Summary
Aquí presentamos un protocolo detallado para la aplicación de la rodamina 123 para identificar el potencial de la membrana mitocondrial (MMP) y estudiar CLIC4 caída inducida HN4 celular apoptosis in vitro. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, se registró el cambio en tiempo real de la MMP.
Abstract
Agotamiento del potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) se considera el evento más temprano en la cascada apoptótica. Incluso se produce por delante de apoptotic nuclear características, incluyendo la condensación de la cromatina y la rotura de ADN. Una vez que los colapsos MMP, apoptosis celular iniciará irreversible. Una serie de colorantes catiónicos lipofílicos puede pasar a través de la membrana celular y agregado dentro de la matriz de la mitocondria y servir como marcador de fluorescencia para evaluar cambio MMP. Como uno de los seis miembros de Cl– familia canal intracelular (CLIC), CLIC4 participa en el proceso de apoptosis de la célula principalmente a través de la vía mitocondrial. Aquí describimos un protocolo detallado para medir MMP mediante monitoreo de la fluctuación de la fluorescencia de rodamina 123 (Rh123), a través del cual estudiamos apoptosis inducida por CLIC4 caída. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido y microscopio de fluorescencia normal en detalle y también Comparar con otros métodos.
Introduction
Rh123 es un colorante catiónico de la fluorescencia, que sirve como un indicador de potencial transmembrana. Rh123 es capaz de penetrar la membrana celular y entrar en la matriz mitocondrial dependiendo de la diferencia de potencial dentro y fuera de la membrana1. Apoptosis lleva a daño de la integridad de la membrana mitocondrial. El poro de transición de permeabilidad de mitocondria (MPTP) abrirá y conducir al colapso de la MMP, que a su vez resulta en la liberación de Rh123 hacia el exterior de la mitocondria. Por último, se detectarán más fuerte señal de fluorescencia verde bajo microscopio de fluorescencia. Está bien documentado que el agotamiento de la RPP y la permeabilidad de la membrana elevada son signos tempranos de la célula apoptosis2. Por lo tanto, Rh123 puede aplicarse para la detección del cambio MMP y la aparición de apoptosis de las células.
Como el 6 º carcinoma más común en el mundo, cáncer de cabeza y cuello deteriora gravemente de salud3 de una persona. Aunque muchos enfoques fueron desarrollados en los últimos años, resultado clínico del tratamiento para pacientes con carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es todavía no es lo ideal4. Explorar nuevos métodos terapéuticos puede mejorar el tratamiento de HNSCC5. Canales iónicos que implica numerosos procesos biológicos muestran un papel importante en el desarrollo de cánceres diferentes6. Participación total o parcial de los canales de Cl– están altamente implicados en varias propiedades de transformación neoplásica incluyendo migración activa, alta tasa de proliferación e invasividad. A la luz de esto, el CLIC, una familia de proteínas novela, ha sido incluido como una prometedora clase de dianas terapéuticas para el cáncer tratamiento6,7. Estudios recientes han revelado que los miembros de la familia CLIC incluyendo CLIC1, CLIC4 y CLIC5, localización a mitocondrial cardíaco y el nivel de (ROS) las especies reactivas del oxígeno es upregulated por CLIC5, indicando el papel funcional de mitocondrial ubicado Cl - canales en la respuesta apoptótica del8. CLIC4, uno de los miembros de la familia CLIC (también conocido como mtCLIC, P64H1 y RS43), ha sido más ampliamente estudiada por sus propiedades de regulación apoptótica en las células cancerosas y localización subcelular como Golgi, retículo endoplasmático y mitocondria en humanos queratinocitos7,9,10. El perfil de expresión de CLIC4 fue regulado por el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el P53 y el estímulo externo. Sobreexpresión y downregulation de CLIC4 desencadenan una respuesta apoptótica principalmente a través de la vía mitocondrial junto con el desequilibrio de los miembros de la familia Bcl-2 activación de la cascada de caspasas y la liberación de citocromo C11, 12 , 13. por lo tanto, medida de MMP es crucial para explorar CLIC4 relacionados con apoptosis y Rh123 sirve como un indicador de fluorescencia ideal.
