.
    2. Dag 2: Meng mt-Keima plasmide DNA6 en DNA transfectiereagens (het mengsel voor één putje van de plaat van een 6-well).
      1. Verdun 15 µL van een DNA-transfectiereagens met 150 µL van serumvrij medium volgens protocol van de fabrikant.
      2. Verdun 2-5 µg mt-Keima plasmide DNA met 150 µL van serumvrij medium.
      3. Verdunde mt-Keima plasmide toevoegen aan verdunde DNA transfectiereagens, vortex voor 10 s, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
        Opmerking: Optimalisatie van DNA transfectie omstandigheden kan het nodig zijn afhankelijk van de grootte van de plaat (Zie de fabrikanten protocollen voor details).
      4. DNA/transfectie reagens mengsel ontkleuring aan cellen toevoegen, dan schudden de platen gedurende 5-10 s zachtjes totdat de oplossing geheel is gemengd.
    3. Dag 3: Wijzig de media door vervanging van het DNA transfectie reagens-bevattende medium met verse volledige cel kweekmedium (1 mL/putje).
    4. Dag 4: Het imago van de cellen met behulp van de confocal microscopie6. Gebruik twee imaging kanalen: groene kanaal (excitatie 458 nm, emissie 570-695 nm) aan visualiseren normale mitochondriën en rode kanaal (excitatie 561 nm, emissie 570-695 nm) te visualiseren mitochondriën die mitophagy ondergaan. Willekeurig afbeeldingsgebieden 20 onder 40 x vergroting ter dekking van een totaal van 100-200 cellen in elke goed.
    5. Gegevensanalyses uitvoeren. Berekening van de "mitophagy index" (percentage van mitochondriën ondergaan mitophagy), met behulp van de software van de analyse van de afbeelding te kwantificeren van het bedrag van de fluorescentie in beide de rode en groene kanalen: de verhouding tussen rode fluorescentie te rood + groen fluorescentie, nemen en vermenigvuldig met 1006.
      Opmerking: Alternatieven voor Transfectie zijn het gebruik van mt-Keima stabiel uitgedrukt HeLa cel lijnen14. Aangezien HeLa cellen doen niet express Parkin, moet Parkin stabiel te studeren Parkin-afhankelijke mitophagy in deze cellijn worden uitgedrukt.
  2. Detectie van mitophagy met behulp van de colocalization tussen cytochroom C oxidase subeenheid II (COXII) en LAMP2
    Opmerking: COXII is een eiwitten mitochondriaal genoom-gecodeerde binnenste membraan. De 'mitophagy-index' is gelijk aan de verhouding van de COXII colocalized met LAMP2 uitgedrukt als een percentage van het totale bedrag van COXII.
    1. Zaad van HeLa cellen (of andere cellen van belang vermeld in stap 1.1.1) in een 4-well kamer dia (1-5 × 104 cellen in 1 mL volledige cel kweekmedium per putje) in een cel cultuur incubator bij 37 ° C (20% O2, 5% CO2) 's nachts.
    2. Voeg 3.0 µL van 10 mM carbonyl cyanide - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) en broeden in de cel cultuur incubator (stap 1.2.1) voor 3 h.
      Opmerking: Andere drugs op het gebied van mitophagy mogen worden gebruikt.
    3. Verwijderen met behulp van een precisiepipet 1 mL gestolde voedingsbodem, wassen van de cellen tweemaal met 1 mL/goed of koude (0-4 ° C) 1 x PBS. Laat de oplossing zitten voor 10-30 s voordat de volgende wasbeurt. Dan Voeg 0,5 mL 3,7% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS aan elk putje en incubeer gedurende 10 min op het ijs om op te lossen van de cellen.
      Let op: PFA is toxine. Werken in een zuurkast bij het gebruik van de PFA.
    4. Negeren van de PFA-oplossing met behulp van een precisiepipet 1 mL, wassen van de cellen tweemaal met koude 1 X PBS (1 mL/putje; laat oplossing zitten voor 10 s voordat de volgende wasbeurt), en permeabilize van de cellen met 1 mL/goed van 0,25% wasmiddel (in 1 x PBS) gedurende 10 minuten op het ijs.
    5. Gooi de permeabilizing buffer, voorzichtig wassen de cellen tweemaal met koude 1 x PBS en teruggooi (laat de oplossing zitten voor 10 s tussen de wasbeurten). Blokkeren van de cellen met 1 mL/goed voor 5% FBS in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C. De kamers om te voorkomen dat vochtverlies te dekken.
