Metoder för Imaging intracellulära pH av follikeln Stem Cell härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll för imaging intracellulära pH i en epitelial stamceller härstamning i levande Drosophila äggstocksvävnad. Vi beskriva metoder för att generera transgena flugor uttrycker en pH biosensor, mCherry::pHluorin, bild den biosensor med hjälp av kvantitativa fluorescens imaging, generera standard kurvor och konvertera fluorescens intensitetsvärden till pH-värden.

Abstract

Förändringar i intracellulära pH (pHi) spelar viktiga roller i regleringen av många cellulära funktioner, inklusive metabolism, proliferation och differentiering. Vanligtvis bestäms pHi dynamics i odlade celler, som kan bli föremål för mätning och experimentellt manipulera pHi. Men har den senaste utvecklingen av nya verktyg och metoder gjort det möjligt att studera pHi dynamiken inom intakt, levande vävnad. Drosophila forskning, var en viktig utveckling generationen av en transgen linje som bära en pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Här beskriver vi ett protokoll som använder vi rutinmässigt för imaging levande Drosophila ovarioles att mäta pHi i epitelial follikeln stamceller (FSC) härstamning i mCherry::pHluorin transgena vildtyp linjer; dock kan de metoder som beskrivs här enkelt anpassas för andra vävnader, inklusive wing skivor och ögat epitel. Vi beskriver tekniker för att uttrycka mCherry::pHluorin i FSC härstamning, att upprätthålla äggstocksvävnad under levande imaging, och förvärva och analysera bilder för att få pHi värden.

Introduction

Senare studier visade en roll för förändringar i pHi under cellulär differentiering och dysplasi i vivo^1,2. Dessa studier fann att pHi är anmärkningsvärt konsekvent i celler av samma typ i samma skede av differentiering, men att det ändras när celler övergång från ett stadium till ett annat. I vissa fall stör blockerar ändringarna i pHi delvis differentiering, vilket tyder på att förändringen i pHi är inte bara en följd av förändringar i cell öde men istället bidrar till att främja förändringar i cell öde, kanske genom effekter på pH-känsliga rättsliga proteiner eller kemiska reaktioner krävs för differentiering. Framtida studier har potential att avslöja mer inblick i många olika roller pHi dynamics in-vivo. Dock är en av utmaningarna som studerar pHi under differentiering i vivo att erhålla noggranna mätningar av pHi. Till skillnad från andra funktioner av differentiering, såsom förändringar i cellulära morfologi och genuttryck, är pHi en labil kemisk egenskap av cellen som inte bevaras i celler som har fasta och permeabilized med standardmetoder. Dessutom kanske inte pHi stabil i celler som är stressade eller döende experimentella manipulering. Därför är det viktigt att hålla cellerna lever och så frisk som möjligt när man mäter pHi. Det finns flera avgörande färgämnen att fungerar bra för mätning av pHi av celler i kultur³, men i många fall de inte är lämpliga för i vivo studier eftersom de inte tränga vävnad djupt eller jämnt nog att ge noggranna mätningar .

För att kringgå problemet med dålig dye penetration, har vi och andra använt en genetiskt kodade sond, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, som kan uttryckas specifikt i cellen typer av intresse och avbildad i levande vävnad. pHluorin är en variant av GFP med en högre pKa (~ 7.0 vs. ~ 4.0) som fälls lättare vid högre pH; så totalt fluorescensintensiteten som avges från en population av pHluorin molekyler i cellen ökar med ökande pHi⁸. Viktigt, är fluorescens linjär inom det normala cytosoliska pHi värdeintervallet. I kontrast, fluorescensen av mCherry (pKa ~ 4.5) är okänslig mot pH-förändringar inom intervallet cytosoliska. Dessa två reportrar är kovalent kopplade tillsammans som ett enda chimära protein, kodas av en enda öppen behandling ram, så de är alltid närvarande i lika mängder. Förhållandet mellan pHluorin till mCherry fluorescensintensiteten ger därför en mätning av pHi som är normaliserad till koncentrationen av sonden i varje cell. Nyckeltalen kan sedan konverteras till uppskattningar av pHi värden använder en standardkurva som genereras genom att skaffa pHluorin till mCherry nyckeltal från vävnader som har varit utjämnad till kända pH-värden.

Här beskriver vi metoderna för att mäta pHi av epitelial FSC härstamning i Drosophila äggstockarna med mCherry::pHluorin. Denna välkarakteriserad vävnad har använts för att modellera många olika aspekter av epitelial biologi, såsom stamceller självförnyelse och differentiering^9,10,11, kollektiva cellmigration¹² , samt utveckling och underhåll av cell polaritet^13,14. Follikeln epitelet är producerad av två Scheme som bor på den främre kanten av vävnaden i en struktur som kallas de germarium^15,16. Dessa celler delar regelbundet under vuxenlivet att själv förnya och producera avkomma, kallas prefollicle celler (PFC), som kan antingen ange nischen och bli en FSC eller differentieras till en av tre olika follikeln celltyper: polar celler, stjälk-celler, eller huvuddel follikeln celler. Vi visade tidigare som vildtyp vävnad, pHi ökar stadigt under de tidiga stadierna av differentiering, från en pHi på cirka 6,8 i Scheme till 7.0 i PFC, till 7,3 i follikeln celler². Blockerar denna ökning av RNAi Nedslagning av en ubiquitously uttryckt natrium/proton växlare, DNhe2, allvarligt försämrar pFC differentiering, ökar pHi av överuttryck av DNhe2 orsakar en mild överskott differentiering fenotyp. Dessa resultat visar att pHi bibehålls stabilt i den tidiga FSC härstamning och att det kan vara experimentellt ökat eller minskat i vivo. Metoderna som beskrivs här kan användas för att mäta pHi i antingen vildtyp vävnad eller olika former av mutanter vävnader, inklusive RNAi knockdown eller överuttryck använder en Gal4 av intresse och mitotiska kloner.

Protocol

Obs: för att mäta pHi i FSC härstamning, vi beräkna förhållandet mellan fluorescens intensiteter av pHluorin till mCherry i Scheme, PFC och follikeln celler i fysiologiska förhållanden och konvertera nyckeltalen i pHi värden med standard kalibreringskurvorna för varje cell typ ⁷. Första, live imaging experiment utförs för att mäta fluorescens intensiteter av pHluorin och mCherry i germaria dissekeras i en buffert som innehåller NaHCO ₃, som härmar fysiologiska villkor ^{1 , 7}. nästa, standard kurvorna genereras genom att mäta pHluorin och mCherry fluorescens stödnivåer i en Na ⁺-gratis, K ⁺ buffert innehållande den jonofor nigericin anpassas med två olika pH-värden, 6,5 och 7,5. I närvaro av nigericin balanserar pHi med pH-värdet i bufferten över plasmamembranet, orsakar pHi att matcha extracellulära pH. Slutligen, standard kurvor används för att konvertera pHluorin till mCherry nyckeltal beräknade pHi värden.

1. förundersöknings: förberedelse innan mätning pHi In Vivo

Obs: för att mäta pHi i vivo, den mCherry::pHluorin transgenens skall uttryckas i den celltyp av intresse. Nedan finns några vanliga sätt att generera transgena pHluorin flugor i FSC härstamning. Generera mCherry::pHluorin kloner är särskilt användbart för att identifiera Scheme, som ligger på den främre kanten av en FSC-klon. Vävnaden specifika mCherry::pHluorin uttryck är användbar för att mäta pHi över hela vävnaden och är också mer praktiskt när du kombinerar med uttryck av ett RNAi eller transgenens.

1. Generation transgena pHluorin flyger
   1. mCherry::pHluorin-märkt FSC kloner
      1. göra mCherry::pHluorin FSC kloner, korsa UAS-mCherry::pHluorin ¹ till en Act-Gal4 flipout eller annat lager med en Flp/FRT inducerbara Gal4.
      2. För att göra heatshock inducerbara kloner, heatshock vuxen F1s för 2 dagar post eclosion i tomma flaskor för 1 h i 37 ° C vattenbad, fyra gånger ungefär varje 12 h.
      3. För att säkerställa normal tillväxt och högsta andelen oogenes under denna period, upprätthålla flugor genom att tillhandahålla färska våta jäst (ungefär lika delar torr baker ' s jäst och vatten) dagligen under minst 6 dagar efter klon induktion.
   2. Vävnad specifika mCherry::pHluorin uttryck
   3. Cross UAS-mCherry::pHluorin ¹ till en follikel cell specifik drivrutin, y ¹ w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
   4. 3 dagar efter flugor starta eclosing, samla in och placera dem i injektionsflaskor innehållande vått jäst, under minst 24 h innan dissektion.
2. Göra lösningar
   Obs: det är viktigt att förbereda följande buffertar på dagen för experimentet eftersom pH och solute koncentrationerna i bufferten kan förändras över tid.
   1. Förbered bikarbonat, nigericin och dissektion buffertar. Lägg till komponenterna i ordningen som anges för att undvika bildandet av fällningar (se tabell 1, tabell 2 och tabell 3).

2. Trial: Mäta pHi i FSC härstamning

Obs: dissektion, montering och live imaging steg för bikarbonatbuffert och de två nigericin buffer villkor kan behöva utföras två gånger: en gång för att bestämma mikroskopet inställningar och en andra gång för att samla in experimentella data. Se avsnitt 2.2 nedan för mer information.

1. Dissection och montering
   Obs: för material som krävs för att utföra detta steg hänvisas till figur 1 och Tabell av material. För 3D tryckta montering chambers finns 3D-skrivare filer som kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2.
   1. Dissektion:
      1. Förbered montering kamrarna genom att tillämpa en tunn beläggning av vakuum fett den plattare sidan av 3D tryckta montering avdelningen. Placera det sidan på ett 22 x 40 mM täckglas att försegla täckglaset till montering avdelningen.
   2. Dissekera äggstockar från kvinnliga vuxna flugor i 500 µL dissektion buffert (bikarbonat eller nigericin buffert, tabell 3)
      1. söva 3-4 flugor med CO ₂ gas och överföring flyger på en fluga pad perfusion med CO ₂ gas.
      2. Plocka upp en sövda fluga med pincett och plats i dissektion media.
      3. Nypa bröstkorgen av i farten med en forcep, medan rycka på spetsen av dess buken tills dess äggstockarna utsätts.
      4. Efter demontering äggstockarna från andra organ, retas isär den ovarioles med 22 ^1/2 spruta nålar. Noggrant separat muskeln slida från äggstockarna och separata enskilda ovarioles från klustret av ovarioles. En effektiv teknik för att isolera den muskel slidan är att använda en sprutans nål att hålla kluster av ovarioles på plats på dess främre änden, och stroke nedåt längs längden av enstaka ovarioles.
      5. Inkubera dissekerade äggstockarna i dissektion media för exakt 10 min innan du fortsätter till montering steg så att det finns tillräckligt med tid för pHi celler fullt temperera med pH-värdet i nigericin dissektion media.
         Observera: Kontrollera att muskel manteln avlägsnas från ovarioles. Den muskel slidan kan dämpa signalen fluorescens, vilket gör det svårt att identifiera enskilda celler med hjälp av Concanavilin-A, och kan orsaka ovarioles att flytta spontant under levande imaging.
   3. Montering
      1. Placera en liten droppe av dissektion media till täckglaset inuti montering kammaren.
      2. Överföring separerade ovarioles använda pincett.
      3. Separat senare skede ägg chambers från germaria associerade med tidigare skede ägg chambers, och försöka se till att den dissekerade germaria placeras i mitten av dissektion media drop.
      4. Lägger två små droppar av nagellack till motsatta sidor av ett runda 12 mm täckglas och låt det lufttorka för ca 10 s.
      5. Plats runda täckglas på droppen av dissektion media som innehåller separerade germaria så att den sidan med nagellack är vänd nedåt och kontakter dissektion media. Tryck ned delar av kanten med nagellack att platta och säkra germaria i position. Vi rekommenderar att du använder äldre nagellack eftersom det kladdar mindre över ytan av täckglaset som det är att vara säkrade på plats.
      6. Fylla montering kammaren med ytterligare dissektion media. Villkor specifika buffert som inte innehåller Concanavalin-A färgämne kan användas till att fylla kammaren.
         Obs: Den totala tiden tillbringade dissekera och montering bör inte överstiga 15 min. Detta är viktigt att minimera effekterna av vävnadsskada och celldöd.
2. Live imaging:
   Observera: I detta steg först samla bilder från villkoret bikarbonat och två nigericin förutsättningar för att fastställa korrekt Mikroskop inställningar; justera Mikroskop inställningarna efter behov, och sedan samla bilder för experimentella data. Använda en confocal Mikroskop kan imaging i 3 kanaler: GFP (475 excitation/509 utsläpp), mCherry (575 excitation/610 utsläpp), och mån (633 excitation/647 utsläpp).
   Obs: Ställ mikroskopet inställningar: pixel stödnivåerna bilderna samlas kvantifieras för att bestämma uppskattningar av pHi, så det är viktigt att intensitetsvärdena av signalera i varje bild uppsättning varken är alltför låga eller mättade. Spänna av intensiteter som kan fångas i en bild definieras av bilden bitdjup. I många fall 8-bitars bilder genereras som standard, men vi rekommenderar att skaffa data som 16-bitars bilder, som har ett bredare dynamiskt omfång. Det är viktigt att säkerställa att överhörning mellan fluorescerande kanaler minimeras, så inställningarna bör justeras så att emissionsspektrum samlas in från varje fluorophore inte överlappar. Testa dessa inställningar, ta en exempelbild med excitation spektrumet för god Jordbrukarsed och samla i utsläpp spektrum för mCherry och vice versa. Om inställningarna har justerats korrekt, bör det finnas ingen signal i båda fallen. Ange inställningarna för Mikroskop (dvs., spänning inställningar på en laserskanning confocal, laser power och pinhole storlek) så att signalen i alla tre bild uppsättningar pixel stödnivåerna är inom det dynamiska omfånget av bildfilen. För alla våra experiment använde vi en vit ljus laserscanning confocal Mikroskop med ett 40 x-objektiv för att förvärva 16-bitars bilder i 1.024 × 1.024 format, medan vi optimerat spänning vinst för varje experiment som behövs. Exempelvis i ett experiment, vi ställa in förstärkning av spänning för GFP, mCherry, och mån som 37,8% 72,9% och 260%, respektive.
   1. Ovarioles i nigericin dissektion buffert vid pH 6,5, och justera inställningarna så att pixeln intensiteter av pHluorin och mCherry bilderna är låg, men inte lägre än gränsen för upptäckt av kameran.
   2. En annan uppsättning av ovarioles i nigericin dissektion buffert med pH 7,5 och justera inställningarna så att pHluorin och mCherry bilderna pixel stödnivåerna är hög, men inte mättade.
   3. Bild äggstockarna i bikarbonat dissekering buffert och säkerställa att pHluorin och mCherry bilderna pixel stödnivåerna inte är mättade med inställningarna du har valt. Om pixlar är mättade, justera inställningarna efter behov.
      Obs: Mikroskop inställning parametrar kan variera baserat på den exakta Mikroskop setup som används och måste optimeras för varje experiment. Efter Mikroskop inställningar har angetts, ändras inte dem för resten av experimentet. Inställningarna ska vara konsekvent över kontroll och experimentella förhållanden. I våra inledande pHi experiment, vi genererade 2 och 3 punkten nigericin kalibreringskurvor och fann ingen signifikant skillnad mellan beräknat pHi med endera metoden. Dock generellt kan tillägg av fler poäng i kalibreringskurvan förväntas förbättra noggrannheten. Därför rekommenderar vi generera kurvor med olika antal punkter för att avgöra hur många som behövs för en given uppsättning försöksbetingelser.
3. Datainsamling:
   1. utföra dissektion, montering och imaging av proverna i bikarbonat och nigericin buffert villkoren. Efter dissektion och montering, den maximala tid tillbringade imaging en uppsättning prover bör inte överstiga 45 min för att säkerställa att fluorescens intensitet mätningarna görs i levande, frisk vävnad.
   2. För varje villkor, förvärva bilder för minst 5 germaria.

3. Efter rättegången: Bildanalys

1. åtgärd fluorescens stödnivåer i Scheme, PFC, och follikeln celler
   1. bakgrunden subtraktion:
      1. Öppna obearbetade bilder i FIJI med varje kanal i ett separat fönster ( figur 4 c).
      2. Använda rektangelverktyget rita en region av intresse (ROI) i fönstret pHluorin kanal i en del av bilden utan signal.
      3. Valfritt steg: Ange den nedre gränsen av tröskeln så att pixlar med intensitetsvärden under bakgrund är uteslutna och ställa in den övre gränsen av tröskeln till maximum. När tröskeln är inställd på detta sätt, områdena i bilden utan signal är mestadels blå och signalen är klart synliga ( figur 4A).
      4. Mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten i ROI. Om tröskeln har angetts i steg 3, se till att kontrollera den " gräns för tröskel " rutan i dialogrutan Ange mätningar.
      5. Subtrahera uppmätta bakgrund intensiteten från varje kanal och skiva av bilden som använder funktionen subtrahera, Funna i processen → Math-menyn.
      6. Upprepa steg 3.1.1.2-6 för fönstret mCherry kanal förutom att i steg 3.1.1.2, istället för att rita en ny rektangel med rektangelverktyget, använder du funktionen Återställ urval, hittade i redigera → valmenyn, lägga till en rektangel med samma dimensioner och läge på bilden.
   2. Identifiera Scheme, PFC och follikeln celler:
      1. identifiera Scheme, PFC och follikeln celler med morfologi och läge med Concanavalin-A färgningen för att hitta cellgränserna ( figur 2).
      2. Scheme är tunn trekantiga celler som ligger i utkanten av germarium vid Region 2a/2b gränsen. Om mCherry::pHluorin uttrycks i en FSC-klon, FSC också kan identifieras som den främre mesta cellen klonens.
      3. PFC är oregelbundet formade celler i regionen 2b, omedelbart intill och nedströms Scheme.
      4. Follikeln celler är kvadratiska eller columnar celler som omger bakteriecellen cysta i Region 3.
   3. Att erhålla fluorescens intensitet nyckeltal
      1. Välj en eller flera skivor som cellen av intresse har högsta fluorescensintensiteten i kanalen mCherry och kontrollera att Concanavalin-A färgningen, sett i mån kanalen, är i foc oss inom det markerade segmentet.
      2. Rita ROI runt varje FSC och mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten hos pHluorin och mCherry i alla skivor valt för mätningar.
      3. Dela upp medelvärdet fluorescensintensiteten hos den pHluorin kanalen av genomsnittlig fluorescensintensiteten hos den mCherry kanalen att beräkna förhållandet av pHluorin till mCherry fluorescens.
2. Härled pHi värden och generera pseudocolored bilder
   1. Härled pHi värden
      1. i alla fall den linjära regressionskurvan bör skapas med hjälp av äggstockar från flugor av samma genotyp för både experimentell och kontrollera villkoren. Generera en linjära regressionskurvan för varje celltyp som använder data från två nigericin buffert villkor ( figur 3). I Excel, kan detta göras genom Rita data på en graf och lägga till en linjär trendlinje. Växelvis, se:
      2. Använd lutningen och y-skärningspunkten av den linjära regressionskurvan beräknas från de nigericin villkor och ekvationen för en linje (y = mx + b) att konvertera pHluorin till mCherry baserat på värden som beräknas från proverna i bikarbonat tillstånd till pH-värden. I denna ekvation, ersätta formuläret lutning (y-interceptet) b, sätta baserat på värdet i för x, och lösa för y.
   2. Generera en pseudocolored bild som återspeglar baserat på värdena i FIJI.
      1. Följ proceduren ovan för bakgrunden subtraktion (steg 3.1.1 och figur 4).
      2. Dela pHluorin kanalen från kanalen mCherry använda funktionen bild kalkylator, Funna i menyn Process. Glöm inte de " skapa nytt fönster " och " 32-bitars (float) resultatet " kryssrutorna kontrolleras både. Ändra uppslagstabellen (LUT), finns under Bild-menyn termisk eller LUT av val. Se figur 4 för andra lämplig alternativ.
      3. i dialogrutan Justera ljusstyrka och kontrast (bild → justera → ljusstyrka/kontrast), klicka på den " ställa " knappen. Ange minsta visas värdet till 0 och maximalt visas värdet för ett förhållande som bäst fångar data, vanligtvis 1.0-2.0 ( figur 5).