El presente estudio describe un protocolo detallado para la detección de MMP para estudiar CLIC4 precipitación inducida por la apoptosis en células de HN4. Rh123 se utiliza como sonda de fluorescencia para observar el cambio de la MMP. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, la fluctuación en tiempo real de la MMP puede resolverse. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia en detalle y también Comparar con otros métodos. Este protocolo también se puede aplicar a otros estudios relacionados con la apoptosis.
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Protocol
1. cultura y transfección de la célula
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Cultivo de células
Nota: HN4, una línea celular HNSCC, fue derivado de pacientes con HNSCC14.- Células en cultivo HN4 en de Dulbecco modifican Eagle suplementado (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero fetal bovino y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina). Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
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Transfección de la célula
- Un día antes de la transfección, la placa de 5 x 105 células en 2 mL/pozo del medio de cultivo sin antibióticos en placas de 6 pocillos.
- Diluir 100 pmol CLIC4 siRNA o SiRNA codificado en 250 μl de medios suero reducido, suavemente. Diluir 5 μl de reactivo de liposomas en 250 μl de medios suero reducido incubar por 5 min combinan el siRNA diluido con el reactivo de liposomas diluido, mezclar suavemente e incubar por 20 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla a cada uno que también contiene las células y el medio. Mezclar suavemente, meciendo la placa y hacia atrás. Incube las células a 37 ° C en un incubador de CO2 durante 24 h antes de proceder con el siguiente procedimiento de etiquetado Rh123. Reemplazar el medio de medio de cultivo normal 4 h después de transfección.
2. Rh123 etiquetado
Nota: Rh123 fue utilizado para medir la MMP en HN4 células1.
- Después del tratamiento de siRNA CLIC4 (sección 1), utilice HN4 células en placas de 6 pocillos para el siguiente tratamiento. La cantidad de células HN4 en cada bien es suficiente para repetir el experimento 10 veces en cubreobjetos.
- Utilice unas pinzas para poner cubreobjetos circulares en la parte inferior del nuevo pozo de 12 placas. El número de placas se establece según el diseño experimental (figura 1A).
- Colocar 150 μL de 100 μg/mL polylysine en el centro de cada cubreobjetos dentro de las placas de 12 pozos y espere 2 minutos presta atención a no poner polylysine fuera el cubreobjetos. Luego extraiga polylysine por pipeta cuidadosamente (figura 1B).
- Retire el medio de cultivo de las células HN4 dentro del plato y agregue tripsina de 0.25% de 1 mL para separar las células. Después de 6 minutos, añadir 2 mL medio de cultivo para la neutralización de la tripsina. Mezclar suavemente las células HN4 por pipeta 5 veces y semillas 2-6 х 104 células sobre cubreobjetos circular. Coloque en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 (figura 1C).
- Después de 8 h de incubación, incubar las células HN4 con 2 μmol/L Rh123 durante 40 min a 37 ° C. Mezclar suavemente la media hacia arriba y abajo varias veces para asegurar la distribución uniforme de Rh123 en el medio (figura 1D).
- Prepare suficiente solución salina normal (NPS); para hacer NPS (en mmol/L): NaCl 140, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glucosa 10 y 5 HEPES, pH 7,4). Precaliente a 37 ° C en un baño de agua.
- Utilice unas pinzas para quitar el cubreobjetos y lavar el resto líquido vía brevemente, colocar el cubreobjetos en el búfer de NPBS precalentado (figura 1E).
- Coloque el cubreobjetos en el fondo de la cámara de acero inoxidable de 500 μl (véase Tabla de materiales) con un fondo de cubreobjetos de vidrio reemplazable 25 mm sellado en lugar por un anillo. Fijar enroscando la tapa de la cámara (figura 1E).