    6. 0,5 mL per putje van een gemengde antilichaam-oplossing met COXII antilichaam (muis, 1:250 verdunning) en LAMP2 antilichaam (konijn, verdunning 1:20-1:50) in 1 x PBS met 5% FBS, en winkel op ijs bereiden voor 0,5-1 h.
    7. Neem de dia 4-well kamer uit de koude kamer en gooi de blokkerende oplossing met een pipet 1 mL. Voorzichtig wassen de cellen tweemaal met 1 mL/goed of koude 1 x PBS en teruggooi (laat de oplossing zitten voor 10 s tussen de wasbeurten), dan Voeg 0,5 mL/goed van gemengde antilichaam oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een roteerapparaat bij lage snelheid.
    8. Negeren van de eerste antilichaam oplossing met behulp van een precisiepipet 1 mL en voorzichtig wassen de cellen drie keer met 1 mL/goed of koude 1 x PBS en negeren. Laat de oplossing voor 10 zit s voordat de volgende wasbeurt. 1 mL/putje van fluorescerende secundaire antilichamen (bv, geit anti-konijn met rode fluorescente proteïne (RFP) voor LAMP2; nm golflengte 568 en geit-antimuis met groen fluorescente proteïne (GFP) voor COXII nm golflengte 488) invoegtoepassing 1:250 verdunning met 5% FBS in 1 x PBS. Bedek de dia 4-well kamer met aluminiumfolie en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur in een roteerapparaat bij lage snelheid.
    9. Gooi de tweede antilichaam-oplossing met een pipet 1 mL. Voorzichtig wassen de cellen zesmaal met 1 mL/goed of koude 1 x PBS. Laat de oplossing zitten voor 1 min vóór de volgende wasbeurt.
    10. Monteren van de cellen met 50 µL per putje van antifade montage medium met DAPI en voeg cover slips.
    11. Afbeelding van de cellen onder een confocal microscoop met 66 x vergroting en immersie-olie (tegel scant / mozaïeken kunnen worden gebruikt om het aantal cellen beeld door de software te verhogen). Gebruik dezelfde instellingen zoals belichtingstijd kanaal digitale winst, digitaal offset, etc. in alle imaging processen (zie software instructies voor details)15.
    12. Gebruik de software van de analyse van de colocalization kwantitatief analyseren ten minste 20 willekeurige beelden van 100 cellen15. De functie "Gesloten Bezier-" hele individuele cellen te selecteren. Vergelijken van de Pearson colocalization coëfficiënt van GFP aan RFP, gewogen of ongewogen, om te bepalen mitophagy niveaus in geanalyseerde cellen. Waarden voor horizontale en verticale crosshairs van de software van de analyse van het colocalization in de gehele analyse te handhaven. Nauwkeurig instellen deze crosshairs, bereiden van twee extra soorten cellen en labelen van een COXII en de andere LAMP2. Stel vervolgens crosshairs direct boven de verdeling van de pixel voor elk kanaal15 (Zie de instructies van de software voor meer informatie).
  3. Een hoge doorvoersnelheid imaging meting voor mitophagy screening
    Opmerking: Het uitvoeren van hoge-doorvoer schermen van mitophagy-inducerende of mitophagy-remmende stoffen uit grote samengestelde bibliotheken technisch eist. Een beeldvormende techniek gebaseerd op de colocalization van de mitochondriën met autophagosomes is een meer simplistisch, maar zeer gevoelige alternatief voor mitophagy screening van16.
    1. Dag 1: Zaad cellen (bijvoorbeeld, menselijke primaire fibroblasten op 5.000 cellen/100 mL cel voedingsbodems per putje) in een 96-wells-plaat (zie stap 1.1.1).
    2. Dag 2: De cellen vanaf de tweede dag met FCCP of andere stoffen van belang voor aangewezen incubatietijd behandelen (zie stap 1.2.2).
    3. Volg stappen 1.2.2-1.2.9 met behulp van de primaire antilichamen voor COXII (muis, 1:250 verdunning met 5% FBS in 1 x PBS) en LC3B (konijn, 1:100-1:200 met 5% verdunning FBS in 1 x PBS). U kunt ook kunnen primaire antilichamen voor COXII en LAMP2 worden gebruikt.
    4. Het imago van de cellen met behulp van een fluorescerende lezer16. Het verzamelen van beelden in willekeurig geplaatste velden en met een minimum 500 cellen per putje.
    5. Analyseren van gegevens met behulp van een cel analyzer aangepast protocol16.