Representative Results

Här har vi beskrivit processen att mäta pHi i follikeln epitel, som omfattar flera steg. Äggstockarna är först, dissekerade från flugor av lämpliga genotyp använda verktyg för dissekera och montering (figur 1). Ovarioles är då avbildas med hjälp av kvantitativa fluorescensmikroskopi och bilderna analyseras för att få mätningar av pHi. För varje bild identifieras celltyper sevärdheter som beskrivs i avsnitt 3.1 (figur 2). Förhållandet mellan fluorescens stödnivåerna i GFP och mCherry kanaler konverteras till pHi värden med en standardkurva (figur 3A) som beskrivs i avsnitt 3.2. Med den här metoden, hittade vi att pHi ökar med differentiering i de tidiga FSC härstamning, från 6,8 i Scheme, till 7.0 i prefollicle celler, till 7,3 i follikeln celler (figur 3B). Varje celltyp pHi värden kan återges grafiskt, som i figur 3B, eller som en pseudocolored Mikrograf som visar skillnaderna i pHluorin till mCherry nyckeltal (figur 4 och figur 5). I dessa bilder visas skillnaderna i pHluorin till mCherry nyckeltal som skillnader i färg, som definieras av en LUT. Det är viktigt att välja en LUT och högsta och lägsta värden för olika färger för att producera en bild som är mest representativ för data. Även om valet av LUT och utbud inställningar inte kommer i allmänhet ge intryck av skillnader som inte finns i bilden, kan ett mindre lämpade val av LUTs skymma pHi skillnader i Mikrograf (figur 5).

Figur 1: Material för dissekering och montering Drosophila ovarioles. (A) en bild visar: (1) nagellack; (2) vakuum fett och bägare och Pipettera tip används för att tillämpa fett; (3) 23-gauge spruta nålar; (4) Dumont Inox pincett, storlek 5. (5) 3D tryckta montering kammare; (6) 22 x 40 mM glas coverslips; (7) runda glas Coverslips, 12 mm diameter, 0,13-0,16 mm tjocklek; och (8) 9-väl glas dissekera maträtt. (B) en närbild bild av 3D tryckta montering kammaren. (C) en bild som visar ett dissekerade par vildtyp äggstockarna. (D) en bild visar väl separerade ovarioles. (E) A bild av 3D kammaren med dissekerade äggstockar monterade under en runda täckglas. De svarta prickarna är droppar av nagellack som används för att hålla det runda täckglaset på plats. (F), en bild av dissekerade ovarioles under en runda täckglas efter montering. Den svarta lådan visar ett område i bilden med en enda dissekerade ovariole. Skala staplarna representerar cirka 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: identifiera Scheme, PFC och follikeln celler. Två exempel på germaria med UAS-mCherry::pHluorin och 10930-Gal4 färgas med Concanavilin-A. En ROI beskriver en FSC, en pFC och en follikel cell visas i varje bild. Genomsnittliga fluorescens stödnivåer i pHluorin och mCherry kanaler används för att beräkna pHluorin till mCherry nyckeltal. Skala staplarna representerar cirka 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3: pHi ökar under differentiering i FSC släktlinje. Representativa resultat tas från Ulmschneider et al. ² visar: (A), en typisk linjär regression kurvan används för att beräkna pH-värden från pHluorin till mCherry nyckeltal; och (B) de beräknade pHi värden med 95% konfidensintervall för Scheme, PFC och follikeln celler. Denna siffra har anpassats efter tillstånd, från Ulmschneider et al. ². vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4: använda FIJI för att generera en pseudocolored proportionerlig bild. (A) bilder visar resultaten av varje steg i processen bakgrund subtraktion. Börjar med en obearbetade bild (vänster paneler), är det första steget att fastställa gränsvärdena så att pixlar med intensitetsvärden under bakgrund exkluderas. Den övre gränsen av tröskeln är inställd till maximal. FIJI kommer färg uteslutna pixlar blå, vilket resulterar i en bild med en blå bakgrund och ett tydligt germarium (mellersta paneler). Observera att detta steg är valfritt. Det andra steget är att rita en ROI i en del av bilden utan signal (röda fyrkanter i mellersta paneler), mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten av ROI och subtrahera beloppet från hela bilden, vilket resulterar i en bakgrund subtraheras bild (höger paneler). Det tredje steget är att använda funktionen bild beräkning att dela upp bilden i pHluorin kanalen av bilden i mCherry kanalen. Resultatet blir en bild som visas med grå uppslagstabellen och bild visningsvärdena inställt spänner hela dynamiska som tillhandahålls av bitdjup av bilden. Det sista steget är att justera bildskärmsinställningarna bilden till ett lämpligare utbud och välj en uppslagstabell. (B) exempelbilder som visar resultatet av en beräkning av bilden med minsta visas värdet 0 och högsta värdet inställt på 2.5 använder fyra olika uppslagstabeller. Rektangeln bredvid varje bild visar de färger som används i hela det dynamiska omfånget för varje uppslagstabell. Observera att för HiLo, 16 färg och Thermal, används olika färger för pixlar med en intensitetsvärdet 0 eller maximalt (t.ex., blå och röd, respektive i HiLo). Detta ger en enkel visuell referens av gränserna för det dynamiska omfånget, att låta betraktaren att se att signalen är inom det dynamiska omfånget. (C) skärmdump visar de handlingsalternativ när du importerar en fil till ImageJ använder den Bio-format Import Plug-In. skala staplarna representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

lass = ”jove_content” fo:keep-together.within-sida = ”1” >
Figur 5: ställa in bilden visningsvärden pseudocolored proportionerlig bilder. Lägsta och högsta bild visningsvärdena bör fastställas så att signalen i bilder från villkoret bikarbonat samt från båda nigericin villkor inom det dynamiska omfånget. För att illustrera denna punkt, två bilder från samtliga tre villkor visas med fyra olika bild Uppvisning Infattningarna (0-0,5, 0-1, 0-2,5 och 0-5) med hjälp av termiska uppslagstabellen. Märker att, för alla tre experimentella villkor, när bilderna visas med maximala visas värdet 0,5, mycket av signalen är vid eller nära maximal på kolorimetriska skala, och när den är inställd till 5.0, mycket av signalen är vid eller nära minimum på färg imetric skala. I båda dessa fall, kan inte skillnaderna i pHluorin-mCherry förhållande över vävnaden uppskattas enkelt så dessa inställningar inte är perfekt. Maximala visningsvärden 1.0 eller 2.5 är det däremot mycket lämpligare. Med dessa inställningar, skillnaderna i nyckeltal över vävnaden kan uppskattas på ett enkelt och signalerar i bilder från alla tre experimentella villkor visas i färger som finns inom det dynamiska omfånget av den kolorimetriska skalan. Skala staplarna representerar cirka 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Här, beskriver vi en metod för mätning av pHi av celler i FSC härstamning inom vildtyp vävnad. Detta protokoll har utvecklats och förfinats under de senaste fem åren, sedan vi först började studera pHi i Drosophila äggstocksvävnad. Under den tiden, har protokollet använts framgångsrikt av flera utredare i vårt labb och på minst fyra olika snurrande skiva och laserscanning Mikroskop. Reproducerbarheten för vår ursprungliga observation, att pHi ökar som celler i FSC släktlinje skilja från stamcellen till pFC till follikeln cell staten över dessa flera prövningar visar båda att detta biologiska fenomen är robust och som metodiken är tillförlitlig. Vår erfarenhet är detta dock ett utmanande förfarande att bemästra. Det kräver stor uppmärksamhet åt detaljer vid varje steg, och snabb, mycket skicklig utförande av dissektion, montering och imaging steg. Som anges i protokollet, dissektion och montering förfarandet omfattar en 10 min inkubation men bör inte överstiga 15 min totala och imaging förfarandet måste slutföras i 45 min. Under ideala förhållanden, Drosophila ovarioles kan upprätthållas i kulturen för upp till 14 h¹⁷, men vi hittade att vävnaden börjar dö mycket snabbare i nigericin buffertar används för att generera den standard kurvor. Våra riktlinjer säkerställa att alla data samlas medan vävnaden är fortfarande väl inom fönstret tid som det verkar friska och morfologiskt normala. Detta lämnar inte mycket tid för varje steg, dock så är det viktigt att planera i förväg för att kontrollera att allt är redo att gå vidare från ett steg till nästa. I själva verket är det mycket effektivare om två personer arbetar tillsammans på dissektion, montering, och imaging förfaranden, med en person utför ett steg medan den andra personen förbereder för nästa steg.

Eftersom pHi kan vara känsliga för de experimentella manipulationer som krävs till bild den vävnad ex vivo, såsom temperatur och buffert sammansättning, är denna metod bäst att identifiera relativa förändringar i pHi. Med tanke på att sonden består av två distinkta fluorescerande proteiner, deras fluorescens egenskaper som kvantutbyte, livstid, och fällbara egenskaper kan påverkas på olika sätt i olika celltyper. Därför är det viktigt att ta prover som behandlats med nigericin buffert villkoren och att använda dem för att generera en ny kalibreringskurva för varje celltyp i varje studie. För att minimera ytterligare källor för variabilitet, framhävs hålla alla villkor enhetlig under imaging. Prover i nigericin buffert villkor bör förberedas och avbildas på samma dag som de i villkoret bikarbonat buffert och förberedelser och bild förvärv av alla prover bör hållas lika konsekvent som möjligt. Detta är viktigt eftersom pHi mätningarna baseras på en jämförelse mellan bild uppsättningar, så experimental skillnader som påverkar detektion av mCherry och pHluorin i en eller flera av de bild-apparater kan minska riktigheten av pHi uppskattningarna. Faktorer såsom förändringar i inställningarna för spänning av Fotomultiplikatorrör (om du använder en laser scanning confocal) eller exponeringstider (om du använder en snurrande skiva confocal) eller en smutsig lins som minskar mängden ljus som når kameran, tydligt påverkar resultaten . Men det finns en myriad av andra mer subtila faktorer som kan variera från dag till dag och kan också påverka resultaten, till exempel om flugor är välnärda, flugor, och hur länge lasrar har varit på innan imaging. Förbereda och imaging alla tre villkor samma dag minimerar dessa skillnader och därmed ger mest konsekventa resultat. Framför allt, varje gång vi bytte till ett nytt Mikroskop eller komponenter av mikroskopet har uppgraderats, var det nödvändigt att optimera inställningarna på den nya utrustningen. Detta medförde ofta en förändring av genomsnittsvärdena för de enskilda mätningarna men, så länge nya kalibreringskurvorna genererades med varje prövning, förändringar i utrustning hade en minimal påverkan på pHi uppskattningarna. Dessutom styrs relevanta jämförelsen ofta mellan olika celltyper som är inom samma vävnad (t.ex., Scheme, PFC och follikeln celler) och således är internt för experimentell variationer.

Även om detta protokoll har fokuserat på att mäta pHi vildtyp vävnad, är metoden kompatibel med standard Drosophila metoder för att manipulera genuttryck, såsom uttryck för RNAi eller en transgene som använder UAS/Gal4 och mosaic analys. Eftersom mCherry::pHluorin är driven av en UAS promotor, det kommer alltid att vara tillsammans uttryckt med RNAi eller transgenens och MARCM¹⁸ kan användas för att generera homozygot muterad kloner med mCherry::pHluorin som den klonal markören. Av de skäl som beskrivs ovan, bör vildtyp vävnad analyseras som en kontroll bredvid varje rättegång med en mutant genotyp. Slutligen, de allmänna principer som beskrivs här kan tillämpas på användningen av mCherry::pHluorin att mäta pHi i andra vävnader samt. Faktiskt, detta protokoll anpassades från ett protokoll för att använda mCherry::pHluorin för att mäta pHi i Drosophila ögat⁷, och vi har använt liknande metodik till bild mCherry::pHluorin i larval hjärnan. Övergripande, verktyg och metoder som beskrivs här ger nya möjligheter att undersöka många olika funktioner pHi i vivo inom levande, intakt vävnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3