Summary
Α-prokollajen sitokrom P450s tarafından kanserojen nitrozaminler ve mutasyonlar neden DNA-zarar intermediates üretir kabul edilen metabolik yoludur. Ancak, yeni verileri daha fazla nitrosamides oksidasyon oluşabilir gösterir. Biz genel bir tarif yöntemi nitrosamides tespit için üretilen vitro sitokrom P450 katalize metabolizması nitrozaminler.
Abstract
N-nitrozamin aktivite sergilemek sitokrom P450 oksidasyon gerektiren çevre kanserojen iyi kurulmuş bir grup vardır. Metabolik aktivasyon kabul edilen mekanizması oluşumu kendiliğinden DNA etmen acentelere ayrıştırmak α-hydroxynitrosamines içerir. DNA hasarı ve elde edilen mutasyonlar birikimi sonuçta kansere yol açabilir. Yeni kanıtlar α-hydroxynitrosamines daha fazla nitrosamides için processively sitokrom P450s tarafından okside olduğunu gösterir. Nitrosamides genellikle daha α-hydroxynitrosamines daha kararlı ve ayrıca DNA alkylate çünkü nitrosamides karsinojenezis içinde bir rol oynayabilir. Bu raporda, vitro sitokrom P450 katalize metabolizma üzerinden nitrosamide üretimini nitrozaminler değerlendirmek için genel bir iletişim kuralı açıklar. Bu iletişim kuralı ilgili nitrosamides ve algılama için sıvı Kromatografi-nanospray iyonlaşma-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi kullanılarak bir vitro sitokrom P450 metabolizma tahlil sentezi için genel bir yaklaşım kullanır. Bu yöntem N′- nitrosonorcotinine N′- nitrosonornicotine örnek çalışma küçük bir metaboliti olarak algılandı. Yüksek hassasiyet ve seçmeli olarak nedeniyle doğru kitle algılama yöntemi vardır. Bu yöntemin uygulama çok çeşitli nitrosamine sitokrom P450 sistemleri için bu dönüşüm genelliği belirlemenize yardımcı olur. Sitokrom P450s Polimorfik ve etkinliğini değişir çünkü nitrosamide oluşumu daha iyi bir anlayış içinde bireysel kanser risk değerlendirmesi yardımı olabilir.
Introduction
N-nitrozamin çoğu diyet, tütün ürünleri ve genel çevre; bulunan kanserojen büyük bir sınıf Onlar da endogenously insan vücudu1' oluşturulması mümkündür. 300'den fazla N -nitrozo bileşikler test ettik ve > % 90 gibi kanserojen olarak değerlendirilmiştir hayvan modelleri2,3. Onların carcinogenicity sergilemek, bu bileşiklerin tarafından sitokrom P450s1,2,3etkinleştirilmesi gerekir. Araştırma gösterir o sitokrom P450s kolayca okside nitrozaminler için α-hydroxynitrosamines (Resim 1), yarı-ömrü ~ 5 olan büyük ölçüde reaktif bileşikleri olan s kendiliğinden alkyldiazohydroxides için çürümeye başladı önce. İkinci DNA H2O ve N2kaybettikten sonra alkylate. Elde edilen DNA adducts, eğer unrepaired, kritik onko - veya Tümör baskılayıcı genler, Eğer kanser geliştirme1' e kurşun mutasyonlar neden olabilir. Bu nedenle, çok çaba metabolik yollar tam bir anlayış kazanmak için harcanan, DNA adducts ve sitokrom P450 oksidasyon kanserojen nitrozaminler ve aşağı akım metabolitleri. Bu bilgi bireysel kanser risk değerlendirme4' te potansiyel uygulama var.
Resim 1: Genel ve önerilen metabolizması nitrozaminler.
Nitrozaminler (1) P450s tarafından α-hydroxynitrosamines (2) bu kendiliğinden alkyldiazohydroxides (3) ayrıştırmak için okside. Bu bileşikler DNA için DNA adducts forma bağlayabilirsiniz. Bu onaylanmadığına karar o 2 daha fazla nitrosamides 4' e P450s tarafından okside. Bunlar doğrudan DNA için roman DNA adducts veya 3 bilinen DNA adducts forma hidrolize formu bağlayabilirsiniz. R1 ve R2 herhangi bir alkil grubu temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
α-hydroxynitrosamine hipotez sağlam geniş kapsamlı veriler tarafından desteklenir, ancak bazı tutarsızlıklar vardır; α-hydroxynitrosamines5,6kısa yarılanma büyük olanıdır. Bu bileşikler endoplazmik retikulum membran üretilir ve daha sonra nükleer DNA alkylate bilinir. Ömürleri birkaç saniyelik göz önüne alındığında, bu nasıl bu ara ürün gerekli seyahat gerçi sitozol hayatta şaşırtıcı. α-hydroxynitrosamines bir kısmını processively okside olduğunu nitrosamides7,8' e, hangi karşılaştırma9' oldukça istikrarlı bir hipotezdir. Bu muhtemelen α-hydroxynitrosamines sitokrom P450 etkin sitedeki tutma ile oluşacak. Bu tür bir oksidasyon için emsal nikotin10, alkoller11ve basit alkylnitrosamines12,13ile görülmüştür. Ayrıca, doğrudan etkili kanserojen2,3nitrosamides bulunmaktadır. Onların reaktivite9tarihinde dayanarak, bu bileşiklerin inanılıyor DNA üretmek için kullanılanlarla aynı α-hydroxynitrosamines ile birlikte yeni kaynaklanan adducts, keşfedilmemiş DNA (şekil 1) adducts. Böylece, bu hipotez sadece sitozol yoluyla ulaşım açıklar, ama Ayrıca DNA oluşumu zarar ürünleri.
Bu yazıda, vitro sitokrom P450-aracılı dönüşüm nitrozaminler nitrosamides değerlendirmek için genel bir protokol açıklanmıştır. N′- nitrosonorcotinine (NNC) sitokrom P450 2A6 tarafından N′- nitrosonornicotine (NNN) daha önce raporlanmış dönüşüm bir örnek14olarak sergiledi. Bu protokolün uygulamaya substrat enzim sistemleri geniş bir nitrosamides genel nitrosamine metabolizması önemini belirlemenize yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. malzeme ve genel yordamları
- Synthesize NNN daha önce açıklandığı gibi 15. Norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH rejenerasyon sistemi, 0.5 x reaksiyon tampon ve diğer kimyasal maddeler elde etmek veya reaktif sınıfta ticari kaynaklardan gelen solventler.
- Kayıt NMR spectra bir 500 MHz Spektrometre üzerinde. Rapor kimyasal vardiya başına parçaları olarak milyon (ppm). İç başvuru (7,26 ppm CDCl 3) için 1 H-NMR ve 13 C-NMR (77.2 ppm CDCl 3) kalan solvent doruklarına kullanın.
Not: Tepe bölme kullanılan aşağıdaki kısaltmalar: s singlet, d = eş, dd = eş birini, dt = üçüz, dq gelir = dörtlüsü, ddd gelir = kütleye kütleye birini ve m = multiplet =. - Bir LTQ Orbitrap Velos ve rapor verilerini m/z olarak seçilen bileşikler için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) gerçekleştirmek.
- Kullanım polygram silika jel TLC tabak (40 mm x 80 mm, 0.2 mm kalınlığında) ince katmanlı Kromatografi (TLC) 254 nm floresan göstergesi ön kaplamalı. TLC plakaları UV lamba ışınlama tarafından görselleştirmek.
- Flash Kromatografi bir 60 Å, 70-150 mesh silika jel 1,5 cm x 15 cm cam sütun kullanarak gerçekleştirmek.
2. Nitrosamide olumlu denetim hazırlanması (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- kuru, bir fırın gecede (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL yuvarlak alt şişesi manyetik heyecan çubuğunu içeren. Sabah, serin altında N 2 akışı tutmak için bir petrol bubbler kullanırken bir akış N 2 şişeye oranı saniyede bir kabarcık.
Not: soğutma sonra şişeye N 2 altında tutmak için hiçbir önlem gereklidir. - Bir duman başlık, soğutmalı şişeye norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), asetik anhidrit (5 mL) ve Asetik asit (1 mL) ekleyin. 0 ° C su buz banyosu ile soğutma sırasında sürekli olarak bu karışımı ilave edin.
Uyarı: Asetik anhidrit ve Asetik asit aşındırıcı. - NaNO eklemek 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) bir bölümünü ve sürekli olarak 2.5 h. TLC tarafından tepki ilerlemeyi izleme için karışımı ilave edin (%100 EtOAc, R f = 0,19, bkz: adım 1.4).
Not: Bu zaman içinde karışım ara sıra köpüren ile giderek sarı olacak. - Buz gibi H 2 O içine karışımı (18 mL) dökerek tepki gidermek. Hemen 18 mL CH 2 Cl 2 100 mL HCI'yi huni ile sulu çözüm ayıklayın. CH 2 Cl 2 (9 her mL) ile en az 2 ek kez sulu katman ayıklamak.
- Üzerinde ~ 100 mg MgSO 4 2 dk. filtre için havuza alınan Organik Kuru ve çözüm tarafından döner buharlaşma-ham, sarı yağ verimi için konsantre. Su banyosu ile 30 ° C arasında kalan Asetik asit kaldırmak için buharlaşma sırasında ısı.
Not: bileşik CH 2 Cl 2 ve 2-8 ° c karanlıkta saklanan çözüm içinde çözünmüş Eğer protokol burada duraklatılmış - Arındırmak ham bileşik sütun Kromatografi tarafından (bkz. Adım 1.5) durağan faz ve % 100 silika jel kullanarak EtOAc olarak eluent 16.
Uyarı: NNC ve ilgili nitrosamides ele alınabilir özenle insan kanserojen olarak kabul edilir gibi. - CDCl 3 ' te saf bileşik dağıtılması ve NMR kullanın (bkz. Adım 1.2) yapısı onaylamak ve bu çözüm 17 Derişim belirlemek için. 2-8 ° C'de gerekinceye kadar karanlıkta bu çözüm mağaza.
Not: Bu çözüm olumlu denetim vitro tahlil (Adım 3.5) olarak kullanılır. NMR spectra ve kimyasal vardiya destek bilgileri mevcuttur. - Saf NNC çözümle, doğru onaylamak üst kitle ve ürün iyon kitleler tarafından yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre (HRMS) üzerinde doğrudan infüzyon 1.3 ve 4.3 adımlarda açıklanan parametreleri altında belirlemek.
Not: Ürün kitleler vitro metabolizma tahlil (Adım 4.3) bu bileşik algılamak için kullanılan.
3. Bir örnek nitrosamine P450 vitro kuluçka
- -80 ° C dondurucudan P450 2A6 Baculosomes, canlı-NADPH-rejenerasyon sistemi ve 10 mM NADP + hisse senedi çözüm kaldırmak ve onları buza çözülme izin. Bir kez çözdürülen, Baculosomes ve NADPH rejenerasyon sistem 1 seyreltik: 10 ve 1:50, sırasıyla, bir tek 1 mL tüp ile 0.5 X reaksiyon arabellek içine. Benzer şekilde, reaksiyon arabellek X + hisse senedi çözüm 0,5 97 μL NADP 3 μL ekleyin.
Not: NADP + ışığa duyarlı olduğunu. Bu çözüm kapsayıcısının alüminyum folyo sarma tarafından korunan tutmak. Enzim çözümleri için donma-çözülme çevrimleri duyarlıdır; Bu fazla 2 geçer sınırlayın. Aliquots gelecekteki deneyler için gerektiği gibi hazırlayın. - (5 pmol P450 içeren) enzim çözüm 1 ml 50 μL tüp tepki arabellek ile yapılan 4 mikron NNN çözüm içeren 40 μL her kuluçka için ekleyin. Bu yeni karışım bir su banyosu kullanarak 37 ° C'de 2 min için önceden kuluçkaya ve 10 μL seyreltilmiş NADP + çözüm ekleyin. 1-30 dk 37 için tam sistem kuluçkaya ° C.
Not: 5 dk aralıklarla kullanarak kuluçka kez için (örneğin 5, 10, 15 dk, vb) bir yeterli nitrosamide oluşumu saat ders verecek. - İlk ekleyerek 10 μl 3.0 N ZnSO 4 ve 3.0 N Ba(OH) sonra 10 μL tarafından istenen kuluçka süre sonra susuzluğumu 2. Girdap bu çözüm ve beyaz çökelti oluşturacak. 8000 x g çökelti cips için 4 dakika için de örnek santrifüj kapasitesi.
Not: kurulan nitrosamides sulu çözümler istikrardır sınırlı olarak prosedür bu adımda duraklatmak gerekir değil. Uzun duraklar içinde yanlış negatif neden olabilir. - Hemen süpernatant pipette ve 2 μL sıvı Kromatografi olumlu nanoelectrospray-iyonizasyon yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi tarafından analiz (LC-NSI +-HRMS/MS, adımlar 4.1-4.3).
- Altında N akışı 2 1 mL tüp içine sentezlenmiş NNC çözeltinin 100 fmol içeren bir aliquot pozitif kontrol incubations için buharlaşır. Bu şişe için tam enzim sistemi 3.2 adımından ekleyin ve adımları 3.3-3.4 açıklandığı gibi devam edin.
- Negatif kontrol incubations için deneme açıklanan (adımları 3.2-3,4) Değiştir 50 μL enzim reaksiyon arabellek X 0.5 Çözümle dışında gerçekleştirin.
4. Örnek parametreleri LC-NSI + tarafından nitrosamide algılama için-HRMS/MS
- için LC bileşeni, bir ticari, el-Paketli 18 C18 kullanarak UPLC sisteme adım 4.2 aşağıdaki Multi-step degrade uygulayın (5 mikron), 100 mm x 75 mikron, 15 μm kalınlığında orifis kapiller sütun.
- Kullanarak 5 mM NH 4 OAc çözelti A ve çözücü B olarak MeCN olarak %5 B 1 μL/dk çalıştırarak örnek sütuna yükleme 0 - 5 min ve debisi 0,3 μL/dk sonra yavaşlama. Ardından, bir degrade üzerinde 4 dk ardından rampa %55 B 10 dk ve o zaman yeniden denge için % 5, % 20'si B 5 çalıştırın B.
- Gerçekleştirmek LC-NSI +-HRMS/MS LTQ Orbitrap üzerinde. Tam tarama ve MS 2 parçalanma monitör NNC için. 60.000 çözünürlükte tam tarama gerçekleştirmek ve bir kitle toleransı 5 ppm doğru üst kitle (192.07670) ayıklayın. Çarpışma kaynaklı ayrılma 25 ev, 15.000, çözünürlük tarafından (CID) bir çarpışma enerjisi ile üst iyonları (2.0 amu) ve parçası yalıtmak ve 30 Bayan zaman inceden inceye gözden geçirmek için kullanım MS 2 parçalanma NNC (m/z doğru kitlelerin ürün iyonları için ayıklamak 192 m/z 134.04739 ve 162.07874) adlı bir kitle hoşgörü 5 PPM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyaz ve arkçalışmasına dayanmaktadır. 19, norcotinine nitrosated NNC için temiz bir şekilde ve yüksek verim (% 80-92) vitro deney için bir standart üretmek oldu. Başarılı bir tepki için yapısal kanıt spektroskopik 1H-NMR, 13C-NMR, rahat ve HSQC (destek bilgileri) ile birlikte üst kitle [M + H] teyit HRMS gibi analizler üzerinden elde edilen+ 5 ppm içinde Teorik değeri (Şekil 2). MS2 parçalanma NNC en bol ürün iyon kitleler belirlemek için kullanıldı. Kararlı doğru ana kütle ve ürün iyon kitleler içinde vitro tahlil LC-NSI+- HRMS/MS yöntemi kullanılmıştır. 2-8 ° C'de karanlıkta saklanan, NNC en az 3 ay süreyle istikrarlı çözümdür. Bu çok genel bir tepki olarak, herhangi bir 2 ° Amid uygulamaya sahiptir.
Resim 2: HRMS ve HRMS NNC2 spektrum.
A) 5 ppm kitle toleransları ile NNC doğru üst kütlesi: hesaplanan: [M + H]+ = 192.07675, Found: 192.07670. B) MS2 parçalanma m/z 192 2.0 amu yalıtım uzunluğuna sahip. İki en bol ürün iyonları 134.04739 ve 162.07875 vardır. Kimyasalları fotoğraf çözünürlüğü Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205 izni ile yayımlanmaktadır. Telif hakkı 2016 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Sentezlenmiş NNC vitro P450 metabolizma tahlil standart olarak kullanılmıştır. NNN oksidasyon20etkili bir katalizör olarak bilindiğinden sitokrom P450 2A6 kullanıldı. Aynı şekilde, α-prokollajen21Km yaklasik olarak NNN konsantrasyon için 2 mikron kuruldu. Açıklanan Kromatografik koşullar altında sentetik NNC kanalları ~17.5 dk üst iyon ve ürün iyon de çözümlenmiş zirveleri ile elutes. Pozitif kontrol uygun olarak, 1, 5 ve 10 dk incubations NNC oluşumu belirtilmişti.