2. detectie van Mitophagy in C. elegans

Opmerking: De nematode C. elegans biedt een platform voor het mitophagy op het niveau van organisch assay. Twee spanningen kunnen worden gebruikt voor het controleren van mitophagy: (1) mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) of (2) mitophagy receptor DCT-1 gefuseerd met GFP samen met autophagosomal marker LGG-1 gefuseerd met Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy controleren met Rosella biosensor
    Opmerking: Rosella is een moleculaire biosensor die een pH-ongevoelig DsRed gesmolten tot een pH-gevoelige GFP variant combineert. De Rosella biosensor profiteert van de pH-verschillen tussen de zure lysosoom (pH ~ 4.5) en andere cellulaire compartimenten. Deze biosensor is gebruikt om te controleren met succes mitophagy in Saccharomyces cerevisiae en verschillende zoogdieren cellijnen, zoals HeLa, HEK293 en HCT11618,19. We deze veelzijdige dual-belichting fluorescerende verslaggever aangepast en gegenereerd transgene C. elegans nematoden uiting van mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) in spiercellen lichaam-muur. Mitophagy-inductie wordt aangegeven door een verminderde GFP/DsRed-ratio van mtRosella fluorescentie.
    1. Dag 1: Kies L4 larven van wormen uiting van mitochondriën-gerichte Rosella (mtRosella) in spiercellen van de lichaam-muur op een bord van de Nematode groei Media (NGM) met E. coli (OP50) met behulp van een dissectie Microscoop5agarvoedingsbodem. 10-20 wormen/plaat plaatsen op ten minste drie 3,5 cm platen. Incubeer de nematoden in de standaard temperatuur van 20 ° C5.
      Opmerking: Zie referentie voor de worm-anatomie, met inbegrip van de identificatie van L4 larven20, en de manier om een pick die wordt gebruikt voor het overbrengen van wormen van de ene locatie naar een andere21.
    2. Dag 5: Synchroniseren nematoden door het selecteren van 15-20 L4 transgene larven en overbrengen van hen naar vers OP50 agarvoedingsbodem NGM plaat. Het gebruik van ten minste vijf platen per experimentele conditie.
    3. Dag 7: Bereiden voertuig platen voor mitophagy-op het gebied van drugs van belang of de positieve controle.
      1. E. coli (OP50) bacteriën zaadjes door bloot NGM platen voor 15 min met 222 μW/cm2 (intensiteit) van UV-licht om ervoor te zorgen dat de mitophagy-inducerende stoffen niet worden gemetaboliseerd door bacteriën te doden. Platen moeten worden blootgesteld met 2.000 J/m2.
        Opmerking: Seconden van de blootstelling nodig = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Verbinding(en) van belang aan de bovenkant van de geplaatste NGM platen toevoegen. Een equivalente hoeveelheid samengestelde voertuig (oplosmiddel gebruikt te ontbinden verbinding, zoals dimethylsulfoxide (DMSO)) toevoegen aan de platen van het voertuig als een negatieve controle. Voor de positieve controle van mitophagy inductie, een mitochondriale veroorzaken, werd paraquat (8 mM eindconcentratie) gebruikt. Voeg een oplossing met 10 µL van 8 M paraquat voorraad met 190 µL van ddH2O op de bovenkant van de agarplaat voor de behandelde groep. Toevoegen voor de voertuig-groep, een oplossing met 10 µL van DMSO met 190 µL van ddH2O op de bovenkant van de agarplaat.
        Opmerking: De paraquat-werkende oplossing kan worden bewaard voor 1 maand bij 4 ° C.
      3. Swirl zachtjes de platen tot de drug of voertuig jassen het gehele oppervlak. Laat de platen te drogen met de deksels gesloten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór de overbrenging van de wormen.
        Opmerking: Drug platen kunnen ook worden bereid door toevoeging van drugs in de vloeibare NGM voordat het stolt.
    4. Dag 7: Transfer 10-20 van 2-dagen oude volwassen transgene dieren bereid in stap 2.1.2 aan platen met ofwel paraquat, verbinding(en) van belang, of voertuig (DMSO). Incubeer de transgene dieren bij 20 ° C gedurende 2 dagen.
    5. Dag 9: Voorbereiden 2% agarose pads (Zie Aanvullend materiaal). Voeg vervolgens één druppel (10 µL) van 20 mM levamisole in M9 per pad. Immobiliseren de transgene dieren voor imaging, door ze te plaatsen in de daling van de M9-levamisole. Op de top plaatsen zachtjes een dekglaasje aan.
    6. Vangen enkele transgene dieren met behulp van een camera die is aangesloten op een epifluorescence Microscoop. Fluorescerende beelden van hele transgene nematoden uiting van mtRosella in de spiercellen lichaam-muur op 10 X vergroting5te verwerven. De verzamelde afbeeldingen opslaan.
    7. Het verwerken van de verkregen beelden met ImageJ software. Het analyseren van de spiercellen van de muur van het lichaam gelegen in de kop van de worm te voorkomen autofluorescence in de intestinale weefsel. Het meten van de gemiddelde intensiteit waarde en totaal pixelgebied voor elke fluorescerende beeld alleen van de hoofd regio van elk dier. Voor het analyseren van het specifieke gebied van belang:
      1. Selecteer 'split kanaal' onder de 'afbeelding' en 'kleur' drop-down menu om afbeeldingen te converteren.
      2. Gebruik het gereedschap 'freehand selecteren' om vast te leggen van de fluorescerende interessegebied.
      3. Selecteer de opdracht 'meting' onder het 'analyseren' drop-down menu en pixel intensiteit analyses uit te voeren.
      4. Intensiteit van de pixel moet worden genormaliseerd door te delen door de totale oppervlakte geanalyseerd intensiteit. Bij normalisatie, berekenen het GFP DsRed verhouding22.
    8. Met behulp van statistische analyse software te voeren student t-test (vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) voor statistische analyse met p < 0.05 als belangrijke5,17 .
  2. Beoordeling van mitophagy co lokalisatie tussen DCT-1 en LGG-1 gebruiken
    Opmerking: DCT-1 is een mitochondriale buitenmembraan eiwit dat als een mitophagy receptor in reactie fungeert op de vermeende orthologues BNIP3 en NIX/BNIP3L in zoogdieren5soortgelijke omstandigheden, spanning. Mitophagy inleiding wordt dus beoordeeld door co lokalisatie tussen DCT-1 mitophagy receptor en autophagosomal membraan eiwit LGG-1 (homolog van de zoogdieren LC3).
    1. Dag 1: Pick L4 larven van transgene dieren zowel DCT-1::GFP en DsRed::LGG-1 uiten in lichaam-muur spier cellen5 op een OP50 zaadjes NGM plaat. Plaats van 5-10 wormen/3.5 cm plaat, en het gebruik van ten minste drie platen. Incubeer de nematoden bij 20 ° C.
      Opmerking: De transgenen bevinden zich op afzonderlijke plasmiden en ze zijn niet geïntegreerd in het genoom. Pick-up nematoden uitvoering van zowel rol-6(su1006) als pmyo-2 GFP contransformation markeringen. Alleen express transgene wormen met beide markeerders contransformation zowel DCT-1::GFP en DsRed::LGG-1 in de spiercellen lichaam-muur.
    2. Volg de stappen van de 2.1.2-2.1.5.
    3. Beeld enkele lichaam-muur spiercellen met behulp van een camera die is aangesloten op een confocal microscoop5,23. Detecteren van de grenzen van het hele lichaam-muur spiercellen en nemen z-stapel afbeeldingen onder 63 x vergroting. Hogere vergroting kan ook worden gebruikt.
    4. Open en verwerken van de beelden verkregen met de confocal software. Inleiding van mitophagy wordt aangegeven door co lokalisatie van de mitophagy receptor (DCT-1::GFP) naar de markering van de autophagosomal (DsRed::LGG-1). Handmatig meten co lokalisatie evenementen in elke stapel van lichaam-muur spier cel5. Het is essentieel om alle Microscoop en de camera instellingen (lens en vergrootglas, filters, belichtingstijd, resolutie, laser intensiteit, winst, etc.) experimenten consistent te houden. Alle instellingen dient te worden opgemerkt.
    5. Met behulp van statistische analyse software te voeren student t-test (vergelijking tussen twee groepen) of ANOVA (vergelijking tussen meerdere groepen) voor statistische analyse met p < 0.05 als belangrijke5,17 . Voor twee-weg vergelijkingen gebruik van de Student t-test (p < 0.05 wordt beschouwd als belangrijke). Voor de meerdere vergelijkingen gebruik de enige factor (ANOVA) variantie-analyse, gecorrigeerd door de post hoc Bonferroni-test. Het is raadzaam analyseren ten minste 50-70 dieren of lichaam-muur spiercellen van de 30-50 voor elke experimentele voorwaarde. Herhaal het experiment ten minste driemaal.

