Summary
Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.
Abstract
N-nitrosaminas são um grupo bem estabelecido de agentes cancerígenos ambientais, que requerem a oxidação do citocromo P450 que apresentam atividade. O mecanismo aceito de activação metabólica envolve a formação de α-hydroxynitrosamines que decompõem espontaneamente para agentes de alquilação de DNA. Acúmulo de danos ao DNA e mutações resultantes, em última análise, pode levar ao câncer. Novas evidências indicam que α-hydroxynitrosamines pode ser ainda mais oxidado para nitrosamides processively pelo citocromo P450s. Porque nitrosamides são geralmente mais estáveis do que α-hydroxynitrosamines e pode também alquilação de DNA, nitrosamides pode desempenhar um papel na carcinogênese. Neste relatório, descrevemos um protocolo geral para avaliar a produção de nitrosamide em vitro citocromo P450-catalisada do metabolismo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza uma abordagem geral para a síntese da nitrosamides relevantes e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio utilizando espectrometria de massa em tandem de ionização de alta resolução da cromatografia líquida-nanospray para a deteção. Esse método detectado n'- nitrosonorcotinine como um metabólito menor de n- nitrosonornicotine no estudo de exemplo. O método tem alta sensibilidade e deteção de massa seletivamente devida à precisão. Aplicação deste método para uma grande variedade de sistemas de nitrosamina-citocromo P450 ajudará a determinar a generalidade desta transformação. Porque citocromo P450s são polimórficos e variar em atividade, uma melhor compreensão da formação de nitrosamide poderia ajudar na avaliação do risco individual de câncer.
Introduction
N-nitrosaminas são uma grande classe de substâncias cancerígenas encontradas na dieta, produtos do tabaco e o ambiente em geral; Eles também podem ser formados endogenamente no corpo humano1. Mais de 300 N -nitroso compostos foram testados e > 90% foram avaliados como sendo cancerígenos em animais modelos2,3. Para expor sua carcinogenicidade, estes compostos primeiro devem ser ativados pelo citocromo P450s1,2,3. A pesquisa mostra que citocromo P450s oxidar prontamente nitrosaminas para α-hydroxynitrosamines (Figura 1), que são compostos altamente reativos com meia-vida de 5 ~ s antes de decompor-se espontaneamente para alkyldiazohydroxides. Este último pode alkylate DNA após a perda de H2O e N2. O DNA resultante adutos, se sem conserto, pode causar mutações que, em caso de crítica onco - ou genes supressores de tumor, levam ao desenvolvimento de câncer1. Por este motivo, muito esforço tem sido dispendido para adquirir um completo entendimento das vias metabólicas, adutos de DNA e a jusante dos metabolitos de oxidação do citocromo P450 de nitrosaminas cancerígenas. Este conhecimento tem potencial aplicação de avaliação de risco de câncer individual4.
Figura 1: Geral e metabolismo proposto de nitrosaminas.
Nitrosaminas (1) são oxidadas por P450s para α-hydroxynitrosamines (2) que decompõem espontaneamente para alkyldiazohydroxides (3). Estes compostos podem ligar ao DNA para formar que adutos de DNA. Supor que 2 são mais oxidado P450s em nitrosamides 4. Estas diretamente podem vincular a DNA para formar o DNA romance adutos ou ser hidrolisado a 3 para formar que adutos de DNA conhecido. R1 e R2 representam qualquer grupo alquila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Embora a hipótese de α-hydroxynitrosamine é solidamente apoiada por dados abrangentes, existem algumas inconsistências; uma importante é a meia-vida curta de α-hydroxynitrosamines5,6. É conhecido que estes compostos são produzidos na membrana do retículo endoplasmático e posteriormente alquilação de DNA nuclear. Dado seu tempo de vida de alguns segundos, isso é intrigante como esses intermediários sobrevivem a viagem necessária embora o citosol. Uma hipótese é que uma parte da α-hydroxynitrosamines processively são oxidados nitrosamides7,8, que são bastante estáveis na comparação9. Isso provavelmente ocorrerá através de retenção do α-hydroxynitrosamines no sítio activo citocromo P450. Precedente para este tipo de oxidação tem sido visto com nicotina10, álcoois11e simples alkylnitrosamines12,13. Além disso, nitrosamides são agentes cancerígenos de acção directa2,3. Com base em sua reatividade9, estes compostos são acreditados produzir DNA adutos idênticos aos resultantes da α-hydroxynitrosamines, juntamente com o novo, inexplorado DNA adutos (Figura 1). Assim, esta hipótese explica não só o transporte através do citosol, mas também a formação de DNA danificar os produtos.
Neste trabalho, é descrito um protocolo geral para avaliar o em vitro citocromo P450 mediada por conversão de nitrosaminas para nitrosamides. A conversão anteriormente relatada de n- nitrosonornicotine (NNN) para n- nitrosonorcotinine (NNC) pelo citocromo P450 2A6 é mostrada como um exemplo14. Aplicação do presente protocolo para uma ampla gama de sistemas de enzima-substrato ajudará a determinar a importância de nitrosamides no metabolismo de nitrosamina global.
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Protocol
1. materiais e procedimentos gerais
- Synthesize NNN conforme descrito anteriormente 15. Obter norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneração de NADPH, amortecedor da reação de 0,5 x e todos os outros produtos químicos ou solventes de fontes comerciais em grau reagente.
- Espectro RMN de registro em um espectrômetro de 500 MHz. Produto químico relatório turnos como partes por milhão (ppm). Usar a picos de solventes residuais como referências internas para 1 H-NMR (7,26 ppm CDCl 3) e 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3).
Nota: Pico divisão utilizada as seguintes abreviações: s = singleto, d = dubleto, dd = dubleto de parelhas, dt = dubleto de trigêmeos, dq = dubleto de quartetos, ddd = dubleto de gibão de Parelhas e m = multiplet. - Realizar a espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) para compostos selecionados em um LTQ Orbitrap Velos e dados do relatório como m/z.
- Uso polygram pré-revestido placas de sílica gel TLC (40 mm x 80 mm, 0,2 mm de espessura) com indicador fluorescente de 254 nm para cromatografia de camada fina (TLC). Visualizar placas do TLC por irradiação de lâmpada UV.
- Realizar a cromatografia flash em um 60 Å, 70-150 malha sílica gel usando uma coluna de vidro de 1,5 x 15 cm.
2. Preparação de nitrosamide controle positivo (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- seco, em estufa durante a noite (16 h, ~ 140 ° C), um 25 mL, balão de fundo redondo contendo uma barra de agitação magnética. Pela manhã, fixe o balão sob um fluxo de N 2 enquanto estiver usando um borbulhador de óleo para manter o fluxo de 2 N taxa sob uma bolha por segundo.
Nota: Após o resfriamento, sem precauções para mantê-lo sob N 2 são necessárias. - Em uma coifa, adicionar norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), (5 mL) de anidrido acético e ácido acético (1 mL) no balão de refrigeração. Mexa essa mistura continuamente arrefecendo a 0 ° C, com um banho de água-gelo.
Atenção: Anidrido acético e ácido acético são corrosivos. - Adicionar NaNO 2 (33,3 mg, 0.483 mmol) em uma parcela e continuamente, agitar a mistura por 2,5 h. acompanhar os progressos reação do TLC (100% AcOEt, R f = 0,19, consulte a etapa 1.4).
Nota: Durante este tempo, a mistura se tornará cada vez mais amarela com subida ocasional. - Saciar a reação derramando a mistura em gelada H 2 O (18 mL). Extraia imediatamente a solução aquosa com 18 mL de CH 2 Cl 2 em um funil de separação de 100ml. Extrair a camada aquosa pelo menos 2 vezes adicionais com CH 2 Cl 2 (9 mL cada uma).
- Secar o organics em pool mais ~ 100 mg de MgSO 4 por 2 min. filtro e concentrar a solução por evaporação rotativa para produzir um óleo cru, amarelo. Aqueça o banho de água a 30 ° C durante a evaporação para remover o ácido acético residual.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui se o composto é dissolvido em CH 2 Cl 2 e a solução armazenada no escuro a 2-8 ° C. - Purificar o composto cru por cromatografia em coluna (ver passo 1.5) utilizando sílica gel como fase estacionária e 100% AcOEt como o eluente 16.
Atenção: NNC e nitrosamides relacionados devem ser manuseados com cuidado, como eles são considerados cancerígenos humanos. - Dissolver o composto puro no CDCl 3 e usar NMR (consulte a etapa 1.2) para confirmar a estrutura e determinar a molaridade desta solução 17. Armazene esta solução no escuro a 2-8 ° C até ser necessário.