- Añadir 450 μl precalentar el buffer de NPS a la cámara montada y poner el baño en el campo visual del microscopio de fluorescencia o de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia (figura 1E).
3. detección de la MMP
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Microscopio de fluorescencia común
- Encienda el microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: Microscopio de fluorescencia común fue logrado con una mercurio lámpara fibra óptica fuente de luz, un filtro FITC para Rh123 (480/40 filtro de la excitación, 505 espejo dicroico LP y filtro de emisión 535/40) a temperatura ambiente. Objetivo 20 X se utiliza para realizar proyección de imagen de células vivas. - Abra el software de sistema de proyección de imagen y seleccione el botón "Nuevo" de la barra de comandos para iniciar un nuevo experimento (figura 2A).
- Ajustar el campo de visión y el enfoque para encontrar la ubicación de las células en luz blanca.
- Apagar la luz y el botón para cerrar la luz blanca. Haga clic en el botón de "Enfoque" de la barra de comandos y seleccione "Empezar centrando" para activar la fluorescencia. Encontrar la ubicación de las células a través de microscopio con una excitación 507 de nm y de emisión de pase largo de 529 nm longitud de onda (Set antes del experimento). Ajuste el campo de visión y enfoque otra vez si es necesario (figura 2B).
- Seleccione un campo de visión sólo 20 a 30 células de HN4 separados. El cambio de la señal de fluorescencia intracelular para cada celda se registrarán con precisión.
- Una vez que se consigue un campo visual claro, haz clic en "Muy centrado" en la barra de enfoque. Haga clic en la "Acq uno" de la barra de comandos para la adquisición de un conjunto de imágenes. Haga clic en "Regiones" de la barra de comandos y haga clic en el botón "Aceptar" para editar regiones de medición.
Nota: En la barra de editar región, formas diferentes de la región se pueden utilizar dependiendo el estudio. - Para aplicar para las diferentes formas de células individuales, seleccione la herramienta "Trace región" círculo de la región de una sola célula y haga doble clic cuando haya terminado. Repita el procedimiento hasta que todas las células están en un círculo (figura 2C). Haga clic en "Done" y seleccione "Guardar imágenes" para encontrar la ubicación guardada.
- Haga clic en "Zeroclock"y rápidamente Presione F4 para iniciar el monitoreo del cambio de intensidad de fluorescencia. El tiempo real de registro cambio de intensidad de fluorescencia una vez cada 5 s durante 5 minutos (figura 2D).
- Cuando la línea de base estable, añadir 50 μl NPS mezclan con 0,5 μl de 100 mmol/L ATP a la cámara a través de la pipeta. Recuerde no tocar la cámara para evitar eliminar el campo visual (figura 2E).
Nota: La imagen de fluorescencia se registrarán por 20 min y luego el experimento puede terminar mediante operación manual. La duración es habitualmente colocada por 20 min para observar todo el cambio de fluorescencia. Sin embargo, se aplica operación manual para detener la captura cuando factores inesperados influyen en la estabilidad de la curva o cuando todo el proceso toma menos de 20 minutos.
- Encienda el microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante.
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Microscopio de la fluorescencia láser confocal
- Abra en el láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante y el software incluido.
Nota: Aquí, Rh123 fue excitado por un láser de argón de 488 nm y la señal emitida se registró sobre la gama de 545-700 nm a través de la aplicación del filtro TD488/543/633. - Haga clic en "Objetivo" en el menú de "Adquirir" para seleccionar 63 X / 1.4 N.A. aceite objetivo. Observar a la muestra y encontrar un claro campo de visión en el campo de la luz.
- Pulse el botón de "TL/IL" para cambiar al modo de fluorescencia y seleccione los filtros de fluorescencia correcta para encontrar la ubicación de la celda en la oscuridad a través de microscopio. Empuje el "Disparador" para proteger a la pieza terminada la observación.
- Bajo el menú "Adquisición", ajuste el canal de pago adecuado y haga clic en "Obtener" para activar el camino óptico colocado (figura 3A). Haga clic en el menú de "Configuración" y elija "Laser" para determinar el tipo de láser necesarios. "Argón" se recomienda para este protocolo (figura 3B).
- Haga clic en "Live" para obtener la imagen en tiempo real y asegúrese de que el campo visual contiene sólo 20 a 30 células de HN4 separadas. El cambio de la señal de fluorescencia intracelular para cada celda se registrarán con precisión.
- Seleccione "xyt" en el modo de adquisición en el submenú de "Adquisición" del menú "Adquisición" (figura 3C). Set 5 s y 20 min de intervalo de tiempo y duración, respectivamente. Haga clic en"aplicar" cuando se colocan todos los parámetros.
- En el menú de "Cuantificar", utilice la herramienta "Dibujar polilínea" al círculo el área de grabación de cada célula. Seleccione "Perfil de línea" y seleccione "Start" para llevar a cabo la observación. Registrar el cambio en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia durante 5 minutos (figura 3D - E).
- Cuando la línea de base estable, añadir 50 μl NPS mezclan con 0,5 μl de 100 mmol/L ATP a la cámara a través de la pipeta. Recuerde no tocar la cámara para evitar eliminar el campo visual.
Nota: La imagen de fluorescencia se registrarán por 20 min y luego se completa el experimento.
- Abra en el láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante y el software incluido.
4. estadístico análisis
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Microscopio de fluorescencia común
- Encienda el microscopio de fluorescencia habitualmente siguiendo el manual del operador. Abra el software de sistema de proyección de imagen y seleccione el botón "Abrir" en la barra de comandos para abrir un experimento guardado. Haga clic en "Regiones" de la 'barra' y haz clic en el botón "OK" para editar regiones de medición.
- Seleccione la herramienta de "Región del rastro" y la región de una sola célula del círculo y haga doble clic en finalizado. Repita el procedimiento hasta que todas las células han sido en un círculo. Haga clic en "Done" y seleccione el "F4: adelante" botón para obtener una traza que muestra la intensidad de la fluorescencia.
- Una vez terminado, haga clic en el botón de flecha hacia abajo situado en la esquina inferior derecha del gráfico y haga clic en "Mostrar gráfico de datos" (figura 2F). Haga clic en "Aceptar" dos veces y elija el botón "Datos de registro" para abrir la interfaz de software de procesamiento de datos. Encuentre que los registros de la fluctuación del tiempo real de la intensidad de la fluorescencia aparecen en la hoja de cálculo y haga clic en "Datos de registro" otra vez.
Nota: Para cada célula, cambios en MMP fueron exhibidos como el cociente de la fluorescencia en relación con la intensidad antes de la aplicación de ATP o TG (F0/F1). Cada dato de la intensidad de la fluorescencia fueron la media de 20-30 células. Datos para Rh123 se presentan como media ± SE. resultados de los 2 grupos se analizaron por la prueba de dos colas independientes t y el valor de P < 0.05 se consideró como significación estadística. Software de análisis estadístico fue aplicado para realizar los análisis estadísticos en este experimento.
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Microscopio de la fluorescencia láser confocal
- Encienda el microscopio láser confocal y entra en el paquete de software siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Seleccione el "Fuego" para abrir un experimento grabado.
- Seleccione la herramienta "Perfil de la pila" en el menú de "Cuantificar", elegir "todo en uno" de "Tablas de clasificación por canales y ROIs."
- Utilice la herramienta "Draw polygon" para las regiones de la célula de círculo para la observación.
- Seleccione el menú "Gráfico" y haga clic en el botón derecho del ratón y elija "Exportar a excel" para agregar los valores de intensidad fluorescente a una hoja de cálculo. El siguiente análisis es consistente con los microscopios de fluorescencia normal (figura 3F).