3. opsporing van Mitophagy in muizen

Opmerking: Bovenstaande methoden voor de opsporing van mitophagy in muizen waren omslachtig, ongevoelig en moeilijk te kwantificeren. Een transgeen muismodel uitdrukken van de mitochondriale-gerichte vorm van de fluorescerende verslaggever Keima kan (mt-Keima) nu worden gebruikt voor de beoordeling van de niveaus van mitophagy in een brede waaier van fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

  1. Muizen met behulp van een protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité14euthanaseren.
  2. Beveilig de muis (ventrale kant naar boven) tot het werkplatform met behulp van pennen in de ledematen. Maak een incisie in de onderbuik met behulp van microchirurgie schaar en pincet om de lever24bloot te stellen. Knip een stukje van de lever (bijvoorbeeld, een stuk van juiste kwab 1 × 1 × 1 cm) met behulp van microchirurgie schaar en pincet.
    Opmerking: Detectie van mitophagy in muizen is ingewikkeld en vereist kennis over de anatomie van de muis en zeer bekwame muis hanteren en muis chirurgie. Dit protocol biedt elementaire, belangrijke stappen op deze methode, en een meer gedetailleerde methode is beschikbaar24.
  3. Leg het lever monster op een metalen plaat op het ijs snel afkoelen van het weefsel. Houd het weefsel op de koude metalen plaat en zo snel mogelijk verwerken. Optimaal gebruik binnen 1 uur van dissectie.
  4. Til de lever monster met behulp van gebogen pincet en spoel met 5 mL ijskoud 1 x PBS.
  5. De lever overbrengen in een petrischaal (Ø 100 mm) op het ijs met behulp van de lepel einde van een spatel.
  6. Snijd de lever monster met de hand in 0,5-1 mm dik secties met behulp van single-edge mesjes.
  7. Zorgvuldig overbrengen in de weefselsecties een glazen bodem schotel met behulp van microchirurgie pincet.
  8. Stel de lever sectie zorgvuldig met een tang plat op de bodem.
  9. Dekken de gesneden lever met 3-5 druppels koude 1 x PBS.
    Opmerking: DAPI kleuring wordt aanbevolen om het identificeren van de regio van belang in bepaalde weefsels (bijvoorbeeld, hersenen)24. Als u wilt valideren co lokalisatie van het signaal rood mt-Keima met het lysosoom, kunnen lysosomale kleurstoffen, zoals dextran trapsgewijs blauw en lysosensor, gebruikte24.
  10. Het imago van de weefselsecties onder confocale microscopie via twee opeenvolgende excitaties24. Twee imaging-kanalen instellen: "groen" mt-Keima kanaal (excitatie 458 nm, emissie 570-695 nm bereik) en 'rood' mt-Keima (excitatie 561 nm, emissie 570-695 nm bereik). Imaging instellingen tussen experimentele omstandigheden behouden. Voor een efficiëntere imaging, twee dieren tegelijk te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detectie van Mitophagy in menselijke cellen:

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, waren menselijke HeLa cellen transfected met mt-Keima plasmide. Gezonde cellen aangetoond een goed georganiseerde mitochondriale netwerk (GFP, 488 nm) met enkele gevallen van mitophagy (RFP, 561 nm). Echter cellen voorbehandeld met een mitochondriaal uncoupler FCCP (30 µM voor 3U) tentoongesteld een grote stijging in mitophagy incidentie (figuur 1A). Mitophagy werd ook gemeten met behulp van de co lokalisatie tussen LAMP2 en COXII (figuur 1B).

Detectie van Mitophagy in C. Elegans

We hebben onderzocht de lichaam-muur spier cellen van transgene nematoden uitdrukken DsRed gefuseerd met LGG-1 en mtRosella of DCT-1 gefuseerd met GFP onder normale en mitophagy-inducerende voorwaarden zoals oxidatieve stress. Transgene dieren werden blootgesteld aan paraquat (8 mM voor 2 dagen). Mitophagy-inductie wordt aangegeven door de verminderde GFP/DsRed verhouding van mtRosella fluorescentie (figuur 2A). Bovendien betekent het verhoogde aantal CO lokalisatie gebeurtenissen tussen DCT-1::GFP en DsRed::LGG-1 signalen mitophagy stimulatie in reactie op oxidatieve stress (figuur 2B).

Detectie van Mitophagy met behulp van de mt-Keima muizen:

Analyse van in vivo mitophagy Imaging biedt inzicht in mitophagy in normale en pathofysiologische omstandigheden. Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, kan mitophagy voorkomen in de weefsels van verschillende organen, zoals lever en cerebellum (Figuur 3), worden gevisualiseerd met confocale mitophagy.

