Summary
Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.
Abstract
Änderungen im intrazellulären pH (pHi) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der viele zelluläre Funktionen, einschließlich Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung. In der Regel sind pHi Dynamik in kultivierten Zellen bestimmt, die Mess- und experimentell manipuliert pHi zugänglich sind. Allerdings machte es die jüngste Entwicklung von neuen Instrumenten und Methoden möglich, pHi Dynamiken intakt, live Gewebe zu studieren. Für die Drosophila -Forschung, eine wichtige Entwicklung war die Erzeugung einer transgenen Linie tragen eines Biosensors pHi mCherry::pHluorin. Hier beschreiben wir eine Protokoll, mit denen wir routinemäßig für bildgebende live Drosophila Ovariolen pHi in der epithelialen Follikel Stammzellen (FSC) Linie in mCherry::pHluorin transgenen Wildtyp-Linien zu messen; die hier beschriebenen Methoden kann jedoch für andere Gewebe, einschließlich der Flügel Scheiben und Auge Epithel leicht angepasst. Wir beschreiben Techniken für den Ausdruck von mCherry::pHluorin in der FSC-Linie die Aufrechterhaltung Eierstockgewebe während live imaging und Erwerb und Analyse von Bildern um pHi Werte zu erhalten.
Introduction
Neuere Studien gezeigt eine Rolle für Änderungen in pHi während zelluläre Differenzierung und Dysplasie in Vivo1,2. Diese Studien herausgefunden, dass pHi bemerkenswert konsistent in den Zellen des gleichen Typs auf der gleichen Stufe der Differenzierung, ist aber, dass es ändert als Übergang von einer Stufe zur anderen Zellen. In einigen Fällen stört die Änderungen in pHi teilweise Sperrung Differenzierung, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der pHi nicht nur eine Folge von Veränderungen der Zelle Schicksal ist aber stattdessen hilft, die Veränderung der Zelle Schicksal, vielleicht durch Einfluß auf pH-Sensitive regulatorischen zu fördern Proteine oder chemische Reaktionen zur Differenzierung erforderlich. Zukünftige Studien haben das Potenzial, einen tieferen Einblick in die vielen verschiedenen Rollen der pHi Dynamik in Vivozu offenbaren. Jedoch ist eine der Herausforderungen des Studiums pHi während der Differenzierung in Vivo genaue Messungen der pHi erhalten. Im Gegensatz zu anderen Funktionen der Differenzierung, wie Veränderungen in der zellulären Morphologie und Genexpression ist pHi eine labile chemische Eigenschaft der Zelle, die nicht in den Zellen, die wurden behoben, und permeabilized mit Standardmethoden bewahrt wird. Darüber hinaus möglicherweise pHi nicht stabil in Zellen, die gestresst sind oder sterben durch experimentelle Manipulation. Daher ist es wichtig, die Zellen lebendig und so gesund wie möglich zu halten, bei der Messung von pHi. Mehrere wichtige Farbstoffe zur Verfügung, die funktionieren gut für Messung der pHi der Zellen in Kultur3, aber in vielen Fällen sie eignen sich nicht für in Vivo Studien, weil sie das Gewebe nicht tief oder gleichmäßig eindringen, genaue Messungen zu machen .
Um das Problem der schlechten Farbstoff Penetration zu umgehen, haben wir u.a. eine genetisch codierte Sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, verwendet, die speziell in der Zelle ausgedrückt werden kann Arten von Interesse und abgebildeten in lebender Gewebe. pHluorin ist eine Variante der GFP mit einer höheren pKa (~ 7,0 vs. ~ 4.0), die Falten leichter bei höheren pH-Werten; so steigt der gesamten Fluoreszenzintensität emittiert bei einer Bevölkerung von pHluorin Moleküle in der Zelle mit zunehmender pHi8. Fluoreszenz ist linear innerhalb der normalen cytosolischen Wertebereich pHi. Im Gegensatz dazu die Fluoreszenz des mCherry (pKa ~ 4.5) ist unempfindlich gegen pH-Veränderungen innerhalb der cytosolischen. Diese zwei Reporter sind kovalent miteinander als ein chimäres Protein, durch einen einzigen offenen Leserahmen codiert, so dass sie immer in gleichen Mengen vorhanden sind. Daher stellt das Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenzintensität eine Messung des pHi, die auf die Sonde Konzentration in jeder Zelle normalisiert ist. Die Verhältnisse können dann Schätzungen von pHi-Werten mit einer Standardkurve, die generiert wird, durch den Erwerb der pHluorin mCherry-Verhältnisse von Geweben, die auf bekannten pH-Werte equilibriert wurde umgewandelt werden.