Şekil 3: NNN-sitokrom P450 2A6 incubations kaynaklanan LC-NSI-HRMS chromatograms.
Tüm bölümler için en iyi Kromatografik kitle NNC için tam tarama elde doğru üstüdür. Orta ve alt chromatograms MS2 parçalanma NNC için çıkarılan iki doğru ürün iyon işçiyiz. Bölümler şunlardır: NNC standart (A), tüm ilgili enzimler ve Kofaktörler kuluçka kez 1 dk (B), 5 dk (C) ve 10 dk (D) içeren NNC sitokrom P450 2A6 incubations. RT = saklama süresi; MA = kütle alanı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
NNC düzeyleri 5 dk maksimal ve daha sonra zaman noktalarda azalmıştır. Bir standart maksimum NNC tahmini gibi sentetik NNC kullanarak göreli Nefelometri düzeyleri 10 nM. P450 sistemi eksik negatif kontrol yok NNC oluşumu (algılanan verileri gösterilmez), böylece gösteren enzimatik dönüşüm gerekli oldu. Birlikte, bu iletişim kuralı tarafından P450 2A6, NNC NNN dönüştürülmesi için doğrudan kanıt gösterir oluşumu ölçüde küçük olmasına rağmen α-prokollajen NNN karşılaştırıldığında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nitrozaminler metabolizma elucidating onların carcinogenicity anlamak için önemli bir bileşenidir. Daha fazla yer sitokrom P450s ve diğer Metabolik enzimler Polimorfik olduğundan, bu bilginin uygulaması potansiyel olarak yüksek riskli bireyler1,4teşhis edebilir. Yeni veri α-hydroxynitrosamines, nitrozaminler DNA bağlamasında dahil tahmin ediliyor büyük metabolitleri daha fazla o oksidasyonunu gösterir, nitrosamides için mümkündür; Ancak, bu sağlam çok çeşitli yüzeyler üzerinde test edilmemiştir. Nitrosamides içinde vitronitrozaminler ilerleyicidir oksidasyonunu kapsamını belirlemek için bir iletişim kuralı anlatmıştık. Bu yöntemin geniş uygulama genel önem metabolizması bu rotanın belirlemenize yardımcı olur.
Yöntem faiz nitrosamide için bir standart hazırlayarak başlar. Örnek çalışmada, NNC, tütün kanserojen NNN, tütün ürünleri14,22yılında bulunan bir kanserojen hypothesized bir metaboliti öyle. Açıklandığı gibi norcotinine nitrosation hiçbir discernable yan ürünleri ile sorunsuz devam etti. Ham ürün yalnızca başlangıç Amid ve Asetik asit, hangi kolayca sütun Kromatografi tarafından çıkarıldı tarafından kontamine. Bu onay NMR ve HRMS yapısının izledi. Bu yöntemin yararı araştırılması birden fazla nitrosamine/nitrosamide sistemi sağlar neredeyse tüm Amid için uygun olmasıdır. Ayrıca, NMR kullanımı Nefelometri için Derişim standart çözüm17için doğrudan bir ölçü verir. Bu ters fazlı HPLC gibi yıkıcı teknikleri tarafından gerektiren ölçü yerine etkisiz koşullar altında bileşik depolanmasını sağlar. Daha sonra çeşitli dilutions deney tasarımı uygun hale getirilebilir.
Olumlu bir kontrol ve bir de karakterize kitle parçalanma desen ile son derece hassas ve seçici LC-NSI+- HRMS/MS yöntemi nitrosamides oldukça karmaşık bir matris olarak algılanmasını sağlar. Görüldüğü gibi yöntem 1-10 nM veya 2-20 fmol üzerinde sütun nitrosamine, enzim ve diğer Kofaktörler başlayan 1000-fold aşırı rağmen bir NNC konsantrasyon tahmin. Duyarlılık ve seçicilik yönteminin kontrolü, hangi standart LC-MS sistemleri eksikliği yüksek çözünürlüklü kitle kullanımı nedeniyle vardır. Üst iyon seçimi 5 ppm kitle hoşgörü ile sadece bileşikler istenilen moleküler formülü ile yalıtılmış olmasını sağlar. Aynı şekilde, iki en bol ürün iyonlar ile birlikte onların tutma zamanı doğru kitle algılama ek analit onay verir. Bu nedenle, kütle spektrometresi yöntemi birçok parametre yalıtım genişliği, çarpışma enerji ve inceden inceye gözden geçirmek zaman da dahil olmak üzere optimize edilmiş gerektirir. LC degrade de diğer maddeler ile ortak elüsyon iyon kapanı ile hedef nitrosamide dolum sınırı olacaktır duyarlılık geliştirmek için değiştirilebilir.
Örnek çalışma14' te, NNC oluşumu küçük. Kitle alana dayalı, NNC oldu ~ α-hydroxyNNN21hydrolyzed ürünlere göre 4000-fold daha az bol. Bu çok küçük bir metaboliti NNN, NNC olduğunu gösterir rağmen diğer sistemleri farklı olabilir. Chowdhury ve ark. önemli, ilerleyicidir oksidasyon nitrozamin ve diethylnitrosamine bulundu; Ancak, nitrosamide orta altında onların koşulları12tespit edilemez. Bu onların sistem burada açıklanan tekniği ile yeniden çözümleniyor nitrosamide oluşumu açığa olabilir mümkündür. Onların oluşumu düzeyi ne olursa olsun, bu bileşiklerin daha kolay hücreyi taşıma biyolojik önemi var nitrosamides α-hydroxynitrosamines için karşılaştırıldığında daha yüksek kararlılık gösterebilir.
Bu yöntem çoğu nitrosamine-enzim sistemleri geçerli olsa, bazı sınırlamalar vardır. Yöntemi kantitatif değil en önemli olanıdır. Örnek deneyde oluşumu pozitif denetimi örneğini kitle spektrometrik tepe alanından tahmin edilmiştir. Daha doğru bir ölçüm için bir isotopically etiketli nitrosamide kullanan bir izotop seyreltme yöntemi geliştirilebilir. Başka bir yaklaşım ile bileşikler N- acetyllysine veya N- acetylcysteine, gibi bir bindirme strateji uygulamak ama bu tarih bizim eller14için başarısız oldu.
Nitrosamides kolayca9hidrolize eğilimi başka bir kısıtlamadır; Böylece örnekleri ayrı ayrı işlenmesi gerekir. Bu iş akışını yavaşlatır ve örnekleri analiz için ortak çalışanlar için gönderilmesini engeller. Son olarak, sitokrom P450 2A6 ve diğer pek çok ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bazı protein ifade ve elde etmek için arıtma gerektiren unutulmamalıdır. Örneğin, bu tahlil sitokrom P450 2A1314uygulandı, ancak sonra sıkı yalıtım işlem23yalnızca kullanılabilir.
Özetle, sitokrom P450 katalize oksidasyonunu nitrozaminler içinde vitrokaynaklanan nitrosamides saptamak için bir protokol anlatmıştık. Protokol genel bir sentezi olarak olumlu bir denetim ve LC-NSI+- HRMS/MS için algılama kullanarak bir vitro sitokrom P450 metabolizma tahlil standart bir nitrosamide için içerir. Örnek çalışmada, NNC, 1-10 dk, ancak yalnızca olarak NNN küçük bir metaboliti arasında değişen kez tüm kuluçka algılandı. Bu protokolün uygulamaya diğer nitrozaminler onun genelliği ve nitrosamine karsinojenezis nitrosamides potansiyel rolü değerlendirecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada grant tarafından desteklenen yok. CA-81301 Ulusal Kanser Enstitüsü'nden. Biz Bob Carlson Editör Yardım almak için Dr Peter Villalta ve Xun Ming için analitik Biyokimya paylaşılan kaynak Masonik Kanser Merkezi kütle spektrometresi yardım ve Dr Adam T. Zarth ve Dr Anna K. Michel onların değerli tartışmalar için teşekkür ederim ve giriş. Analitik Biyokimya paylaşılan kaynak kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi destek hibe CA-77598 tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