Figure 1
Figuur 1. Verschillende methoden voor de evaluatie van mitophagy in menselijke cellen. (A) menselijke HeLa cellen werden transfected met mt-Keima plasmide voor drie dagen, gevolgd door beeldvorming op beide 488 nm en 561 nm. Als positieve controle, werden ceflls behandeld met FCCP (30 µM) 3 h voorafgaande aan imaging. (B) beelden van menselijke primaire fibroblasten gekleurd met LAMP2 (RFP) en COXII (GFP). (C) afbeeldingen van menselijke fibroblasten gekleurd met anti-TOM20 (rood) en antilichamen anti-LC3 (groen). De balken aan de rechterkant geven de uitlezing van de mitochondriën mede lokaliseren met autophagosomes. Co lokalisatie wordt verhoogd met energetische stress (galactose glucose-vrije media) en de toevoeging van lysosomale remmers E64d en Pepstatin A (EP) voor 24 h. representatieve schaal bars voor (A), (B), en (C) worden aangeduid op de laatste figuur van elk paneel, onafhankelijk van elkaar. Kwantitatieve gegevens worden weergegeven in de gemiddelde ± S.E.M. ***p < 0.001; t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. In vivo -detectie van mitophagy in C. elegans. (A) transgene nematoden uiting van mtRosella in het lichaam-muur spiercellen werden behandeld met 8 mM paraquat. Mitophagy stimulatie wordt aangegeven door de verminderde verhouding tussen pH-gevoelige GFP naar pH-ongevoelig DsRed (n = 50; ***p < 0.001; t-test). Pijlpunten op intestinale autofluorescence wijzen. Schaal balken duiden 20 µm. verwerving details: belichtingstijd, 200 ms; Contrast, middellange. Beelden werden verkregen met behulp van een 10 X-objectief. Kwantitatieve gegevens staan in gemiddelde ± S.E.M. waarden. Transgene nematoden (B) mede uiting geven aan de mitophagy receptor die DCT-1 gefuseerd met GFP samen met het autophagosomal eiwit dat LGG-1 gefuseerd met DsRed in de spiercellen lichaam-muur werden blootgesteld aan 8 mM paraquat. Mitophagy-inductie wordt aangegeven door co lokalisatie van GFP en DsRed signalen (voor elke groep van beelden DCT-1 wordt weergegeven in het groen op bovenaan, autophagosomes in het rood hieronder en een samengevoegde afbeelding onderaan; n = 30; ***p < 0.001; t-test). Verkoop balken duiden 20 µm. verwerving details: resolutie 1024 X 1024; Master krijgen, Track1: 562 en Track2: 730; Emissie filters, Track1 Kanaal1: 639 nm en Track2 Channel2: 519 nm; Intensiteit, Track1 Laser (543 nm): 12,9% en Track2 (488 nm): droeg 39,4%. Beelden werden verkregen met behulp van een 40 X-objectief. Kwantitatieve gegevens worden weergegeven in de gemiddelde ± S.E.M. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. In vivo detectie van mitophagy in transgene muizen mt-Keima. Representatieve beelden van mt-Keima signalen op het gebied van de kleine hersenen (inclusief Purkinje cellen, lagere paneel) van een mt-Keima-muis en lever (bovenste) (458 nm, groen; 561 nm, red). Schaal balk duidt 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nauwkeurige meting van mitophagy is technisch veeleisend. Hier hebben wij diverse robuuste technieken waarmee beide kwalitatieve detectie van mitophagy en kwantificering van mitophagy niveaus in de meest voorkomende laboratorium experimentele modellen gepresenteerd.

Repliceerbaar om gegevens te vergaren, een experimenteel ontwerp met ten minste drie biologische herhalingen nodig is. Alle onderzoekers die betrokken zijn bij experimenten en de analyse moeten worden verblind experimentele groep identiteiten. Bovendien, imaging velden moet worden willekeurig gekozen tijdens Beeldacquisitie. Voor de celcultuur en C. elegans studies, moeten ten minste drie biologische herhalingen worden uitgevoerd. Voor mt-Keima muis studies, is het aanbevolen om het gebruik van een voldoende aantal muizen om statistische significantie. Analyseren van 30-100 cellen voor elk experiment voor cellen van zoogdieren, en ten minste 3 verschillende experimenten uitgevoerd. Kwaliteitscontrole op deze stappen kunnen repliceerbaar resultaten. Detectie van mitophagy in gist is onlangs samengevat elders25.

