Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.
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Methodenartikel
Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Änderungen im intrazellulären pH (pHi) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der viele zelluläre Funktionen, einschließlich Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung. In der Regel sind pHi Dynamik in kultivierten Zellen bestimmt, die Mess- und experimentell manipuliert pHi zugänglich sind. Allerdings machte es die jüngste Entwicklung von neuen Instrumenten und Methoden möglich, pHi Dynamiken intakt, live Gewebe zu studieren. Für die Drosophila -Forschung, eine wichtige Entwicklung war die Erzeugung einer transgenen Linie tragen eines Biosensors pHi mCherry::pHluorin. Hier beschreiben wir eine Protokoll, mit denen wir routinemäßig für bildgebende live Drosophila Ovariolen pHi in der epithelialen Follikel Stammzellen (FSC) Linie in mCherry::pHluorin transgenen Wildtyp-Linien zu messen; die hier beschriebenen Methoden kann jedoch für andere Gewebe, einschließlich der Flügel Scheiben und Auge Epithel leicht angepasst. Wir beschreiben Techniken für den Ausdruck von mCherry::pHluorin in der FSC-Linie die Aufrechterhaltung Eierstockgewebe während live imaging und Erwerb und Analyse von Bildern um pHi Werte zu erhalten.
Einleitung
Neuere Studien gezeigt eine Rolle für Änderungen in pHi während zelluläre Differenzierung und Dysplasie in Vivo1,2. Diese Studien herausgefunden, dass pHi bemerkenswert konsistent in den Zellen des gleichen Typs auf der gleichen Stufe der Differenzierung, ist aber, dass es ändert als Übergang von einer Stufe zur anderen Zellen. In einigen Fällen stört die Änderungen in pHi teilweise Sperrung Differenzierung, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der pHi nicht nur eine Folge von Veränderungen der Zelle Schicksal ist aber stattdessen hilft, die Veränderung der Zelle Schicksal, vielleicht durch Einf....
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Protokoll
Hinweis: um pHi in der FSC-Linie messen, wir berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin auf mCherry in FSCs, PFC und Follikelzellen unter physiologischen Bedingungen, und konvertieren Sie die Verhältnisse in pHi-Werte mit Standard Kalibrierkurven für jede Zelle Typ 7. Zur Messung der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin und mCherry in Germaria in einem Puffer mit Nahco3 3, die physiologischen Bedingungen 1 , imitiert zerlegt werden erste, live imaging Experimente durchgeführt 7. nächste, standard Kurven entstehen durch Messung von pHluorin und mCh....
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Ergebnisse
Hier haben wir den Prozess der Messung pHi in die Follikel Epithel, beinhaltet mehrere Schritte beschrieben. Erstens werden die Eierstöcke von fliegen von der entsprechenden Genotyp mit Tools zum sezieren und Montage (Abbildung 1) indiziert. Die Ovariolen sind dann abgebildet mit quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und die Bilder werden analysiert, um Messungen der pHi zu erhalten. Für jedes Bild werden die Zelltypen von Interesse identifiziert, wie beschrie.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der pHi der Zellen in der FSC-Linie in Wildtyp-Gewebe. Dieses Protokoll wurde entwickelt und verfeinert in den vergangenen fünf Jahren seit Beginn der pHi in Drosophila Eierstockgewebe zu studieren. Während dieser Zeit wird das Protokoll durch mehrere Untersucher in unserem Labor und auf mindestens vier verschiedenen Spinning Disc und Laser-scanning-Mikroskope erfolgreich eingesetzt. Die Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Beobachtung, dass pHi erhöht wie Zelle.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Bryne Ulmschneider für Beiträge zum Protokoll und Diane Barber für Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch eine National Institute of Health Grant GM116384 T.G. Nystul und d.l. Barber finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fly Stocks | |||
| UAS-mCherry::p Hluorin[1] | |||
| y1 w*; P{GawB}10930/CyO | Bloomington Stock Center | 7023 | |
| Act-Gal4 Flipout Stock | Center Bloomington Stock Center | 4409 | |
| Name | Company | <>Katalognummer< | strong>Comments |
| Chemikalien für die Puffervorbereitung | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P-3911 | |
| Glukose | Mallinckrodt | 4912 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310 | |
| MgSO4 | Thermo Fisher Scientific | M63 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C-5080 | |
| HCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-9272 | |
| NMDG+ | Sigma Aldrich | M-2004 | |
| K2HPO4 | Mallinckrodt | 7088 | Zur Herstellung von KHPO4 pH 7,4 |
| KH2PO4 | Thermo Fisher Scientific | BP362 | Zur Herstellung von KHPO4 pH 7,4 |
| Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Konjugat | Thermo Fisher Scientific | C21421 | 0,25 mg/ml Verdünnung |
| Nigericin | Thermo Fisher Scientific | N1495 | |
| Name< | strong>Company | Katalognummer | > |
| Dissektions- und Montagewerkzeuge | |||
| 2 Dumont Inox-Pinzette (Größe 5) | Thermo Fisher Scientific | NC9473431 | |
| 23-Gauge-Spritzennadeln | Sigma Aldrich | Z192457 | |
| 9-Well-Glas-Präparierschale | Thermo Fisher Scientific | 13-748B | |
| Vakuumfett | Dow Corning | 1018817 | |
| 22 x 40 mM Glasdeckgläser | Thermo Fisher Scientific | 12545C | |
| Runde Glas-Deckgläser, 12 mm Durchmesser, 0,13-0,16 mm Dicke | Ted Pella, Inc. | 26023 | |
| 3D-Montagekammer | kundenspezifisch gefertigte | .stl- und .ipt-Dateien für 3D-Drucker als ergänzende Dateien enthalten | |
| Name | Company< | strong>Katalognummer | Kommentare |
| Sonstige Ausrüstung | |||
| pH-Messgerät | Thermo Fisher Scientific | 13-620-183A | Modell: Accumet AB15 |
| Dissektionsmikroskop | Olympus Corporation | 0H11436 | Modell: SZ2-ST |
| Konfokales Mikroskop | Leica Biosystems | SP5 oder SP8 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fachen Objektiv und einer numerischen Apertur von 1,3 |
Referenzen
- Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 03270, (2015).
- Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