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Representative Results
En el presente estudio, se aplicó Rh123 para detectar la MMP. Inicialmente, las células HN4 fueron cultivadas para la fluorescencia siguiente experimentos de tinción. Pinzas se usaron para colocar cubreobjetos circulares en la parte inferior de las placas de 6 pocillos (figura 1A). El cubreobjetos se cubrieron con polylysine durante 5 minutos y luego se retira el polylysine mediante pipeta (figura 1B). Entonces las células HN4 se tripsinizaron y sembradas en el cubreobjetos colocado en la parte inferior de las placas de 6 pozos. A continuación, la cantidad apropiada de Rh123 fue agregada y mezclada bien (figura 1C-D). Después de lavar el NPS precalentado, el cubreobjetos fue montado en la cámara de visión. Se agregó la cantidad apropiada de NPS para el siguiente experimento (figura 1E).
Después del procedimiento de tinción Rh123, la común microscopio de fluorescencia y confocal microscopio fueron utilizados para registrar la fluorescencia Rh123 en tiempo real con diferentes pasos y el software. Para el microscopio de fluorescencia común, se activó el software de imágenes para crear un nuevo experimento. La persiana se abrió para mostrar la luz de la fluorescencia verde y el enfoque y la ubicación fueron ajustados para obtener un campo visual apropiado. Después de tomar una imagen de la célula, se utilizaron las herramientas de seguimiento de forma para dibujar la región de cada célula y luego registrar el cambio de fluorescencia. Una vez que la línea de base se convirtió en estable, ATP fue añadido en la cámara para provocar la despolarización de la membrana mitocondrial. En el experimento de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia, el software incluido se abrió y se estableció un camino óptico adecuado. Después de que la fuente de luz de argón fue elegida, nos ajustar el enfoque y la posición de la cámara para lograr una visual clara de las formas de la célula en la pantalla. El modo de escaneo "xyt" fue seleccionado y se aplicó la herramienta "Draw polygon" para la región de la célula para registrar el cambio de fluorescencia dentro de cada célula del círculo. Para analizar los datos en bruto, F0 era el valor de la intensidad de fluorescencia antes de la aplicación de ATP y F1 era el valor máximo de intensidad de fluorescencia después de la aplicación de ATP. F1/F0 se utilizó para evaluar la despolarización de la membrana mitocondrial (figura 2 y figura 3). B de la figura 4y figura 5B, fueron elevados los niveles de intensidad fluorescente siguiendo el tratamiento de la ATP y disminución de regreso a la línea de base después de unos 10 minutosC de la figura 4y figura 5C demuestran claramente que el pico de intensidad de fluorescencia de Rh123 fue mayor en el grupo bajo tratamiento siRNA CLIC4 que en grupo control. Figura 4 Y figura 5A Mostrar imágenes representativas del cambio fluorescente en cada etapa. En comparación con el microscopio de fluorescencia común, el microscopio confocal obtiene una mayor calidad de imagen, mitocondrias y núcleo de la célula. Sin embargo, al comparar los datos de los dos métodos, no encontraron diferencias significativas fueron. Resultados de microscopio confocal y de fluorescencia demostraron eso caída de despolarización de la membrana mitocondrial inducida por el ATP CLIC4 mejorado en HN4 células (figura 4 y figura 5).
Figura 1 . Etiquetado Rh123. Pinzas (A) se usaron para colocar cubreobjetos circulares en la parte inferior de las placas de 6 pozos. (B) capa cubreobjetos con polylysine mediante pipeta por 5 min y finalmente succión nuevamente dentro de la pipeta para extraer la polylysine. HN4 (C) las células fueron sembradas sobre el cubreobjetos en el fondo de las placas de 6 pozos. (D) agregar una cantidad adecuada de Rh123 y mezcla bien. (E) lavar los cubreobjetos con las CCNN precalentadas y montaje de la cámara con una cantidad adecuada de NPS para el siguiente experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Pasos para supervisar en tiempo real fluctuación de fluorescencia Rh123 común microscopio de fluorescencia. (A) abrir un nuevo experimento. (B) iniciar centrándose y elegir un adecuado campo visual bajo fluorescencia. (C) usando las "regiones" de la herramienta de la barra de comandos para editar regiones de observación. (D) hacer click en "Cero reloj" y rápidamente Presione F4 para iniciar el monitoreo del cambio de intensidad de fluorescencia. (E) adición de ATP (100 μmol/L) para desencadenar la despolarización de la membrana mitocondrial después de la línea de base es estable. (F) una vez finalizado el experimento, haga clic en la flecha hacia abajo situada en la esquina inferior derecha del gráfico de la exportación de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Pasos para monitorear en tiempo real fluctuación de Rh123 fluorescencia por láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia. (A) Seleccione el canal de pago y sistema de un rango de longitud de onda adecuada dentro del menú "Adquisición". (B) seleccionar el tipo correcto de "Laser disponible actual" y establecer su poder. (C) elegir "xyt" observando el modo y establecer una serie de parámetros de grabación. (D) elegir las herramientas de "Perfil de la pila" y "Todo en uno" de "Tablas de clasificación por canales y ROIs." (E) se utiliza el herramienta "Dibujar polígono" al círculo de la región de la célula para los datos en tiempo real. (F) exportar los valores de intensidad fluorescente al software de procesamiento de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Efecto de caída CLIC4 en la despolarización de la membrana mitocondrial inducida por el ATP resuelve común microscopio de fluorescencia en células HN4. (A) imágenes representativas de la fluctuación de la fluorescencia para Rh123. rastros representativos (B) y datos resumidos (C) mostrando ATP (100 μmol/L)-inducida por cambios en la célula HN4 MMP. El cambio en el potencial de membrana fue indicado por el cociente de la intensidad de fluorescencia antes y después de la aplicación de ATP. El aumento de la relación representa la despolarización del potencial de membrana. Las células HN4 fueron transfectadas con CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) o siRNA codificado (Con siRNA). Los valores se muestran como la media ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs grupo control (Con siRNA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Efecto de caída CLIC4 en despolarización de la membrana mitocondrial inducida por el ATP por láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia en células HN4. (A) imágenes representativas de la fluctuación de la fluorescencia para Rh123. rastros representativos (B) y datos resumidos (C) mostrando ATP (100 μmol/L)-inducida por cambios en la célula HN4 MMP. El cambio en el potencial de membrana fue indicado por el cociente de la densidad de fluorescencia antes y después de la aplicación de ATP. El aumento de la relación representa la despolarización del potencial de membrana. Las células HN4 fueron transfectadas con CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) o revueltos siRNA (Con siRNA). Los valores se muestran como la media ± SEM. n = 5. P < 0.05 vs grupo control (Con siRNA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Está bien documentado que Cl− canales son esenciales para mantener la hemostasia del ambiente interno y desempeñan un papel importante en la proliferación celular y apoptosis15,16. Por lo tanto, entender la relación entre la intervención orientada a canales de iones y de la apoptosis es de gran necesidad e importancia para encontrar un mejor enfoque terapéutico para diversos tipos de cáncer17. Las mitocondrias mantienen el estado biológico normal de una célula y su función altamente se relaciona con la permeabilidad de la membrana y el potencial transmembrana. Aparte de cáncer, acumula investigaciones neuropathological documentaron que anormalidades mitocondriales contribuyen a Miopatía, enfermedad cardiovascular y síntomas neurológicos incluyendo sordera neurosensorial, ataxia cerebelosa, demencia y epilepsia18,19. Todos estos han estimulado la investigación en la intervención orientada a mitocondrial con el que mejorar el tratamiento clínico. Rh123, un colorante de fluorescencia orientada en la mitocondria, puede penetrar la membrana de la célula y sirve como sonda universal fluorescencia para detectar MMP. En el estado temprano de la apoptosis celular, apertura del MPTP eleva la permeabilidad de la membrana mitocondrial que permite Rh123 ser lanzado fuera de la mitocondria y finalmente se puede detectar la señal de fluorescencia verde más fuerte. Bajo esta situación, los iones bilaterales distribuyen libremente y conducen a la rápida caída de MMP causando la disociación de la cadena de transporte de electrones y redujo la producción de ATP, que afecta gravemente el suministro de energía normal de las células. Además, la apertura del MPTP provoca la salida de compuestos bioactivos de pro-apoptóticas como el citocromo C, apoptosis induce factor apoptotic protease activación factor-1 y ROS y finalmente conduce a apoptosis irreversible20,21 .
