细胞色素 P450s 致癌亚硝胺的α-羟基化是公认的代谢途径, 产生 DNA 损伤的中间体, 导致突变。然而, 新的数据表明进一步的氧化 nitrosamides 可能发生。我们描述了一个一般的方法, 检测 nitrosamides 产生的体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢的亚硝胺。
N-亚硝胺是一种公认的环境致癌物质, 需要细胞色素 P450 氧化来表现活性。代谢活化机制包括自发分解为 DNA 烷剂的α-hydroxynitrosamines 的形成。DNA 损伤的积累和由此产生的突变最终会导致癌症。新的证据表明, α-hydroxynitrosamines 可以进一步氧化到 nitrosamides processively 细胞色素 P450s。因为 nitrosamides 一般比α-hydroxynitrosamines 更稳定, 也可以烷基化 DNA, nitrosamides 可能在癌变中起到作用。在本报告中, 我们描述了一个一般的协议, 评估 nitrosamide 生产从体外细胞色素 P450-catalyzed 代谢亚硝胺。该协议采用了一般的方法合成相关的 nitrosamides 和一个体外细胞色素 P450 代谢测定的液相色谱-nanospray 电离-高分辨率串联质谱检测。此方法在示例研究中检测到′-nitrosonorcotinine 作为′nitrosonornicotine 的次要代谢物。该方法具有较高的灵敏度和选择性, 是由于质量检测准确。该方法在多种硝细胞色素 P450 系统中的应用将有助于确定这种转化的普遍性。由于细胞色素 P450s 的多态性和活动性的变化, 更好地了解 nitrosamide 的形成有助于个别癌症风险评估。
N-亚硝胺是一种在饮食、烟草制品和一般环境中发现的大量致癌物质;它们也可以在人体内形成内1。超过 300 N-硝基化合物已经被测试和 #62; 90% 被评估了作为致癌物在动物模型2,3。为了展示它们的致癌性, 这些化合物必须首先激活细胞色素 P450s1,2,3。研究表明, 细胞色素 P450s 容易氧化亚硝胺为α-hydroxynitrosamines (图 1), 这是高度活性化合物与半衰期的〜 5 s 之前自发分解到 alkyldiazohydroxides。后者可以在丢失 H2O 和 N2之后烷基化 DNA。由此产生的 DNA 加, 如果未, 可以导致突变, 如果在关键的 onco 或抑癌基因, 导致癌症的发展1。因此, 为了充分了解细胞色素 P450 氧化致癌亚硝胺的代谢途径、DNA 加和下游代谢产物, 已经花费了大量的精力。这些知识在个人癌症风险评估中具有潜在的应用价值4。
图 1: 一般和建议的亚硝胺代谢。
亚硝胺 (1) 被 P450s 氧化为α-hydroxynitrosamines (2), 自发分解为 alkyldiazohydroxides (3)。这些化合物可以与 dna 结合形成 dna 加。假设2被 P450s 进一步氧化为 nitrosamides 4。这些可以直接绑定到 dna, 形成新的 dna 加或水解到3 , 形成已知的 dna 加。r1和 r2表示任何烷基组。请单击此处查看此图的较大版本.
虽然α-hydroxynitrosamine 假说得到了大量数据的坚实支持, 但也存在一些不一致之处。主要的一个是α-hydroxynitrosamines 的短半衰期5,6。众所周知, 这些化合物是在内质网膜和后来的烷基化核 DNA 中产生的。鉴于他们的生命的几秒钟, 这是令人费解的这些中间体如何生存所需的旅行, 虽然胞。一个假说是, α-hydroxynitrosamines 的一部分被 processively 氧化为 nitrosamides7,8, 在比较9中相当稳定。这可能会发生通过保留α-hydroxynitrosamines 在细胞色素 P450 活性部位。这种类型的氧化的先例已经看到与尼古丁10, 酒精的11, 和简单的 alkylnitrosamines12,13。另外, nitrosamides 是直接作用的致癌物质2,3。根据它们的反应性9, 这些化合物被认为产生的 dna 加与α-hydroxynitrosamines 和新的, 未经探索的 dna 加 (图 1) 的结果相同。因此, 这一假说不仅解释了通过胞的运输, 也说明了 DNA 损伤产物的形成。
本文介绍了一种用于评价亚硝胺的细胞色素 P450-mediated 转化为 nitrosamides 的体外的通用协议。先前报告的′-nitrosonornicotine (NNN) 转换为′-nitrosonorcotinine (NNC) 的细胞色素 P450 2A6 被展示为示例14。该协议在广泛的基质酶系统的应用将有助于确定 nitrosamides 在整体硝代谢中的重要性。
阐明亚硝胺的代谢是了解其致癌性的重要组成部分。由于涉及的细胞色素 P450s 和其他代谢酶是多态的, 进一步应用这一知识可能会发现高危个体1,4。新的数据表明, 进一步氧化α-hydroxynitrosamines, 推定主要代谢物的亚硝胺参与 DNA 结合, 以 nitrosamides 是可能的;然而, 这并没有在广泛的基板上进行强有力的测试。我们已经描述了一个协议来确定性氧化亚硝胺的…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了格兰特号的支持。CA-81301 来自国家癌症研究所我们感谢鲍勃的编辑协助, Dr. 彼得 Villalta 和鲁迅的质谱协助分析生物化学共享资源共济会癌症中心, 和 Dr. 亚当 t. Zarth 和 Dr. 安娜 k. 米歇尔的宝贵讨论和输入。分析生物化学共享资源由国家癌症研究院癌症中心资助 CA-77598 部分支持
Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |