Здесь мы представляем подробный протокол для применения родамин 123 для выявления потенциальных митохондриальной мембраны (СПП) и изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции был записан в реальном времени изменение системы СПП.
Истощение митохондриальной мембраны потенциальных (СПП, ΔΨm) считается раннее событие в apoptotic Каскад. Это происходит даже впереди ядерных apoptotic характеристики, включая конденсацию хроматина и поломки ДНК. После того, как рушится ММП, апоптоз клеток будет инициировать необратимо. Ряда липофильных Катионные красители можно пройти через клеточные мембраны и агрегировать внутри матрицы митохондрий и служить флуоресценции маркер для оценки изменения ММП. Как один из шести членов семьи внутриклеточных канал (клик), Cl– CLIC4 участвует в процессе apoptotic клетки главным образом через Митохондриальные пути. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения MMP через мониторинга флуоресценции колебания родамин 123 (Rh123), через который мы изучаем апоптоз, CLIC4 нокдаун. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальное лазерное сканирование и нормальной флуоресцентным микроскопом в деталях, а также сравнить его с другими методами.
Rh123 является красителя катионного флуоресценции, который служит индикатором для трансмембранного потенциала. Rh123 способна проникающим клеточной мембраны и ввода митохондриальной матрицы в зависимости от потенциального разница внутри и за пределами мембраны1. Апоптоз приводит к повреждению целостности митохондриальной мембраны. Митохондрии поры проницаемости перехода (MPTP) будет открыт и привести к краху системы СПП, которая в свою очередь приводит в выпуске Rh123 вне митохондрий. Наконец сильный сигнал зеленый флуоресценции будет обнаружен под флуоресцентным микроскопом. Это хорошо документированы, что истощение ММП и повышенные мембран проницаемости являются ранние признаки апоптоз клеток2. Таким образом Rh123 может применяться для обнаружения изменений ММП и возникновение апоптоза клеток.
Как 6 наиболее распространенным раком в мире головы и шеи рак сильно ухудшается здоровье человека3. Хотя в последние годы были разработаны многие подходы, клинические исходы лечения для пациентов, страдающих от головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC)-до сих пор не идеальный4. Изучение новых терапевтических методов может улучшить лечение HNSCC5. Каналы иона с участием многочисленных биологических процессов отображать важную роль в развитии различных видов рака6. Частичное или полное участие Cl– каналов очень участвуют в различных свойств неопластической трансформации, в том числе активной миграции, высокий уровень распространения и инвазии. В свете этого CLIC, Роман белка семьи, были перечислены как перспективный класс терапевтических целей для рака лечение6,7. Недавние исследования показали, что члены семьи CLIC, включая CLIC1, CLIC4 и CLIC5, локализация для сердечной митохондриальных и уровень реактивнооксигенных видов (ров), upregulated, CLIC5, указывающий функциональную роль митохондриальной расположен Cl – каналы в ответ apoptotic8. CLIC4, один из членов семьи CLIC (также известный как mtCLIC, P64H1 и RS43), наиболее широко изучены для регулирования свойств его apoptotic в раковые клетки и внутриклеточных местоположения, включая Гольджи, эндоплазматический ретикулум и митохондрий в человека кератиноциты7,9,10. Выражение профиль CLIC4 регулируется фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), P53 и внешний раздражитель. Сверхэкспрессия и Даунрегуляция CLIC4 спровоцировать реакцию apoptotic главным образом через Митохондриальные пути сопровождается дисбаланс Bcl-2 члены семьи, активацию caspase Каскад и выпуск цитохрома C11, 12 , 13. Таким образом, ММП измерение имеет решающее значение для изучения связанных с CLIC4 апоптоза, и Rh123 служит индикатором идеальной флуоресценции.
Настоящее исследование описывает подробный протокол для обнаружения ММП для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированного апоптоза в HN4 клетках. Rh123 используется в качестве флуоресценции зонда для наблюдения за изменением ММР. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции реального времени колебания МЦП могут быть решены. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции в деталях, а также сравнить его с другими методами. Этот протокол также может применяться для других исследований, связанных с апоптоз.
Это хорошо документировано что Cl− каналы имеют важное значение в поддержании гемостаз внутренней среды и играют важную роль в клеточной пролиферации и апоптоза15,16. Таким образом понимание взаимосвязи между ионного канала целевой вмешательства и …
The authors have nothing to disclose.
Мы любезно благодарим г-н Chao Fang на культуры клеток. Эта работа была поддержана гранты от фонда естественных наук Китая (Грант № 81570403, 81371284); Аньхой провинциального природного научный фонд (Грант № 1408085MH158); Выдающийся молодой следователь Аньхой медицинского университета; Программа поддержки для отличные молодых талантов в университетах провинции Аньхой.
HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |