Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для применения родамин 123 для выявления потенциальных митохондриальной мембраны (СПП) и изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции был записан в реальном времени изменение системы СПП.
Abstract
Истощение митохондриальной мембраны потенциальных (СПП, ΔΨm) считается раннее событие в apoptotic Каскад. Это происходит даже впереди ядерных apoptotic характеристики, включая конденсацию хроматина и поломки ДНК. После того, как рушится ММП, апоптоз клеток будет инициировать необратимо. Ряда липофильных Катионные красители можно пройти через клеточные мембраны и агрегировать внутри матрицы митохондрий и служить флуоресценции маркер для оценки изменения ММП. Как один из шести членов семьи внутриклеточных канал (клик), Cl– CLIC4 участвует в процессе apoptotic клетки главным образом через Митохондриальные пути. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения MMP через мониторинга флуоресценции колебания родамин 123 (Rh123), через который мы изучаем апоптоз, CLIC4 нокдаун. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальное лазерное сканирование и нормальной флуоресцентным микроскопом в деталях, а также сравнить его с другими методами.
Introduction
Rh123 является красителя катионного флуоресценции, который служит индикатором для трансмембранного потенциала. Rh123 способна проникающим клеточной мембраны и ввода митохондриальной матрицы в зависимости от потенциального разница внутри и за пределами мембраны1. Апоптоз приводит к повреждению целостности митохондриальной мембраны. Митохондрии поры проницаемости перехода (MPTP) будет открыт и привести к краху системы СПП, которая в свою очередь приводит в выпуске Rh123 вне митохондрий. Наконец сильный сигнал зеленый флуоресценции будет обнаружен под флуоресцентным микроскопом. Это хорошо документированы, что истощение ММП и повышенные мембран проницаемости являются ранние признаки апоптоз клеток2. Таким образом Rh123 может применяться для обнаружения изменений ММП и возникновение апоптоза клеток.
Как 6 наиболее распространенным раком в мире головы и шеи рак сильно ухудшается здоровье человека3. Хотя в последние годы были разработаны многие подходы, клинические исходы лечения для пациентов, страдающих от головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC)-до сих пор не идеальный4. Изучение новых терапевтических методов может улучшить лечение HNSCC5. Каналы иона с участием многочисленных биологических процессов отображать важную роль в развитии различных видов рака6. Частичное или полное участие Cl– каналов очень участвуют в различных свойств неопластической трансформации, в том числе активной миграции, высокий уровень распространения и инвазии. В свете этого CLIC, Роман белка семьи, были перечислены как перспективный класс терапевтических целей для рака лечение6,7. Недавние исследования показали, что члены семьи CLIC, включая CLIC1, CLIC4 и CLIC5, локализация для сердечной митохондриальных и уровень реактивнооксигенных видов (ров), upregulated, CLIC5, указывающий функциональную роль митохондриальной расположен Cl - каналы в ответ apoptotic8. CLIC4, один из членов семьи CLIC (также известный как mtCLIC, P64H1 и RS43), наиболее широко изучены для регулирования свойств его apoptotic в раковые клетки и внутриклеточных местоположения, включая Гольджи, эндоплазматический ретикулум и митохондрий в человека кератиноциты7,9,10. Выражение профиль CLIC4 регулируется фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), P53 и внешний раздражитель. Сверхэкспрессия и Даунрегуляция CLIC4 спровоцировать реакцию apoptotic главным образом через Митохондриальные пути сопровождается дисбаланс Bcl-2 члены семьи, активацию caspase Каскад и выпуск цитохрома C11, 12 , 13. Таким образом, ММП измерение имеет решающее значение для изучения связанных с CLIC4 апоптоза, и Rh123 служит индикатором идеальной флуоресценции.
Настоящее исследование описывает подробный протокол для обнаружения ММП для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированного апоптоза в HN4 клетках. Rh123 используется в качестве флуоресценции зонда для наблюдения за изменением ММР. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции реального времени колебания МЦП могут быть решены. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции в деталях, а также сравнить его с другими методами. Этот протокол также может применяться для других исследований, связанных с апоптоз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и Transfection клетки
-
Культура клеток
Примечание: HN4, линия клетки HNSCC, была получена от больных с HNSCC14.- Культура HN4 клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM, глюкоза 4,5 г/Л) с 10% плода бычьим сывороточным и антибиотики (100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл). Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
-
Transfection клетки
- Один день перед трансфекции, пластина 5 x 105 клеток в 2 мл/о питательной среды без антибиотиков в 6-ну пластины хорошо.
- Разбавляют 100 пмоль CLIC4 siRNA или омлет малых интерферирующих РНК в 250 мкл сокращение сыворотке СМИ, аккуратно. Разбавить 5 мкл Реагента липосомы в 250 мкл сокращение сыворотке СМИ и инкубировать на 5 мин комбинат разреженных siRNA с реактивом разреженных липосом, осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь в хорошо содержащих клеток и среднего. Смешайте нежно покачиваясь пластины обратно и вперед. Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубатор CO2 на 24 часа, прежде чем с помощью следующей процедуры маркировки Rh123. Замените средний нормальный рост среднего 4 h после transfection.
2. Rh123 маркировки
Примечание: Rh123 был использован для измерения ММП в HN4 клетки1.
- После CLIC4 лечения малых интерферирующих РНК (раздел 1) используйте HN4 клетки в 6-ну пластины для следующих лечения. Количество HN4 клеток в каждом хорошо достаточно, чтобы повторить эксперимент в 10 раз на coverslips.
- Используете пинцет поставить круговой coverslips на нижней части новой 12-ну пластин. Количество пластин устанавливается согласно экспериментальный дизайн (рис. 1А).
- Положите 150 мкл 100 мкг/мл polylysine на середину каждого coverslip внутри плиты 12-Ну и подождать 2 мин Обратите внимание не поставить polylysine вне coverslips. Затем тщательно удалить polylysine, дозаторов (рис. 1Б).
- Удалите средство культуры клеток HN4 внутри блюдо и добавьте трипсин 0.25% 1 мл для отсоединения клетки. После 6 мин добавьте 2 мл питательной среды для нейтрализации трипсина. Осторожно Смешайте HN4 клетки, дозаторов для 5 раз и семян 2-6 х 104 клетки на круговой coverslips. Место в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 (рис. 1C).
- После 8 ч инкубации инкубации клеток HN4 с 2 мкмоль/Л Rh123 40 мин при температуре 37 ° C. Аккуратно перемешайте средних вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение Rh123 в среде (рис. 1D).
- Готовят раствор достаточно нормального физиологического раствора (технология); чтобы сделать технология (в ммоль/Л): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 глюкозы и 5 HEPES, рН 7,4). Разогрейте до 37 ° C на водяной бане.
- Использовать пинцет, чтобы удалить coverslips и мыть оставшиеся жидкость через кратко размещение coverslips в разогретой NPBS буфер (рис. 1E).
- Место coverslips на нижней части камеры из нержавеющей стали 500 мкл (см. Таблицу материалы) с дном coverslip сменных 25 мм стекла запечатаны в место уплотнительное кольцо. Исправить это, затянув крышку камеры (рис. 1E).
- Добавление 450 мкл разогретую технология буфера в собранном виде Палату и поставить ванна под поле зрения микроскопа флуоресценции или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования (рис. 1E).
3. Обнаружение МЦП
-
Общие флуоресцентным микроскопом
- Включите флуоресцентным микроскопом следуя инструкциям производителя.
Примечание: Общий флуоресцентным микроскопом было достигнуто с ртутью лампа оптоволоконные источником света, FITC фильтра для Rh123 (480/40 возбуждения фильтр, 505 LP дихроичное зеркало и фильтр выбросов 535/40) при комнатной температуре. 20 X цель был использован для выполнения клеток. - Откройте системного программного обеспечения обработки изображений и выберите кнопку «New» из панели команд, чтобы начать новый эксперимент (рисA).
- Настройка визуального поля и фокус, чтобы найти расположение ячеек в белый свет.
- Выключите свет и нажмите на кнопку, чтобы закрыть белый свет. Нажмите кнопку «Фокус» из панели команд и выберите пункт «Начать упором «переключиться на флуоресценции. Найти местоположение клетки снова через микроскоп с 507 возбуждения Нм и 529 Нм длинный пас выбросов волны (набор до эксперимента). Настройте поле зрения и фокус снова при необходимости (рис. 2B).
- Выберите visual поле, содержащее только 20-30, раздельный HN4 клеток. Изменение сигнала внутриклеточных флуоресценции для каждой ячейки будут записаны точно.
- Как только достигается ясно поля зрения, нажмите «Закрыть сосредоточена» из панели фокус. Нажмите кнопку «Acq один» из панели команд, чтобы получить один набор изображений. Нажмите кнопку «Регионы» из панели команд и нажмите кнопку «ОК», чтобы редактировать регионы измерения.
Примечание: На панели редактирования региона разных регионе формы может использоваться в зависимости от исследования. - Подходят для различных форм отдельных ячеек, выберите инструмент «След региона» и обведите региона одной одной ячейки и дважды щелкните после завершения. Повторите процедуру до тех пор, пока все клетки кружил (рис. 2C). Нажмите кнопку «Готово» и выберите «Сохранить изображения», чтобы найти его месторасположения.
- Нажмите кнопку «Zeroclock «и быстро нажать F4, чтобы начать мониторинг изменения интенсивности флуоресценции. Запись в реальном времени изменение интенсивности флуоресценции один раз каждые 5 s 5 минут (рис. 2D).
- Когда базовый становится стабильным, добавьте 50 мкл технология смешать с 0,5 мкл 100 ммоль/Л АТФ в камеру через дозаторов. Помните, чтобы не прикасаться камеры, чтобы избежать удаления поля зрения (Рисунок 2E).
Примечание: Флуоресценции изображение будет записан на 20 минут и затем эксперимент может закончиться через ручной работы. Продолжительность времени регулярно поселились на 20 минут для того чтобы наблюдать весь флуоресценции изменения. Однако руководство по эксплуатации, чтобы остановить захват применяется, когда неожиданные факторы влияют на стабильность кривой или когда весь процесс занимает менее 20 минут.
- Включите флуоресцентным микроскопом следуя инструкциям производителя.
-
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования
- Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции следуя инструкциям производителя и открыть комплекте программное обеспечение.
Примечание: Здесь, Rh123 возбуждалась Аргонового лазера на 488 нм и передаваемый сигнал был записан в диапазоне 545-700 Нм через применение фильтра TD488/543/633. - Нажмите кнопку «Задача» в меню «Получить», чтобы выбрать 63 X / 1.4 н.а. масло объектива. Наблюдать за образец и найти четкие поля зрения под светового поля.
- Нажмите кнопку «TL/IL» для переключения в режим флюоресценции и выберите правильный флуоресценцией фильтры, чтобы найти расположение ячейки под тьмы через микроскоп. Нажимаем «Затвор» для защиты образца по окончании наблюдения.
- В меню «Получить» настроить подходящий ПЛТ канал и нажмите кнопку «Достижения» для того чтобы активировать поселились оптического пути (рисA). Нажмите в меню «Настройка» и выберите «Лазер», чтобы определить тип необходимой лазерной. «Аргон» рекомендуется для этого протокола (рис. 3B).
- Нажмите «Live», чтобы получить в реальном времени изображение и убедитесь, что поле содержит только 20-30, раздельный HN4 клетки. Изменение сигнала внутриклеточных флуоресценции для каждой ячейки будут записаны точно.
- Выберите «xyt» в режиме приобретения в подменю «Приобретение» в меню «Приобретение» (рис. 3C). Набор 5 s и 20 минут для интервала времени и продолжительности, соответственно. Нажмите кнопку» применить» когда решаются все параметры.
- Под «Quantify» меню используйте средство «Рисовать полилинии» окружить области записи каждой ячейки. Выберите «Линия профиля» и выберите «Старт» для проведения наблюдения. Запись в реальном времени изменение интенсивности флуоресценции для 5 минут (рис. 3D - E).
- Когда базовый становится стабильным, добавьте 50 мкл технология смешать с 0,5 мкл 100 ммоль/Л АТФ в камеру через дозаторов. Помните, чтобы не прикасаться камеры, чтобы избежать удаления поля зрения.
Примечание: Флуоресценции изображение будет записан на 20 минут и затем завершения эксперимента.
- Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции следуя инструкциям производителя и открыть комплекте программное обеспечение.
4. Статистический анализ
-
Общие флуоресцентным микроскопом
- Включите флуоресцентным микроскопом регулярно после руководство оператора. Откройте системного программного обеспечения обработки изображений и выберите кнопку «Открыть» из панели команд, чтобы открыть сохраненный эксперимент. Нажмите кнопку «Регионы» из панели команд и нажмите кнопку «OK» для редактирования областей измерения.
- Выберите инструмент «След региона» и обведите региона одной одной ячейки и дважды щелкните когда сделано. Повторите процедуру до тех пор, пока кружили все клетки. Нажмите кнопку «Готово» и выберите «F4: вперед» кнопку для получения трассировки показаны интенсивности флуоресценции.
- После завершения, нажмите кнопку со стрелкой вниз, расположенный на нижнем правом углу диаграммы и нажмите кнопку «Показать граф данных» (Рисунок 2F). Дважды нажмите кнопку «OK» и выберите «Данные журнала» кнопку, чтобы открыть интерфейс программного обеспечения для обработки данных. Снова нажмите кнопку «Данные журнала» и найти записи реального времени колебаний интенсивности флуоресценции отображаются на листе.
Примечание: Для каждой ячейки, как отношение флуоресценции относительно интенсивности до применения СПС или тг (F1/F0) были представлены изменения в СПП. Каждый данных интенсивности флуоресценции были в среднем 20-30 ячеек. Данные для Rh123 представлены как среднее ± SE. результаты из 2 групп были протестированы двустороннее независимое t -тест и P значение < 0,05 считался статистической значимости. Программное обеспечение для статистического анализа был применен для проведения статистического анализа в этом эксперименте.
-
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования
- Включите конфокальный лазерный микроскоп и войти в комплекте программное обеспечение следуя инструкциям производителя.
- Выберите «Огонь», чтобы открыть записанные эксперимент.
- Выберите инструмент «Стек профиль» в меню «Quantify», выберите «все в одном» от «Сортировка диаграммы каналы и трансформирования.»
- Используйте инструмент «Рисовать многоугольник» круг ячейки регионов для наблюдения.
- Выберите в меню «Граф» и щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Экспорт в excel» для добавления значений интенсивности флуоресценции в электронную таблицу. Приводимый ниже анализ согласуется с нормальной флуоресценции микроскопы (рис. 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем исследовании Rh123 был применен для обнаружения ММП. Первоначально HN4 клетки были культивировали для следующих флуоресценции, окрашивание экспериментов. Пинцет были использованы положить круглые coverslips на нижней части 6-ну пластины (рис. 1А). Coverslips были покрыты polylysine на 5 мин и затем polylysine удаляются с помощью дозаторов (рис. 1Б). Затем HN4 клетки были trypsinized и посеян на coverslips, в нижней части пластины 6-хорошо. Далее, соответствующее количество Rh123 была добавлена и смешанные хорошо (рис. 1C-D). После мытья с разогретой технология, coverslip был собран в камеру просмотра. Соответствующее количество технология была добавлена для следующих эксперимента (1 рисунокE).
После процедуры Rh123 окрашивания общие флуоресцентным микроскопом и Конфокальный микроскоп были использованы для записи в реальном времени флуоресценции Rh123 с различными шагами и программного обеспечения. Для общей флуоресцентным микроскопом чтобы создать новый эксперимент был включен изображений программное обеспечение. Затвор был открыт для показать свет зеленый флуоресценции и фокус и местоположение были скорректированы для получения соответствующего поля зрения. После взятия изображения ячейки, форму трассировки инструменты использовались для рисовать региона каждый single cell и затем записывать изменения флюоресценции. После того, как базовый стала стабильной, СПС был добавлен в камеру для инициирования деполяризации митохондриальной мембраны. В эксперименте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции был открыт комплекте программное обеспечение и установить подходящей оптического пути. После того, как был выбран источник света аргон, мы скорректировали фокус и положение камеры для достижения четкого визуального клетки фигур на экране. Был выбран режим сканирования «xyt» и «рисовать многоугольник» был применен к обведите область ячейки для записи изменения флюоресценции в каждый single cell. Для анализа исходных данных, F0 был значение интенсивности флуоресценции до применения СПС и F1 было максимальное значение интенсивности флуоресценции после применения СПС. F1/F0 была использована для оценки деполяризации митохондриальной мембраны (рис. 2 и рис. 3). Рисунок 4B и 5 на рисункеBуровни интенсивности флуоресценции были подняты после лечения АТФ и снижение обратно к базовому после примерно 10 минут Рисунок 4C и Рисунок 5C ясно продемонстрировать, что пик интенсивности флуоресценции Rh123 был в группе под CLIC4 siRNA лечения выше, чем в контрольной группе. Рисунок 4 И Рисунок 5A шоу представитель изображения флуоресцентных изменения на каждом этапе. По сравнению с общей флуоресцентным микроскопом, Конфокальный микроскоп получил более высокое качество изображения, показывая клеточного ядра и митохондрии. Однако при сравнении данных из двух методов, были найдены никаких существенных различий. Результаты от флуоресценции и конфокального микроскопа продемонстрировали что нокдаун CLIC4 Улучшено деполяризации АТФ индуцированной митохондриальной мембраны в клетках HN4 (рис. 4 и 5).
Рисунок 1 . Маркировка Rh123. Пинцет (A), были использованы для положить круглые coverslips в нижней части пластины 6-хорошо. (B) покрытия coverslips с polylysine через дозаторов на 5 мин и наконец всасывания обратно в дозаторов для удаления polylysine. (C) HN4 клетки были посеяны на coverslips в нижней части пластины 6-хорошо. (D) добавить подходящее количество Rh123 и смешивания хорошо. (E) промывки coverslips с разогретой АЭС и монтаж камеры с подходящим количеством технология для следующий эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Шаги для мониторинга в реальном времени колебания Rh123 флуоресценции общей флуоресцентным микроскопом. (A) открыть новый эксперимент. (B) начать фокусировку и выбрать подходящие поля зрения под флуоресценции. (C) использование «Регионы» инструмент из панели команд редактирования областей наблюдения. (D) нажмите кнопку «Нулевой часы» и быстро нажать F4, чтобы начать мониторинг изменения интенсивности флуоресценции. (E) Добавление АТФ (100 мкмоль/Л) для запуска деполяризации мембраны митохондрий, после того, как базовый становится стабильным. (F) после завершения эксперимента, нажмите на стрелку вниз, расположенный на нижнем правом углу графика для экспорта данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Шаги для мониторинга в реальном времени колебания Rh123 флуоресценции лазером конфокальный сканирующий микроскоп флуоресцирования. (A) выберите ПЛТ канал и набор подходит волны диапазон под меню «Получить». (B) выберите тип правильный лазера от «Текущие доступные лазер» и задайте его власти. (C) выберите режим наблюдения «xyt» и задайте серии записи параметров. (D) выбрать инструменты «Профиль стека» и «Все в одном» от «Сортировка диаграммы каналы и трансформирования.» (E) используется инструмент «рисовать многоугольник» круг область ячейки для данных в реальном времени. (F) экспортировать значения интенсивности флуоресценции в программное обеспечение для обработки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Эффект CLIC4 сногсшибательно на АТП индуцированной митохондриальной мембраны деполяризации решена общей флуоресцентным микроскопом в HN4 клетках. (A) представитель изображений флуоресценции колебания Rh123. Представитель следы (B) и сводные данные (C) показаны АТФ (100 мкмоль/Л)-индуцированные изменения в ячейке HN4 СПП. Изменения мембранного потенциала было указано соотношение интенсивности флуоресценции до и после применения СПС. Увеличение соотношения представляет потенциальные деполяризации мембраны. HN4 клетки были transfected с CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) или омлет интерферирующие РНК (Con siRNA). Значения отображаются как среднее ± SEM. n = 5. P < 0,05 против группы управления (Con siRNA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Влияние CLIC4 сногсшибательно на АТП индуцированной митохондриальной мембраны деполяризации, устраняемые конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции в HN4 клетках. (A) представитель изображений флуоресценции колебания Rh123. Представитель следы (B) и сводные данные (C) показаны АТФ (100 мкмоль/Л)-индуцированные изменения в ячейке HN4 СПП. Изменения мембранного потенциала было указано соотношение флуоресценции плотности до и после применения СПС. Увеличение соотношения представляет потенциальные деполяризации мембраны. HN4 клетки были transfected с CLIC4 интерферирующие РНК (CLIC4 siRNA) или платные интерферирующие РНК (Con siRNA). Значения отображаются как среднее ± SEM. n = 5. P < 0,05 против группы управления (Con siRNA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это хорошо документировано что Cl− каналы имеют важное значение в поддержании гемостаз внутренней среды и играют важную роль в клеточной пролиферации и апоптоза15,16. Таким образом понимание взаимосвязи между ионного канала целевой вмешательства и апоптоз — настоятельная необходимость и значение найти лучше терапевтический подход для различных видов рака17. Митохондрии поддерживать нормальное биологическое состояние ячейки и ее функции весьма относится к ее проницаемость мембран и трансмембранного потенциала. Помимо рака накапливая патологического исследования документально митохондриальных нарушений способствовать миопатия, сердечно-сосудистых заболеваний и