Hier beschreiben wir die Methoden für die Verwendung von mCherry::pHluorin, um die pHi der epithelialen FSC-Linie im Drosophila Eierstock zu messen. Dieses gut charakterisierten Gewebe wurde verwendet, um viele verschiedene Aspekte der epithelialen Biologie, wie z. B. Stammzell-Selbsterneuerung und Differenzierung9,10,11, kollektive Zellmigration12 Modell , Entwicklung und Wartung von Zelle Polarität13,14. Die Follikel Epithel wird durch zwei FSCs produziert, die am vorderen Rand des Gewebes in einer Struktur namens Germarium15,16befinden. Diese Zellen teilen sich regelmäßig im Erwachsenenalter selbst zu erneuern und produzieren nachkommen, genannt prefollicle Zellen (PFC), die entweder geben Sie die Nische und ein FSC werden oder in eine der drei verschiedenen Follikel Zelltypen differenzieren: polare Zellen, Stiel Zellen oder Hauptkörper Follikelzellen. Wir zeigten, dass zuvor in Wildtyp-Gewebe, die pHi steigt stetig in den frühen Phasen der Differenzierung von pHi von ca. 6,8 in FSCs 7.0 im PFC, auf 7,3 im Follikel Zellen2. Blockieren diese Erhöhung durch RNAi Knockdown von ein ubiquitär ausgedrückt Natrium/Proton-Wärmetauscher, DNhe2, stark beeinträchtigt pFC Differenzierung, während pHi steigt durch Überexpression des DNhe2 bewirkt eine milde überschüssige Differenzierung Phänotyp. Diese Ergebnisse belegen, dass pHi bleibt stabil in der frühen FSC-Linie, dass es experimentell kann erhöht oder verringert in Vivo. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um pHi in Wildtyp-Gewebe oder verschiedene Formen der mutierte Gewebe, einschließlich der RNAi-Zuschlag oder Überexpression mit einer Gal4 von Interesse und mitotischen Klone zu messen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: um pHi in der FSC-Linie messen, wir berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin auf mCherry in FSCs, PFC und Follikelzellen unter physiologischen Bedingungen, und konvertieren Sie die Verhältnisse in pHi-Werte mit Standard Kalibrierkurven für jede Zelle Typ 7. Zur Messung der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin und mCherry in Germaria in einem Puffer mit Nahco3 3, die physiologischen Bedingungen 1 , imitiert zerlegt werden erste, live imaging Experimente durchgeführt 7. nächste, standard Kurven entstehen durch Messung von pHluorin und mCherry Fluoreszenz-Intensitäten in einem Na +-frei, K +-Puffer mit Ionophore Nigericin eingestellt auf zwei unterschiedliche pH-Werte, 6,5 und 7,5. In Anwesenheit von Nigericin pHi gestalten mit dem pH des Puffers in der Plasmamembran, pHi entsprechend den extrazellulären pH verursacht. Zu guter Letzt die Standardkurven werden verwendet, um pHluorin in mCherry Verhältnisse auf geschätzte pHi-Werte zu konvertieren.
1. Pre-Trial: Vorbereitung vor der Messung pHi In Vivo
Hinweis: pHi in Vivo zu messen, muss das mCherry::pHluorin Transgen in der Zelle Art von Interesse ausgedrückt werden. Im folgenden sind einige gemeinsame Wege zu transgenen pHluorin erzeugen in der FSC-Linie fliegt. Generierung von mCherry::pHluorin Klone eignet sich besonders zur Identifizierung FSCs, die am vorderen Rand des ein FSC-Klon befinden. Gewebe-spezifische mCherry::pHluorin-Ausdruck eignet sich zur Messung von pHi über das gesamte Gewebe und ist auch bequemer, wenn kombiniert mit Ausdruck einer RNAi oder Transgen.
- Generation von transgenen pHluorin fliegt
- mCherry::pHluorin-Label FSC Klone
- mCherry::pHluorin FSC Klone zu überqueren UAS-mCherry::pHluorin- 1, ein Akt-Gal4 Flipout Lager oder andere Lager mit einem Flp/FRT induzierbaren Gal4.
- Um Heatshock induzierbaren Klone machen Heatshock Erwachsenen F1s für 2 Tage post Bewegungsapparate in leeren Fläschchen für 1 h bei 37 ° C Wasserbad, viermal ungefähr alle 12 h.
- Für normales Wachstum und Höchstsätze der Oogenese während dieses Zeitraums zu gewährleisten, halten fliegen durch die Bereitstellung von nassen Frischhefe (ungefähr gleiche Teile trocknen Bäcker ' s Hefe und Wasser) täglich für mindestens 6 Tage nach Klon Induktion.
- Gewebe spezifische mCherry::pHluorin Ausdruck
- Cross UAS-mCherry::pHluorin- 1 zu einem Follikel Zelle bestimmte Treiber, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington-ID: 7023).
- 3 Tage nachdem fliegen umhüllenden, beginnen zu sammeln und legen Sie sie in Ampullen mit nassen Hefe für mindestens 24 h vor der Dissektion.
- mCherry::pHluorin-Label FSC Klone
- Lösungen
Hinweis: Es ist wichtig, die folgenden Puffer am Tag des Experiments vorzubereiten, weil der pH-Wert und gelösten Konzentrationen im Puffer im Laufe der Zeit ändern können.- Bikarbonat, Nigericin und Dissektion Puffer vorbereiten. Fügen Sie die Komponenten in der Reihenfolge aufgelistet, um Bildung von Ausscheidungen (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) zu vermeiden.