Nota: Esta solução será usada como o controle positivo no ensaio em vitro (passo 3.5). Espectro RMN e mudanças químicas estão disponíveis nas informações de apoio. - Com uma solução NNC pura, confirmar a precisão pai massa e determinar massas de íon produto por infusão direta em um espectrômetro de massa de alta resolução (HRMS) sob parâmetros descritos nas etapas 1.3 e 4.3.
Nota: Massas de produto serão usadas para a detecção deste composto em vitro metabolismo ensaio (passo 4.3).
3. Uma nitrosamina-P450 em vitro incubação de exemplo
- remover P450 2A6 Baculosomes, sistema de regeneração-Vivid-NADPH e 10mm NADP + solução de estoque de um freezer-80 ° C e deixe-os descongelar no gelo. Uma vez descongelado, diluir o Baculosomes e o sistema de regeneração de NADPH-1:10 e 01:50, respectivamente, em um tubo único 1 mL com 0,5 reação X Buffer. Da mesma forma, adicionar 3 μL do NADP + solução de estoque para 97 μL de 0.5 X reação Buffer.
Nota: NADP + é sensível à luz. Manter essa solução protegida por seu recipiente de embrulho em papel de alumínio. Soluções de enzima são sensíveis aos ciclos de gelo-degelo; Este limite a não mais de 2 ciclos. Preparar alíquotas conforme necessário para futuras experiências. - Para cada incubação, adicionar 50 μL de solução de enzima (contendo 5 pmol P450) para um 1 mL do tubo contendo 40 μL de solução NNN 4 μM feitos com amortecedor da reação. Pre-incubar esta nova mistura por 2 min a 37 ° C, utilizando um banho de água e em seguida, adicionar 10 μL de solução diluída de NADP +. Incubar o sistema completo para 1 / 30 min a 37 ° C.
Nota: Usando intervalos de 5 min para tempos de incubação (por exemplo, 5, 10, 15 min, etc) irá fornecer um curso de tempo de formação suficiente do nitrosamide. - Após o tempo de incubação desejado, saciar pelo primeiro adicionando 10 μl de 3.0 N ZnSO 4 e em seguida 10 μL de 3.0 N Ba(OH) 2. Vórtice formarão a esta solução e um precipitado branco. Centrifugar a amostra a 8000 x g, durante 4 min para o precipitado de Pelotas.
Nota: O procedimento não deve pausar a este passo como os nitrosamides formados limitaram a estabilidade em soluções aquosas. Longas pausas podem resultar em falsos negativos. - Imediatamente pipetar o sobrenadante e analisar 2 μL por espectrometria de massa em tandem de alta resolução da nanoelectrospray-ionização positiva cromatografia líquida (LC-NSI +-HRMS/MS, passos 4,1-4,3).
- Para incubação do controle positivo, evaporar uma alíquota contendo 100 fmol de solução NNC sintetizada num tubo 1 mL sob um fluxo de N 2. Este frasco, adicione o sistema de enzima completa da etapa 3.2 e prossiga conforme descrito por etapas 3.3-3.4.
- Para incubação do controlo negativo, realizar o experimento como descritas (etapas 3,2-3,4), exceto a solução de substituir o 50 μL da enzima com 0.5 X amortecedor da reação.
4. Parâmetros de exemplo para a detecção de nitrosamide por LC-NSI +-HRMS/MS
- para o LC componente, aplicar o gradiente de várias etapa seguinte na etapa 4.2 para um sistema UPLC usando um comercial, mão-embalados 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, coluna capilar de orifício μm 15.
- Usando 5 mM NH 4 OAc como solvente A e MeCN como solvente B, carregar a amostra na coluna executando a 5% B em 1 µ l/min de 0 - 5 min e em seguida, diminuindo a taxa de fluxo para 0.3 μL/min depois. Em seguida, execute um gradiente de 5 a 20% B 4 min, seguido por uma rampa para 55% B mais de 10 min e então re-equilibração a 5% B.
- Executar o LC-NSI +-HRMS/MS em um LTQ Orbitrap. Monitor para NNC por varredura completa e fragmentação de 2 MS. Executar uma varredura completa em uma resolução de 60.000 e extrair a massa exata do pai (192.07670) para uma tolerância em massa de 5 ppm. Fragmentação de 2 MS de uso para isolar o pai íons (2,0 amu) e fragmento por induzida por colisão dissociação (CID) com uma energia de colisão de 25 eV, resolução de 15.000 e verificação de tempo de 30 ms. extrair as massas precisas para íons de produto da NNC (m/z 192 m/z 134.04739 e 162.07874) para uma tolerância em massa de 5ppm.
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Representative Results
Baseado no trabalho de branco et al. 19, norcotinine nitrosados para NNC foi limpa e de alto rendimento (80-92%) para produzir um padrão para o experimento em vitro . Evidências estruturais para uma bem sucedida reação foi obtida a partir de análises espectroscópicas, incluindo 1H-NMR, 13C-NMR, acolhedor e HSQC (informações de apoio), juntamente com o HRMS que confirmou a massa pai [M + H]+ dentro de 5 ppm do valor teórico (Figura 2). Fragmentação de2 MS de NNC foi usada para determinar as massas de íon produto mais abundantes. O íon de massa e produto de determinado pai precisos massas foram usadas no método do ensaio in vitro - HRMS/MS, LC-NSI+. Se armazenados no escuro a 2-8 ° C, a solução NNC é estável pelo menos 3 meses. Como se trata de uma reação muito geral, tem aplicação a qualquer amida de 2°.
Figura 2: HRMS e HRMS2 espectro do NNC.
A) massa de pai exata do NNC com tolerância de 5 ppm em massa: calculado: [M + H]+ = 192.07675, Found: 192.07670. B) MS2 fragmentação de m/z 192 com uma largura de isolamento de 2,0 amu. Os dois íons de produto mais abundantes são 134.04739 e 162.07875. Reproduzido com permissão da Chem. res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NNC sintetizado foi utilizado como padrão para o ensaio de metabolismo em vitro P450. Citocromo P450 2A6 foi usado porque é conhecido por ser um catalisador eficiente de NNN oxidação20. Da mesma forma, a concentração de NNN foi definida para 2 μM como calcula o Km para α-hidroxilação21. Nas condições cromatográficas descritas, NNC sintético elutes ~17.5 min com picos bem resolvidos em ambos o pai íon e íon produto canais. Em conformidade com o controle positivo, observou-se formação de NNC na incubação do 1, 5 e 10 min.
Figura 3: Cromatogramas de LC-NSI-HRMS resultantes da incubação do 2A6 de NNN-citocromo P450.
Para todas as seções, o cromatograma top é o pai preciso massa extraído de verificação completa para NNC. Os cromatogramas médio e inferior são duas massas de íon precisas dos produtos extraídas de fragmentação de2 MS para NNC. Seções são as seguintes: NNC padrão (A), NNC-citocromo P450 2A6 incubação do contendo todas as enzimas relevantes e cofactores com tempos de incubação de 1 min (B), (C) de 5 min e 10 min (D). RT = tempo de retenção; MA = massa área. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NNC níveis foram máximas em 5 min e diminuíram em pontos de tempo mais tarde. Níveis de quantificação relativa usando NNC sintética como um padrão estimado NNC máxima para ser 10 nM. No controle negativo falta o sistema P450, sem formação de NNC foi detectada (dados não mostrados), assim indicando conversão enzimática foi necessária. Juntos, este protocolo mostra evidência direta para a conversão de NNN NNC pelo P450 2A6, embora a extensão da formação é menor em comparação com α-hidroxilação de NNN.
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Discussion
Elucidação do metabolismo de nitrosaminas é um componente crítico para a compreensão de sua carcinogenicidade. Desde que os envolvidos citocromo P450s e outras enzimas metabólicas são polimórficas, mais aplicação deste conhecimento potencialmente poderia identificar indivíduos de alto risco1,4. Novos dados indica que mais oxidação do α-hydroxynitrosamines, os presumíveis principais metabolitos de nitrosaminas envolvidos na ligação de DNA, para nitrosamides é possíveis; no entanto, isto não foi verdadeiramente testado uma vasta gama de substratos. Descrevemos um protocolo para determinar a extensão da oxidação processive de nitrosaminas para nitrosamides em vitro. Ampla aplicação desse método ajudará a determinar a importância desta via de metabolismo.
O método inicia-se através da elaboração de uma norma para a nitrosamide de interesse. No estudo, exemplo é NNC, um metabólito hipotético de carcinógeno tabaco NNN, uma substância cancerígena encontrada no tabaco produtos14,22. Conforme descrito, nitrosation de norcotinine não houve problemas com nenhum produto de lado discernível. O produto bruto foi contaminado por apenas a partida amida e ácido acético, que foram facilmente removida por cromatografia em coluna. Isto foi seguido por confirmação da estrutura por NMR e HRMS. Uma vantagem deste método é que é apropriado para praticamente qualquer amida, que permite que vários sistemas de nitrosamina/nitrosamide a ser investigada. Além disso, o uso de NMR para quantificação dá uma medida direta da molaridade da solução-padrão17. Isso permite que o armazenamento do composto sob condições inertes ao invés de medição que requerem por técnicas destrutivas como HPLC de fase reversa. Então várias diluições podem ser feitas de acordo com o desenho do experimento.
Com um controle positivo e um padrão de fragmentação de massa bem caracterizadas, método altamente sensível e seletivo LC-NSI+- HRMS/MS permite a detecção de nitrosamides em uma matriz relativamente complexa. Como mostrado, o método estima-se uma concentração de NNC de 1-10 nM ou 2-20 fmol na coluna apesar de 1000-fold excesso de começando nitrosamina, enzimas e outros cofactores. A sensibilidade e seletividade do método são devido ao uso de massa de alta resolução, que falta de sistemas de LC-MS padrão de monitoramento. Seleção de íon do pai com uma tolerância de 5 ppm em massa garante que somente compostos com a fórmula molecular desejado estão isolados. Da mesma forma, detecção de massa precisa dos dois íons mais abundantes produto juntamente com o seu tempo de retenção dá uma confirmação adicional do analito. Devido a isso, o método de espectrometria de massa requer que muitos parâmetros são otimizados, incluindo largura de isolamento, energia e tempo de varredura. O gradiente de LC também pode ser modificado para melhorar a sensibilidade como co eluição com outras substâncias limitará enchendo a armadilha do íon com o nitrosamide destino.
No exemplo estudo14, formação NNC foi menor. Com base na área em massa, NNC foi ~ 4000-fold menos abundante do que os produtos hidrolisados de α-hydroxyNNN21. Embora isto indica que NNC é um metabólito muito menor de NNN, outros sistemas podem ser diferentes. Couto et al. Encontrei a oxidação considerável, processive de dimetilnitrosamina e diethylnitrosamine; no entanto, o intermediário nitrosamide era indetectável sob suas condições12. É possível que analisando seu sistema pela técnica descrita aqui poderia revelar a formação de nitrosamide. Independentemente do seu nível de formação, a maior estabilidade do nitrosamides em relação ao α-hydroxynitrosamines pode indicar que estes compostos têm importância biológica, como eles mais prontamente devem transportar a célula.
Embora este método será aplicável à maioria dos sistemas de nitrosamina-enzima, existem algumas limitações. O mais significativo é que o método não é quantitativo. No experimento de exemplo, estimou-se formação da área de pico de espectrometria de massa de uma amostra de controle positivo. Para uma medição mais precisa, poderia ser desenvolvido um método de diluição de isótopos utilizando um nitrosamide desvendar rotulado. Outra abordagem poderia ser implementar uma estratégia de captura com compostos tais como acetyllysine - Nou N- acetilcisteína, mas isso não teve sucesso até à data em nossas mãos,14.
Outra limitação é a tendência de nitrosamides para hidrolisar facilmente9; assim, as amostras devem ser processadas individualmente. Isso diminui o fluxo de trabalho e impede que as amostras serem enviados para colaboradores para análise. Por último, note-se que, apesar de citocromo P450 2A6 e muitos outros estão disponíveis comercialmente, alguns exigem expressão de proteínas e a purificação para obter. Por exemplo, este ensaio foi aplicado a citocromo P450 2A1314, mas só está disponível após um processo de isolamento rigoroso23.
Em resumo, descrevemos um protocolo para a detecção de nitrosamides resultantes citocromo P450 catalisada por oxidação de nitrosaminas em vitro. O protocolo inclui uma síntese geral para um padrão de nitrosamide como um controle positivo e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio usando LC-NSI+- HRMS/MS para a deteção. O estudo de exemplo, NNC foi detectada na incubação de todos os tempos que variam de 1-10 min, mas apenas como um metabólito menor de NNN. Aplicação do presente protocolo para outras nitrosaminas avaliará sua generalidade e o papel potencial dos nitrosamides na carcinogénese nitrosamina.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por grant não. 81301-CA do Instituto Nacional do câncer. Agradecemos a Bob Carlson para assistência editorial, Dr. Peter Villalta Xun Ming para assistência de espectrometria de massa no recurso de compartilhado de bioquímica analítica do centro de câncer maçônico e Dr. Adam T. Zarth e Dr. Anna K. Michel por suas valiosas discussões e de entrada. O recurso de compartilhado de bioquímica analítica parcialmente financiado pela National câncer Instituto câncer centro suporte Grant CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
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