ATP puede inducir la despolarización de la membrana mitocondrial como se demuestra por la elevada fluorescencia de Rh123. Comparando la despolarización de la membrana mitocondrial inducida por el ATP de las células bajo diferentes tratamientos, es posible descifrar la función biológica del cambio en la mitocondria y el grado y estado de apoptosis22. Común microscopio de fluorescencia y confocal láser de barrido microscopio de fluorescencia pueden lograr monitoreo en tiempo real de RPP a través de la fluctuación de la intensidad de fluorescencia de Rh123 la grabación, pero ventajas y limitaciones de ambos métodos necesitan ser considerado. Comparado con el microscopio de fluorescencia común, las imágenes captadas por láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia tienen mayor resolución y calidad. Por lo tanto, se pueden visualizar más detalles subcelulares. Además, disminuye los efectos de la luz Cruz-charla cuando se utilizan varios colorantes de fluorescencia. Por lo tanto, el microscopio confocal precisamente puede grabar la fluctuación de fluorescencia a tiempo real de Rh123 y reflejar la actividad biológica celular real. Sin embargo, nuestros métodos de seguimiento RPP necesitan grabar continuamente durante un tiempo relativo y se puede producir una serie de citotoxinas, como único oxígeno y ROS, bajo la radiación de láser hacia la célula daños23. Por otra parte, intensidad de láser de alta generalmente causa decoloración de los tintes de la fluorescencia durante la exploración continua24. Por el contrario, el microscopio de fluorescencia común no puede tomar imágenes de alta calidad como el microscopio confocal, pero no tiene los efectos adversos mencionados y así hace mucho tiempo de grabación posible. Comparando nuestros datos de común microscopio de fluorescencia y confocal microscopio no diferencia obvia podría ser encontrada, que indica que el microscopio de fluorescencia común es lo suficientemente competente como para monitorear la fluctuación de las MMP, así como Análisis de datos rentable y más conveniente. HN4 células fueron sembradas en cubreobjetos antes del experimento. Aunque polylysine se aplica para mejorar el accesorio para celular, una pequeña fracción de las células todavía desconectada del cubreobjetos y funcionamiento áspero conduce a la debilitación de la viabilidad celular. Además, agregar Rh123 o ATP en la cámara, debe tener cuidado para no tocar la cámara y el cubreobjetos.
Además Rh123 DioC6, JC-1 y tetrametil rodamina metil éster (TMRM) son tintes fluorescencia que pueden ser utilizados para detectar la MMP. En lugar de grabación en tiempo real a través de microscopio, citometría de flujo también puede realizar esta tarea. Sin embargo, el cambio en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia de la grabación con el microscopio es más conveniente descubrir la actividad biológica celular y generar imágenes intuicionistas, dando resultados más confiables.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Le rogamos gracias a Sr. Chao Fang para el cultivo celular. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias naturales de China (Grant no. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Destacado investigador joven de la Universidad médica de Anhui; Apoyo a programa de excelentes talentos jóvenes en las universidades de la provincia de Anhui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