2. Studie: Messung von pHi in der FSC-Linie
Hinweis: die Dissektion, Montage, und Schritte für die Bicarbonat-Puffer und die zwei Nigericin Pufferbedingungen live imaging können zweimal durchgeführt werden müssen: einmal auf das Mikroskop bestimmen Einstellungen und ein zweites Mal, experimentelle Daten zu sammeln. Finden Sie im Abschnitt 2.2 unten für weitere Informationen.
- Zerlegung und Montage
Hinweis: Materialien erforderlich, um diesen Schritt ausführen, finden Sie in Abbildung 1 und Tabelle der Materialien. Für 3D gedruckte Montage Kammern sind 3D-Drucker Dateien als zusätzliche Datei 1 und ergänzende Datei 2 vorgesehen.- Dissektion:
- Prepare Montage Kammern, indem eine dünne Schicht des Vakuum Fett auf der flacheren Seite des 3D gedruckt Montage Kammer. Legen Sie diese Seite auf einem Deckgläschen 22 x 40 mM, das Deckglas an die Montage-Kammer zu versiegeln.
- Sezieren Eierstöcke von weiblichen Erwachsenen fliegen in 500 µL Dissektion Puffer (Bicarbonat oder Nigericin Puffer, Tabelle 3)
- 3-4 fliegen mit CO 2-Gas zu betäuben und Transfer fliegt auf eine Fliege Pad durchströmt mit CO 2 Gas.
- Einem narkotisierten fliegen mit Zange und Ort in die Dissektion Medien abholen.
- Kneifen den Brustkorb der Fliege mit einem Forcep beim zerren an der Spitze der seinen Bauch, bis die Eierstöcke ausgesetzt sind.
- Nach Abnehmen der Eierstöcke aus den anderen Organen, necken auseinander die Ovariolen mit 22 1/2 Spritze Nadeln. Sorgfältig getrennt der Muskel Mantel aus den Eierstöcken und separate individuelle Ovariolen aus dem Cluster von Ovariolen. Eine effektive Technik, die Muskel-Hülle zu isolieren ist mit einer Spritzennadel halten die Ansammlung von Ovariolen an seinem vorderen Ende und Strich nach unten entlang der Länge der einzelnen Ovariolen.
- Seziert Eierstöcke in Dissektion Medien genau 10 min inkubieren, bevor Sie fortfahren mit dem Montage-Schritt, so dass genügend für die pHi der Zellen Zeit, um voll und ganz mit dem pH der Nigericin Dissektion Medien equilibrate.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass der Muskel-Mantel aus den Ovariolen entfernt wird. Die Muskel Scheide kann das Fluoreszenzsignal, das macht es schwierig, einzelne Zellen mit identifizieren dämpfen Concanavilin-A, und verursachen Ovariolen spontan während der live Aufnahme verschieben.
- Montage
- legen Sie einen kleinen Tropfen der Dissektion Medien auf die Glas-Deckglas im Inneren der Kammer Montage.
- Übertragung getrennt mit Pinzette Ovariolen.
- Germaria Zusammenhang mit früheren Stadium Ei Kammern späteren Stufe Ei Kammern trennen und versuchen sicherzustellen, dass der seziert Germaria befinden sich in der Mitte der Dissektion Medien Drop.
- Zwei kleine Tropfen Nagellack auf gegenüberliegenden Seiten des eine Runde 12-mm-Deckglas und lassen Sie es an der Luft trocknen für ca. 10 s.
- Ort die Runde Deckglas auf den Rückgang der Dissektion Medien mit getrennt Germaria, so dass dieser Seite mit Nagellack nach unten zeigt und die Dissektion Medien Kontakte. Drücken Sie auf die Teile des Randes mit Nagellack zu glätten und die Germaria in Position zu sichern. Wir empfehlen die Verwendung älterer Nagellack, weil es schmiert weniger über die Oberfläche des das Deckglas, da es im Ort gesichert ist.
- Füllen Sie die Montage-Kammer mit zusätzlichen Dissektion Medien. Zustand bestimmte Puffer, die keine Concanavalin-A Farbstoff enthält kann verwendet werden, um die Kammer füllen.
Hinweis: Die gesamte Zeit verbrachte sezieren und Montage sollte 15 Minuten nicht überschreiten. Dies ist wichtig, die Auswirkungen von Gewebeschäden und Zelltod.
- Dissektion:
- Live Imaging:
Hinweis: In diesem Schritt zuerst sammeln Bilder von Bicarbonat-Zustand und die zwei Nigericin um die richtige Mikroskop-Einstellungen bestimmen, die Mikroskop-Einstellungen nach Bedarf, und dann sammeln Bilder für den experimentellen Daten. Verwenden Sie ein confocal Mikroskop in der Lage Bildgebung in 3 Kanäle: GFP (475 Erregung/509 Emission), mCherry (575 Erregung/610 Emission) und dunkelrote (633 Erregung/647 Emission).
Hinweis: Set Mikroskop Einstellungen: die Pixelintensität Bilder gesammelt werden um die Schätzungen der pHi, zu bestimmen, so es wichtig ist, dass die Intensitätswerte des Signals in jedem Bild-Satz ist weder zu niedrig noch gesättigten quantifiziert werden. Das Spektrum der Intensitäten, die in einem Bild erfasst werden können wird durch die Bild-Bittiefe definiert. In vielen Fällen 8-Bit-Bilder werden standardmäßig generiert, aber wir empfehlen die Datenerfassung als 16-Bit-Bilder, die einen größeren Dynamikumfang haben. Es ist darauf zu achten, dass das Übersprechen zwischen den fluoreszierenden Kanälen wird minimiert, so dass die Einstellungen angepasst werden sollte, damit das Emissionsspektrum von gesammelt überlappt nicht jedes Fluorophor. Um diese Einstellungen zu testen, nehmen Sie ein Beispiel-Bild mit der Anregungsspektrums für GLP und sammeln in das Emissionsspektrum für mCherry und umgekehrt. Wenn die Einstellungen richtig eingestellt haben, sollte in jedem Fall kein Signal. Legen Sie die Mikroskop-Einstellungen (d.h., Spannungs-Einstellungen auf einem Laserscanning konfokale, Laser Power und Lochkamera Größe), so dass die Pixelintensität des Signals in allen drei Sätzen innerhalb des dynamischen Bereichs der Image-Datei. Für alle unsere Versuche haben wir einen weißen Licht Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem Objektiv 40 X 16-Bit-Bilder in 1.024 × 1.024 Format zu erwerben, während wir Spannungsverstärkung für jedes Experiment optimiert, je nach Bedarf verwendet. Zum Beispiel in einem Experiment setzen wir die Spannungsverstärkung für GLP, mCherry, und dunkelrote 37,8 %, sowie 72,9 % 260 %, beziehungsweise.- Bild Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 6,5 und Einstellungen anpassen, so dass Pixelintensität der pHluorin und mCherry Bilder sind gering, aber nicht unter der Nachweisgrenze der Kamera.
- Bild einen anderen Satz von Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 7,5 und passen Sie die Einstellungen so, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder hoch, aber nicht gesättigt sind.
- Bild Eierstöcke in Bikarbonat Dissektion Puffern und sicherzustellen, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder nicht mit den gewählten Einstellungen gesättigt sind. Wenn die Pixel gesättigt sind, passen Sie die Einstellungen nach Bedarf.
Hinweis: Mikroskop Einstellparameter abweichen können basierend auf den genauen Mikroskop-Einstellungen verwendet werden und muss für jedes Experiment optimiert werden. Nachdem Mikroskop Einstellungen eingestellt haben, ändern Sie sie nicht für den Rest des Experiments. Einstellungen sollten über Kontrolle und experimentellen Bedingungen übereinstimmen. In unseren ersten pHi-Experimenten wir 2 und 3 Punkt Nigericin Kalibrierungskurven generiert und fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen berechneten pHi mit beiden Methoden. Jedoch in der Regel die Zugabe von mehr Punkte in der Eichkurve dürften um Genauigkeit zu verbessern. Wir empfehlen daher, generieren von Kurven mit einer unterschiedlichen Anzahl von Punkten zu bestimmen, wie viele für einen bestimmten Satz von experimentellen Bedingungen erforderlich sind.
- Datenerhebung:
- Dissektion, Montage und der Proben in Bikarbonat und Nigericin Pufferbedingungen imaging durchzuführen. Nach Präparation und Befestigung, die maximale Zeit verbrachte imaging eine Reihe von Proben sollte nicht mehr als 45 min um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensität-Messungen in live, gesundes Gewebe hergestellt werden.
- Für jede Bedingung abrufen von Bildern für mindestens 5 Germaria.
3. Nach dem Prozess: Bildanalyse
- Maßnahme Fluoreszenz-Intensität im FSCs, PFC, und Follikelzellen
- Hintergrund Subtraktion:
- Open unverarbeitete Bilder in Fidschi mit jeden Kanal in einem separaten Fenster ( Abbildung 4).
- Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug eine Region of Interest (ROI) zu zeichnen in der pHluorin-Kanal-Fenster in einem Teil des Bildes ohne Signal.
- Optional Schritt: die untere Grenze der Schwelle so einstellen, dass Pixel mit Intensitätswerte unter Hintergrund sind ausgeschlossen und die obere Grenze der Schwelle auf Maximum festgelegt. Wenn die Schwelle auf diese Weise festgelegt ist, die Bereiche des Bildes ohne Signal sind meist blau und das Signal ist deutlich sichtbar ( Abb. 4A).
- Messen die mittlere Fluoreszenzintensität im ROI. Wenn die Schwelle in Schritt 3 festgelegt wurde, stellen Sie sicher, überprüfen die " Grenze, Schwelle " Feld im Dialogfeld legen Sie Messungen.
- Subtrahieren die gemessenen Hintergrundintensität von jedem Kanal und Slice des Bildes mithilfe der Subtract-Funktion, gefunden in den Prozess → Math-Menü. Wiederholen Sie Schritte 3.1.1.2-6
- für das mCherry-Kanal-Fenster außer, dass in Schritt 3.1.1.2, statt ein neues Rechteck mit dem Rechteck-Werkzeug zeichnen, verwenden Sie die Wiederherstellungsfunktion Auswahl, gefunden in den Edit → Auswahl-Menü, fügen Sie ein Rechteck mit der gleichen Abmessungen und Position auf dem Bild.
- Identifizieren FSCs, PFC und Follikelzellen:
- identifizieren das FSCs, PFC und Follikelzellen von Morphologie und Standort mit Concanavalin-A Färbung, um Zellgrenzen ( Abbildung 2) zu finden.
- Sind FSCs dünne dreieckigen Zellen befindet sich am Rande des Germarium an der Region 2a/2 b Grenze. Wenn mCherry::pHluorin in einer FSC-Klon zum Ausdruck kommt, FSC kann auch identifiziert werden, wie die vorderen die meisten Zelle des Klons.
- PFC sind unregelmäßig geformten Zellen in Region 2 b, unmittelbar neben und hinter der FSCs.
- Follikel sind quadratisch oder säulenartige Zellen, die die Keimzelle Zyste in Region 3 umgeben.
- Erlangung Fluoreszenz Intensität Verhältnisse
- Wählen Sie eine oder mehrere Scheiben, in denen die Zelle von Interesse höchsten Fluoreszenzintensität in der mCherry-Kanal hat, und stellen sicher, dass das Concanavalin-A Färbung, gesehen in der dunkelrote Kanal in Foc uns in die ausgewählte Slice.
- Zeichnen ROI um jede FSC und Maßnahme der mittlere Fluoreszenzintensität von pHluorin und mCherry in allen Scheiben für Messungen gewählt.
- Teilen der mittleren Fluoreszenzintensität des pHluorin Kanals durch die mittlere Fluoreszenzintensität des mCherry Kanals, ein Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenz zu berechnen.
- Hintergrund Subtraktion:
- Derive pHi Werte und pseudocolored Bilder generieren
- Derive pHi Werte
- In allen Fällen, die lineare Regression-Kurve sollte erzeugt werden Eierstöcke von den Fliegen des gleichen Genotyps für beide experimentelle und Bedingungen zu steuern. Generieren Sie eine lineare Regression-Kurve für jeden Zelltyp mit den Daten aus zwei Nigericin Pufferbedingungen ( Abbildung 3). In Excel kann dies durch die Daten in einem Diagramm Plotten und eine lineare Trendlinie hinzufügen. Alternativ finden Sie unter:
- Gebrauch die Steigung und y-Achsenabschnitt der linearen Regression Kurve berechnet sich aus den Nigericin Bedingungen und die Gleichung einer geraden (y = Mx + b) berechnet aus den Proben in das Bikarbonat, die pHluorin in mCherry Verhältniswerte zu konvertieren Bedingung, die pH-Werte. In dieser Gleichung b Hang Form (y-Achsenabschnitt) ersetzen, setzen die Ratio-Wert in x und lösen für y.
- Erzeugen ein pseudocolored Bild spiegelt die Ratio-Werte in Fidschi.
- Folgen die Einzelheiten über Hintergrundabzug (Schritt 3.1.1 und Bild 4).
- Teilen den pHluorin Kanal aus dem mCherry-Kanal mit der Bildrechner-Funktion im Menü "Vorgang" zu finden. Achten Sie darauf die " erstellen neues Fenster " und " 32-Bit (Float) Ergebnis " Checkboxen werden beide überprüft. Ändern der Lookup-Tabelle (LUT), finden Sie unter dem Menü "Bild" thermische oder LUT Wahl. Siehe Abbildung 4 für andere geeignetsten Optionen.
- Stellen Sie Helligkeit und Kontrast im Dialogfeld (Bild → Adjust → Helligkeit/Kontrast), klicken Sie auf die " gesetzt " Taste. Satz das Minimum Wert auf 0 und das Maximum angezeigt Wert zu einem Verhältnis, die Aufnahmen am besten die Daten in der Regel 1,0-2,0 ( Abbildung 5).
- Derive pHi Werte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier haben wir den Prozess der Messung pHi in die Follikel Epithel, beinhaltet mehrere Schritte beschrieben. Erstens werden die Eierstöcke von fliegen von der entsprechenden Genotyp mit Tools zum sezieren und Montage (Abbildung 1) indiziert. Die Ovariolen sind dann abgebildet mit quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und die Bilder werden analysiert, um Messungen der pHi zu erhalten. Für jedes Bild werden die Zelltypen von Interesse identifiziert, wie beschrieben in Abschnitt 3.1 (Abbildung 2). Das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität in der GFP und mCherry Kanäle wird pHi Werten mithilfe einer standard Kurve (Abbildung 3A), wie in Abschnitt 3.2 beschrieben umgewandelt. Mit dieser Methode haben wir gefunden, dass pHi mit Differenzierung in der frühen FSC-Linie von 6,8 in FSCs, 7.0 in prefollicle Zellen auf 7,3 im Follikelzellen (Abb. 3 b) erhöht. Die pHi-Werte der einzelnen Zelle können grafisch dargestellt werden, wie in Abbildung 3 b, oder als ein pseudocolored Schliffbild zeigt, dass die Unterschiede in der pHluorin mCherry-Verhältnisse (Abbildung 4 und Abbildung 5). In diesen Bildern sind Unterschiede in der pHluorin mCherry-Verhältnisse als Unterschiede in Farbe, angezeigt, wie durch eine LUT definiert. Es ist wichtig, wählen eine LUT und maximalen und minimalen Werte für den Bereich der Farben, um ein Bild zu erzeugen, die meisten Vertreter der Daten ist. Obwohl im Allgemeinen die Wahl der LUT und Auswahl Einstellungen nicht die Darstellung der Unterschiede, die nicht im Bild vorhanden sind geben, kann eine weniger geeignet Wahl von LUTs pHi Unterschiede im Schliffbild (Abbildung 5) verdecken.
Abbildung 1: Materialien für Zerlegung und Montage Drosophila Ovariolen. (A) ein Bild anzeigen: (1) Nagellack; (2) Vakuum Fett und Becher und Pipettieren Tipp zum Anwenden von Fett verwendet; (3) 23-Gauge Spritze Nadeln; (4) Dumont Inox Zangen, Größe 5; (5) 3D gedruckte Montage Kammer; (6) 22 x 40 mM Glasdeckgläser; (7) Runde Glasdeckgläser, 12 mm Durchmesser, 0,13-0,16 mm Dicke; und (8) 9-Brunnen Glas seziert Gericht. (B) eine Nahaufnahme der 3D gedruckte Montage Kammer. (C) ein Bild zeigt ein paar zergliederten Wildtyp Eierstöcke. (D) ein Bild zeigt gut getrennten Ovariolen. (E) ein Bild von der 3D Kammer mit seziert Eierstöcke unter einem Deckgläschen Runde Glas montiert. Die schwarzen Punkte sind Tropfen Nagellack verwendet, um die Runde Deckglas in Position zu halten. (F) ein Bild des sezierten Ovariolen unter einem runden Glas Deckglas nach der Montage. Die Black Box zeigt einen Bereich des Bildes mit einem einzigen seziert Ovariole. Maßstabsleisten repräsentieren etwa 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Ermittlung FSCs, PFC und Follikelzellen. Zwei Beispiele für Germaria mit FH-mCherry::pHluorin und 10930-Gal4 gebeizt mit Concanavilin-A. Jedes Bild zeigt ein ROI skizziert ein FSC, eine pFC und ein Follikel-Zelle. Die mittlere Fluoreszenz-Intensitäten in die Kanäle pHluorin und mCherry werden verwendet, um die pHluorin mCherry-Verhältnisse zu berechnen. Maßstabsleisten repräsentieren etwa 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: pHi steigt während der Differenzierung in der FSC-Linie. Repräsentative Ergebnisse entnommen Ulmschneider Et al. 2 zeigt: (A) eine typische lineare Regression Kurve zur Berechnung der pH-Werte von pHluorin mCherry-Verhältnisse; und (B) die berechnete pHi-Werten mit 95 %-Konfidenzintervall für FSCs, PFC und Follikelzellen. Diese Zahl ist nach Genehmigung von Ulmschneider Et Al. angepasst worden. 2. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Verwendung von Fidschi, um eine pseudocolored ratiometrischen Bild zu erzeugen. (A) Bilder zeigen die Ergebnisse der einzelnen Schritte im Prozess Subtraktion im Hintergrund. Beginnend mit einem unbearbeiteten Bild (linke Platten), ist der erste Schritt die Grenzwerte so festgelegt, dass Pixel mit Intensitätswerte unter Hintergrund ausgeschlossen sind. Der obere Grenzwert der Schwelle ist auf maximum eingestellt. Fidschi wird die ausgeschlossenen Pixel, Farbe Blau was in einem Bild mit einem blauen Hintergrund und eine deutlich sichtbare Germarium (mittleren Platten). Beachten Sie, dass dieser Schritt optional ist. Der zweite Schritt ist zu zeichnen einen ROI in einem Teil des Bildes ohne Signal (rote Quadrate im mittleren Platten), Maß der mittleren Fluoreszenzintensität des ROI und ziehen Sie diesen Betrag aus dem gesamten Bild, was zu einem Hintergrund Bild (richtigen Platten) abgezogen. Der dritte Schritt ist die Bild-Berechnung-Funktion verwenden, um das Bild in den pHluorin-Kanal durch das Bild in den mCherry Kanal teilen. Das Ergebnis ist ein Bild mit der grau-Lookup-Tabelle angezeigt und das Bild Anzeigewerte auf umspannen den gesamten Dynamikbereich von der Bit-Tiefe des Bildes zur Verfügung gestellt. Der letzte Schritt ist die Bild-Anzeige Einstellungen auf eine geeignetere Auswahl und wählen eine Lookup-Tabelle. (B) Beispielbilder zeigen das Ergebnis einer Bild-Berechnung mit einem Minimum Wert legen auf 0 und der maximalen Anzeigewert voraussichtlich 2,5 mit vier verschiedenen Lookup-Tabellen anzeigen. Das Rechteck neben jedes Bild zeigt die Farben über den Dynamikbereich für jedes Lookup-Tabelle. Beachten Sie, dass für HiLo, 16 Farben und Thermal, verschiedene Farben für Pixel mit einem Intensitätswert 0 oder maximal (z.B.blau und rot, jeweils in HiLo) verwendet werden. Dies ermöglicht eine einfache visuelle Referenz, die Grenzen des dynamischen Bereichs, so dass der Betrachter zu sehen, dass das Signal innerhalb des dynamischen Bereichs liegt. (C) Screenshot Einstellungen beim Importieren einer Datei in ImageJ mit Bio-Formate Import-Plug-ins. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Einstellen des Bildes Anzeigewerte pseudocolored ratiometrischen Bilder. Die minimale und maximale Bild Anzeigewerte sollte festgelegt werden, so dass das Signal in Bildern aus der Bikarbonat-Zustand sowie beide Nigericin Bedingungen sind innerhalb des dynamischen Bereichs. Um dies zu verdeutlichen, werden zwei Bilder aus jeder der drei Bedingungen gezeigt, mit vier verschiedenen Bild-Anzeige-Einstellungen (0-0,5 0-1, 0-2,5 und 0-5) mit der thermischen Lookup-Tabelle. Beachten Sie, dass für alle drei experimentellen Bedingungen, wenn die Bilder mit der maximalen Anzeigewert auf 0,5 festgelegt angezeigt werden, viel des Signals am oder in der Nähe von maximal auf der kolorimetrischen Skala ist, und wenn es auf 5.0 eingestellt ist, viel des Signals am oder in der Nähe von mindestens auf die Farbe ist Imetric Skala. In beiden Fällen können nicht die Unterschiede in der pHluorin mCherry-Verhältnis über das Gewebe leicht geschätzt werden, so dass diese Einstellungen nicht ideal sind. Im Gegensatz dazu sind Maximalanzeige Werte 1.0 oder 2.5 viel besser geeignet. Mit diesen Einstellungen können die Unterschiede in den Verhältnissen über das Gewebe leicht geschätzt werden, und die Signale in den Bildern aus allen drei experimentellen Bedingungen sind in Farben, die innerhalb des dynamischen Bereichs der kolorimetrischen Skala angezeigt. Maßstabsleisten repräsentieren etwa 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der pHi der Zellen in der FSC-Linie in Wildtyp-Gewebe. Dieses Protokoll wurde entwickelt und verfeinert in den vergangenen fünf Jahren seit Beginn der pHi in Drosophila Eierstockgewebe zu studieren. Während dieser Zeit wird das Protokoll durch mehrere Untersucher in unserem Labor und auf mindestens vier verschiedenen Spinning Disc und Laser-scanning-Mikroskope erfolgreich eingesetzt. Die Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Beobachtung, dass pHi erhöht wie Zellen in der FSC-Linie unterscheiden die Stammzelle zu pFC zu den Follikel Zellstatus über diese mehrere Studien zeigt sowohl, dass dieses biologische Phänomen robust ist und dass die Methode ist zuverlässig. Nach unserer Erfahrung ist dies jedoch eine schwierige Prozedur zu meistern. Es erfordert große Aufmerksamkeit zum Detail bei jedem Schritt und schnelle, kompetente Ausführung der Dissektion, Montage und imaging-Schritte. Wie im Protokoll angegeben, das sezieren und Montage Verfahren umfasst eine 10 min Inkubation aber insgesamt 15 min nicht überschreiten und der bildgebende Verfahren muss in 45 min abgeschlossen werden. Unter idealen Bedingungen Drosophila Ovariolen in Kultur für bis zu 14 h17beibehalten werden können, aber wir fanden, dass das Gewebe beginnt zu sterben viel schneller in die Nigericin Puffer verwendet, um die standard Kurven erzeugen. Unsere Richtlinien stellen sicher, dass alle Daten gesammelt werden, während das Gewebe noch mittendrin das Zeitfenster ist, das es gesund und morphologisch normal angezeigt wird. Dies lässt nicht viel Zeit für jeden Schritt jedoch, daher es wichtig ist, vorausschauend zu planen, um sicherzustellen, dass alles von einem Schritt zum nächsten fortgesetzt werden. In der Tat ist es wesentlich effizienter, wenn zwei Menschen zusammen auf der Dissektion arbeiten, Montage, und bildgebende Verfahren, mit einer Person, die einen Schritt während die andere Person für den nächsten Schritt vorbereitet.
Da pHi empfindlich auf die experimentelle Manipulationen erforderlich, um das Gewebe ex Vivo, wie Temperatur und Puffer Zusammensetzung Bild möglicherweise ist diese Methode am besten zu relativen Veränderung der pHi zu identifizieren. Da die Sonde besteht aus zwei unterschiedlichen fluoreszierende Proteine, ihre Fluoreszenzeigenschaften wie Quantenausbeute, Lebensdauer und klappbare Eigenschaften unterschiedlich in verschiedenen Zelltypen betroffen sein könnten. Daher ist es wichtig, Beispiele mit der Nigericin Pufferbedingungen behandelt und zu nutzen, um eine neue Kalibrierkurve für jeden Zelltyp in jeder Prüfung zu generieren. Um zusätzliche Quellen für Variabilität zu minimieren, wird alle Bedingungen im Laufe der Bildgebung konsistent halten betont. Proben im Nigericin Pufferbedingungen sollten vorbereitet und abgebildet am selben Tag wie die Bicarbonat-Puffer-Bedingung und die Vorbereitung und Bild Übernahme aller Proben so konsistent wie möglich gehalten werden sollte. Dies ist wichtig, weil die pHi-Messungen basieren auf dem Vergleich zwischen der Image-Sätze, also experimentelle Unterschiede, die die Erkennung der mCherry beeinflussen und pHluorin in einem oder mehreren der Bildersets kann die Genauigkeit der Schätzungen pHi verringern. Faktoren wie Veränderungen in der Spannungs-Einstellungen die Photomultiplier Tubes (bei Verwendung einer konfokalen Laserscanning) oder Belichtungszeiten (bei Verwendung einer drehenden Scheibe konfokale) oder eine schmutzige Linse, die Reduzierung der Menge an Licht erreicht die Kamera beeinflussen deutlich die Ergebnisse . Aber es gibt eine Vielzahl von anderen subtileren Faktoren, die variieren von Tag zu Tag und könnte auch Einfluss auf die Ergebnisse, z. B. wenn die fliegen sind wohlgenährt, im Alter von den fliegen und wie lange der Laser auf vor Bildgebung wurden. Vorbereitung und imaging-alle drei Bedingungen am selben Tag minimiert diese Unterschiede und somit die konstantesten Ergebnisse produzieren. Bemerkenswert ist, jedes Mal haben wir auf dem neuen Mikroskop umgestellt oder Komponenten des Mikroskops wurden aktualisiert, war es notwendig, die Einstellungen auf dem neuen Gerät reoptimize. Dies führte oft zu einer Änderung in der Durchschnittswerte der einzelnen Messungen, aber solange neue Kalibrierkurven mit jeder Prüfung generiert wurden, die Veränderungen in der Ausrüstung hatte nur minimale Auswirkungen auf die pHi-Schätzungen. Darüber hinaus wird der relevanten Vergleich oft zwischen verschiedenen Zelltypen, die innerhalb der gleichen Gewebe (z. B.das FSCs PFC und Follikel-Zellen) und somit sind intern für experimentelle Variationen gesteuert.
Obwohl dieses Protokoll auf der Messung von pHi der Wildtyp Gewebe konzentriert hat, ist die Methode kompatibel mit Drosophila Standardmethoden für die Manipulation der Genexpression, z. B. Ausdruck der RNAi oder ein Transgen mit FH/Gal4 und Mosaik-Analyse. Da mCherry::pHluorin von einem FH-Förderer angetrieben wird, es wird immer zusammen mit der RNAi oder Transgen ausgedrückt sein und MARCM18 kann verwendet werden, um homozygot mutierten Klone mit mCherry::pHluorin als klonaler Marker erzeugen. Aus den oben beschriebenen Gründen sollten Wildtyp Gewebe als Steuerelement neben jedem Versuch mit einem mutierten Genotyp analysiert werden. Schließlich können die hier beschriebenen Grundsätze für die Verwendung von mCherry::pHluorin zur Messung von pHi in anderen Geweben sowie angewendet werden. In der Tat, dieses Protokoll wurde aus einem Protokoll für die Verwendung von mCherry::pHluorin, pHi in Drosophila Auge7messen angepasst, und wir haben ähnliche Methodik verwendet, um mCherry::pHluorin im Larvenstadium Gehirn Bild. Insgesamt bieten die Werkzeuge und Methoden, die hier beschriebenen neue Möglichkeiten, die vielen unterschiedlichen Funktionen pHi in Vivo in lebendigen, intakten Gewebe zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Bryne Ulmschneider für Beiträge zum Protokoll und Diane Barber für Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch eine National Institute of Health Grant GM116384 T.G. Nystul und d.l. Barber finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::pHluorin[1] | |||
| y1 w*;P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 flipout stock | Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Buffer preparation | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| glucose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Use to Make KHPO4 pH 7.4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0.25 mg/ml dilution |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and mounting tools | |||
| 2 Dumont Inox forceps (Size 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 2 23-gauge syringe needles | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-well glass dissecting dish | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 X 40 mM glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3-D mounting chamber | custom manufactured | .stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other equipment | |||
| pH meter | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Model: Accumet AB15 |
| Dissection microscope | Olympus Corporation | 0H11436 | Model: SZ2-ST |
| Confocal Microscope | Leica Biosystems | SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3 |
References
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation. J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent Indicators for Intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Koivusalo, M., Welch, C., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
- Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling. J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric imaging of pH probes. Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation. Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).
- St Johnston, D., Ahringer, J. Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell. 141 (5), 757-774 (2010).
- Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells. eLife. 3, (2014).
- Margolis, J., Spradling, A. Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary. Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).
- Nystul, T. G., Spradling, A. An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement. Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).