неврологические симптомы, включая нейросенсорная глухота, мозжечковая атаксия, деменция и эпилепсии18,19. Все эти стимулировали исследования в митохондриальной целевые вмешательства с которой для улучшения клинического лечения. Rh123, ориентированные на митохондрии флуоресценции красителя, могут проникать клеточной мембраны и служит как универсальный флуоресценции зонда для обнаружения ММП. В начале состоянии апоптоза клеток открытие MPTP повышает проницаемость митохондриальной мембраны, позволяя Rh123 выйдет за пределы митохондрии и наконец сильного сигнала зеленой флуоресценцией может быть обнаружена. В этой ситуации двусторонние ионов свободно распространять и привести к стремительное падение ММП, вызывая развязки цепи переноса электронов и снижение производства АТФ, которая серьезно влияет на нормальное энергоснабжения клеток. Кроме того открытие MPTP вызывает отток pro-apoptotic биоактивных соединений, включая Cyt C, апоптоз, вызывая фактор, apoptotic протеазы активирующее фактор-1 и рос и, наконец, приводит к необратимым апоптоз20,21 .
СПС может побудить деполяризации мембраны митохондрий, как свидетельствует повышенный флуоресценции Rh123. Сравнивая деполяризации АТФ индуцированной митохондриальной мембраны клеток под различные виды лечения, это можно расшифровать биологической функции изменения в митохондрии и степени и состояние апоптоз22. Общие флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования можно достичь реального времени мониторинг ММП через запись колебания интенсивности флуоресценции Rh123, но преимущества и недостатки обоих методов должны быть рассмотрены. По сравнению с общей флуоресцентным микроскопом, снимках конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции имеют выше разрешение и качество. Таким образом могут быть визуализированы субцеллюлярные Подробнее. Кроме того это уменьшает воздействие света кросс ток когда несколько флуоресценции красители используются. Следовательно Конфокальный микроскоп может точно запись в реальном времени флуоресценции колебания Rh123 и отражают реальные сотовой биологическую. Однако наши методы мониторинга СПП необходимо непрерывно записи относительных долгое время и серии цитотоксины, включая один кислорода и рос, могут быть произведены под лазерного излучения, ведущей к ячейке ущерб23. Кроме того высокая лазерной интенсивности обычно вызывает затухания флуоресценции красителей в ходе непрерывного сканирования24. Напротив общий флуоресценции Микроскоп не может принимать изображения с высоким качеством как Конфокальный микроскоп, но он не имеют вышеупомянутые отрицательные эффекты и таким образом делает возможным долгое время записи. Сравнивая наши данные из общих флуоресцентным микроскопом и конфокального микроскопа, не очевидная разница может быть найден, который указывает, что общий флуоресценции микроскопа достаточно компетентным для контроля колебаний СПП, а также анализ данных рентабельных и более удобным. HN4 клетки были посеяны на coverslips до эксперимента. Хотя polylysine применяется для повышения клеточного вложение, небольшая часть клеток, по-прежнему оторваны от coverslips и грубая операция приводит к обесценению жизнеспособность клеток. Кроме того добавление Rh123 или АТФ в камеру, следует позаботиться не прикасайтесь к камере и coverslips.
Помимо Rh123, DioC6, JC-1 и тетраметилсвинец родамин метилового эфира (TMRM) являются флуоресценции красители, которые могут быть использованы для обнаружения ММП. Вместо того, чтобы запись в реальном времени через микроскоп, проточной цитометрии также может выполнить эту задачу. Однако запись в реальном времени изменение интенсивности флуоресценции с микроскопом больше подходит для обнаружения клеточных биологическую и формирования интуиционистской изображения, давая более надежные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы любезно благодарим г-н Chao Fang на культуры клеток. Эта работа была поддержана гранты от фонда естественных наук Китая (Грант № 81570403, 81371284); Аньхой провинциального природного научный фонд (Грант № 1408085MH158); Выдающийся молодой следователь Аньхой медицинского университета; Программа поддержки для отличные молодых талантов в университетах провинции Аньхой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