Er zijn verschillende kritische stappen in de in vitro mitophagy detectietechnieken. Efficiëntie van de transfectie, die afhangt van de kwaliteit van de reagentia en het DNA gebruikt, is van vitaal belang tijdens de transfectie van het mt-Keima-eiwit. Optimalisatie van de efficiency van de transfectie in verschillende omstandigheden (bijvoorbeeldmet behulp van verschillende cellijnen) is dus nodig. Voor de methode van de LAMP2/COXII, antilichamenspecificiteit en optimale primair antilichaam verdunning fold invloed op de kwaliteit van de beelden en moeten worden getest voordat u begint met experimenten. Hetzelfde geldt voor de hoge-inhoud beeldvorming methode, waar antilichaam kwaliteit en verdunning zijn van cruciaal belang. Het systeem van geautomatiseerde microscopie en het protocol van aangepaste analyse zorgt voor de beeldvorming en de analyse van ten minste 1.500 cellen/aandoening, waardoor de resultaten zeer robuust in vergelijking met andere in vivo imaging gebaseerde methoden. Bovendien biedt het protocol analyse gegevens over verdere mitochondriale parameters zoals lengte en totale gebied op basis van een cel voor cel, die zeer nuttig is in het mitophagy onderzoek.

In sommige gevallen is het niet aanbevolen om de colocalization van LAMP2 met mitochondriale buitenmembraan eiwitten zoals TOMM20 assay. Een zeer vroeg stadium van mitophagy betrekken Parkin-gemedieerde ubiquitination van mitochondriale buitenmembraan eiwitten, met inbegrip van TOMM20 en Mitofusin 1 (MFN1). Parkin conjugaten meerdere verschillende ubiquitin keten verbanden op deze eiwitten met inbegrip van K48 alternerende ubiquitin kettingen, ter bevordering van de afbraak van het eiwit door de 26S proteasoom. Deze ubiquitinated mitochondriale buitenmembraan proteïnen kunnen daarom nog steeds alhoewel mitophagy geblokkeerde6worden afgebroken. Dit kan laten uitvallen van de gegevens, wat resulteert in valse positieven in algemene data interpretatie. Bovendien, eliminatie van mitochondriaal DNA (mtDNA nucleoids) is een tweede indicator van mitophagy, en het kan worden gekwantificeerd met immunofluorescentie met behulp van een anti-DNA antilichaam6.

Sommige kritische stappen voor de controle van in vivo mitophagy in C. elegans worden hieronder opgesomd:

1. overdracht van transgene dieren naar nieuwe platen die elke 24-48 h wordt aanbevolen om te voorkomen dat de uitgroei van nakomelingen, die tot een gemengde bevolking of honger, dat op zijn beurt leidt kan leiden tot mitophagy. Daarom moeten de niet-uitgehongerd nematoden worden gebruikt.

2. Levamisole is een lichte verdoving die wordt gebruikt om te immobiliseren nematoden. Vermijd verdoving die invloed kunnen hebben op de mitochondriale activiteit, zoals natriumazide. Natriumazide blokkeert componenten van de mitochondriale respiratoire keten en ten energieopwekking, wat leidt tot mitochondriale en oxidatieve stress. Dus, natriumazide dreigt te leiden tot mitophagy.

3. specimens mogen niet uitdrogen tijdens microscopisch onderzoek. Het gebruik van de M9 buffer in plaats van water is daarom aangeraden om gunstige osmotische voorwaarden te garanderen.

4. intestinale autofluorescence toeneemt met de leeftijd in C. elegans. Dus, de spiercellen lichaam-muur dicht bij de darm moeten worden vermeden tijdens microscopisch onderzoek.

5. Indien paraquat niet ertoe mitophagy: a. verhogen paraquat belichtingstijd op wormen, b. verhoging paraquat concentratie of c. bereiden een verse werkoplossing van paraquat aangezien de efficiëntie daalt na verloop van tijd.

6. indien verhoogd matricidal broedeieren wordt waargenomen in wormen blootgesteld aan paraquat, ofwel: a. verminderen de periode van paraquat behandeling, b. verminderen paraquat concentratie, c. supplement platen met fluorodeoxyuridine (FUdR) (finale concentratie van 100-400 μM), een inhibitor van de omwenteling van de DNA-herstelsynthese waardoor ei uitbroeden, of d. het experiment in oudere wormen (bijvoorbeeld, 4 dagen oude wormen) voeren.

Deze procedure beschrijft de stappen voor imaging-mitophagy in de lever met behulp van de mt-Keima transgene muizen, zoals afgebeeld in Figuur 3. Weefsels dan de hersenen en de lever hebben zijn geanalyseerd met behulp van de mt-Keima systeem14. Dual-excitatie verhouding imaging in lever weefsel wordt verkregen via twee opeenvolgende excitaties. Alle afbeeldingen moeten vers verwijderde organen worden verkregen. Weefsels onderzocht moeten zo snel mogelijk koud en verwerkte worden gehouden. Lever segmenten kunnen worden verkregen op elke leeftijd. Wanneer imaging mitophagy, optimaliseren laser bevoegdheden en blootstelling tijden voor elk orgel tijdens de microscopische analyse. Laser macht moet worden vastgesteld op het laagste uitgang waarmee duidelijk visualisatie van de mt-Keima signaal14. Er zijn echter enkele beperkingen voor het mt-Keima transgene muizen. Als gevolg van de instabiliteit van de Keima evenals het verlies van een pH verloop over de lysosomale membraan onder fixatie is deze muismodel niet geschikt voor cryo-segmenteren en immunohistochemistry. Een andere beperking is dat mt-Keima of matrix aggregaten van dit eiwit, van invloed kunnen zijn op de onbekende mitochondriale of cellulaire functies, hoewel mitochondriale zuurstof verbruik tarief14het project niet gewijzigd. Bovendien, de tijd en kosten in verband met mt-Keima muizen, waardoor zij minder wenselijk dan de bovengenoemde celkweek en C. elegans methoden p.a. hoge gegevensdoorvoer. Naast de hier genoemde methoden, zijn andere manieren om te studeren kwantitatief mitophagy in mt-Keima muizen westelijke vlek of FACS. Om op te merken, naast de mt-Keima transgene muizen, er is een andere muismodel van de mitophagy, de "mito-QC", een transgeen muismodel met een pH-gevoelige fluorescerende mitochondriale signaal26. Als gevolg van de complexiteit en dynamiek van mitophagy, is het raadzaam de combinatie van de methoden van de bovengenoemde fluorescentie met andere gemeenschappelijke mitophagy detectiemethoden, zoals elektronenmicroscopie en westelijke bevlekken, ter versterking van de bevindingen.

De ontwikkeling van nieuwe mitophagy detectietechnieken zoals hier genoemde zal hebben brede toepassingen, gaande van mechanistische studies van mitophagy naar hoge-doorvoer drug schermen. Opgemerkt moet worden dat mitophagy wordt gemakkelijk beïnvloed door zowel endogene als exogene schommelingen (b.v., cel kweekomstandigheden zoals celdichtheid, honger, hypoxie, enz.) 1 , 5 , 8. Daarom is het essentieel dat de dezelfde proefomstandigheden worden gehandhaafd voor alle experimenten. Het is belangrijk om het gebruik van een combinatie van verschillende mitophagy detectiemethoden in zowel in vitro en in vivo studies om te controleren of de juiste interpretatie van de status van de mitophagy. Verder inzicht in de mechanismen van mitophagy, bereikt door middel van technieken die hierin, vermeld zal zorgen voor de ontwikkeling van nieuwe, nauwkeuriger methoden voor de detectie van de mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Het Bohr-laboratorium heeft CRADA regelingen met ChromaDex en GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Atsushi Miyawaki en Dr. Richard J. Youle voor het delen van de plasmide mt-Keima en mt-Keima geïntegreerd Hela cellen. Wij danken Raghavendra A. Shamanna en Dr Deborah L. Croteau voor de kritische lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale Research Program van de NIH (VAB), verlenen National Institute on vergrijzing, evenals een 2014-2015 en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EVF, VAB). EVF werd gesteund door HELSE SOR-OST RHF (Project No: 2017056) en het onderzoek Raad Noorwegen (Project No: 262175).

AUTEUR BIJDRAGEN:

EVF ontworpen het manuscript en het ontwerp; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH en ED schreef verschillende secties van het papier; NT, JP, HN en VAB herziene versie van het manuscript en voorzien van deskundigheid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar		 #CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16 (2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Tags

Geneeskunde kwestie 129 Mitophagy veroudering C. elegansmuis autophagy rosella ziekte van Alzheimer ziekte van Parkinson lange levensduur
<em>In Vitro</em> en <em>In Vivo</em> opsporing van Mitophagy in menselijke cellen,<em> C. Elegans</em>en muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., … More

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter