Summary
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 应用罗丹明123识别线粒体膜电位 (基质) 和研究 CLIC4 击倒诱导 HN4 细胞凋亡的体外。在普通荧光显微镜和共聚焦激光扫描荧光显微镜下, 记录了基质金属蛋白酶的实时变化。
Abstract
线粒体膜电位的耗竭 (基质金属蛋白酶, ΔΨm) 被认为是凋亡级联的最早事件。它甚至发生在核凋亡特征之前, 包括染色质凝结和 DNA 断裂。一旦基质细胞崩溃, 癌细胞的凋亡就会不可逆转地启动。一系列的亲脂阳离子染料可以通过细胞膜和聚集在线粒体基质内, 作为荧光标记来评价基质金属蛋白酶的变化。CLIC4 作为 Cl 胞内通道 (点击)家族的六名成员之一, 主要通过线粒体通路参与细胞凋亡过程。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 通过监测罗丹明 123 (Rh123) 的荧光涨落来测量基质, 通过它, 我们研究 CLIC4 的凋亡诱导。本文详细讨论了共焦激光扫描和正常荧光显微镜的优点和局限性, 并与其它方法进行了比较。
Introduction
Rh123 是一种阳离子荧光染料, 可作为跨膜电位的指标。Rh123 能够穿透细胞膜, 进入线粒体基质, 这取决于细胞膜内外电位的差异1。细胞凋亡导致线粒体膜完整性受损。线粒体通透性过渡孔隙 (MPTP) 将打开并导致基质细胞的崩溃, 从而使 Rh123 释放到线粒体的外部。最后, 在荧光显微镜下检测出更强的绿色荧光信号。有充分的证据表明, 细胞凋亡和高膜通透性的减少是2的早期迹象。因此, Rh123 可用于检测基质金属蛋白酶的变化和细胞凋亡的发生。
头颈癌作为世界上第六大常见的癌症, 严重恶化了一个人的健康3。虽然近年来发展了许多方法, 但治疗头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 患者的临床疗效仍不理想4。探索新的治疗方法可以提高 HNSCC5的治疗效果。涉及许多生物过程的离子通道在不同的癌症的发展中显示了重要的作用6。氯离子通道的部分或全部参与高度参与了肿瘤转化的各种性质, 包括主动迁移、高增殖率和侵袭性。有鉴于此, 新的蛋白质家族点击已被列为癌症治疗6、7治疗靶点。最近的研究表明, 点击家族的成员, 包括 CLIC1, CLIC4 和 CLIC5, 定位到心脏线粒体和活性氧 (ROS) 水平上调的 CLIC5, 表明线粒体定位 Cl的功能作用-在凋亡反应中的通道8。CLIC4, 点击家族的一个成员 (也称为 mtCLIC, P64H1 和 RS43), 已被广泛研究, 其凋亡调节性质的癌细胞和亚细胞位置, 包括高尔基, 内质网和线粒体的人角质细胞7,9,10。CLIC4 的表达谱由肿瘤坏死因子α (TNF α)、P53 和外部刺激调节。CLIC4 的过度表达和下调引起的凋亡反应主要是通过线粒体通路伴随 Bcl-2 家族成员的不平衡, 活化 caspase 叶栅和释放细胞色素 C11,12,13. 因此, 基质金属蛋白酶的测量对探讨 CLIC4-related 细胞凋亡至关重要, Rh123 是理想的荧光指标。
本研究描述了一个详细的协议, 以检测基质干细胞研究 CLIC4 击倒诱导凋亡的 HN4 细胞。Rh123 用作荧光探针观察基质金属蛋白酶的变化。在普通荧光显微镜和共聚焦激光扫描荧光显微镜下, 可解决该基质金属蛋白酶的实时波动。本文详细讨论了共焦激光扫描荧光显微镜的优点和局限性, 并与其他方法进行了比较。该协议也可应用于其他与凋亡相关的研究。
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Protocol
1. 细胞培养和转染
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细胞培养
注: HN4, HNSCC 细胞系, 来源于 HNSCC14的患者。- Dulbecco 修饰鹰培养基中的培养 HN4 细胞 (DMEM, 4.5 克/升葡萄糖) 补充10% 胎牛血清和抗生素 (100 毫升/ml 青霉素和100µg/毫升链霉素)。孵育细胞在37°c 与 5% CO2。
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细胞转染
- 在转染前的一天, 5 x 105细胞在2毫升/井培养基中没有抗生素的 6-井板。
- 稀释 100 pmol CLIC4 siRNA 或炒 siRNA 在250µL 减少血清介质, 轻轻地。稀释5µL 脂质体试剂250µL 减少血清培养基和孵育5分钟. 将稀释后的 siRNA 与稀释脂质体试剂结合, 轻轻搅拌, 室温下孵育20分钟。
- 将混合物添加到每个含有细胞和培养基的井中。轻轻摇动盘子来回搅拌。在进行以下 Rh123 标记程序之前, 在 CO2孵化器中孵化37摄氏度的细胞, 24 小时。转染后用正常生长培养基4小时替换培养基。
2. Rh123 标签
注: Rh123 用于测量 HN4 细胞中的基质金属蛋白酶1。
- CLIC4 siRNA 治疗后 (1 节), 在6井板中使用 HN4 细胞进行以下治疗。每个井中 HN4 细胞的数量足以在盖玻片上重复实验10次。
- 用镊子将圆形盖玻片放在新的12井板的底部。板的数量是根据实验设计 (图 1A) 设置的。
- 把150µL 100 µg/毫升多聚赖氨酸在每个盖玻片中间的12井板和等待2分钟. 注意不要把多聚赖氨酸放在盖玻片外面。然后 pipettor 彻底删除多聚赖氨酸 (图 1B)。
- 去除皿内 HN4 细胞的培养基, 加入1毫升0.25% 胰蛋白酶分离细胞。6分钟后, 加入2毫升培养基以中和胰蛋白酶。将 HN4 细胞通过 pipettor 轻轻混合5次, 在圆形盖玻片上种子 2-6 х 104细胞。安置在孵化器在37°c 与 5% CO2 (图 1C)。
- 8小时孵化后, 用2µmol/升 Rh123 HN4 细胞孵化37摄氏度40分钟。轻轻地混合中上下几次, 以确保均匀分布在介质中的 Rh123 (图 1D)。
- 准备足够的正常的生理盐水溶液 (NPSS);使 NPSS (在毫摩尔中): 140 氯化钠, 5 氯化钾, 1 氯化镁2, 1 CaCl2, 10 葡萄糖, 5 HEPES, pH 7.4)。在水浴预热到37摄氏度。
- 使用镊子去除盖玻片和洗涤剩余的液体通过简要地安置盖玻片入预热的 NPBS 缓冲 (图 1E)。
- 将盖玻片放在500µL 不锈钢腔的底部 (见材料表), 可更换的25毫米玻璃盖玻片底部密封到位的 o 形环。通过收紧房间的盖子来修复它 (图 1E)。
- 将450µL 预热的 NPSS 缓冲器添加到组装腔内, 在荧光显微镜或共聚焦激光扫描荧光显微镜 (图 1E) 的视野下放置浴缸。
3. 检测基质金属蛋白酶
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普通荧光显微镜
- 按照制造商的说明打开荧光显微镜。
注: 共用荧光显微镜完成了汞灯光纤光源, 一个 FITC 过滤器设置为 Rh123 (480/40 励磁过滤器, 505 LP 分色镜和535/40 排放过滤器) 在室温下。20X. 目标被用来进行活细胞成像。 - 打开成像系统软件, 从命令栏中选择 "新建" 按钮开始新的实验 (图 2a)。
- 调整可视字段和焦点以在白光中查找单元格的位置。
- 关灯, 按按钮关闭白光。单击命令栏上的 "焦点" 按钮, 然后选择 "开始聚焦" 以打开荧光。通过显微镜再发现细胞的位置与507毫微米励磁和529毫微米长的通行证发射波长 (在实验之前设置)。如果需要, 调整可视字段并重新对焦 (图 2B)。
- 选择一个仅包含20到30个分离的 HN4 单元格的可视字段。每个细胞的细胞内荧光信号的变化将被准确记录。
- 一旦实现了清晰的可视字段, 请单击焦点栏上的 "关闭焦点"。从命令栏中单击 "Acq 一" 以获取一组图像。单击命令栏中的 "区域", 然后单击 "确定" 按钮编辑度量区域。
注意: 从编辑区域栏, 不同的区域形状可以根据研究而使用。 - 若要适合单个单元格的不同形状, 请选择 "跟踪区域" 工具, 并在单个单元格区域中循环并在完成后双击。重复该过程, 直到所有单元格都被圆圈 (图 2C)。单击 "完成" 并选择 "保存图像" 以查找保存的位置。
- 点击 "Zeroclock", 快速推 F4 开始监测荧光强度的变化。每5秒记录一次荧光强度的实时变化5分钟 (图 2D)。
- 当基线趋于稳定时, 将50µL NPSS 与0.5 µL 100 毫摩尔/升 ATP 混合在一起, 通过 pipettor。记住不要触摸房间以避免删除视觉领域 (图 2E)。
注: 荧光图像将记录20分钟, 然后实验可以通过手动操作结束。时间期限通常被安定为20分钟为了观察整个荧光变化。然而, 当意想不到的因素影响曲线的稳定性时, 或当整个过程少于20分钟时, 就应用了手动停止捕获的操作。
- 按照制造商的说明打开荧光显微镜。
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共焦激光扫描荧光显微镜
- 根据制造商的说明打开共焦激光扫描荧光显微镜, 并开启捆绑的软件。
注: 在这里, Rh123 是兴奋的氩激光设置在 488 nm 和发射的信号是记录在 545-700 nm 的范围内通过应用的 TD488/543/633 过滤器。 - 点击 "获取" 菜单下的 "目标", 选择 63 x/1.4 油物镜。观察标本, 在光场下找到一个清晰的视野。
- 按下 "TL/IL" 按钮切换到荧光模式, 并选择正确的荧光过滤器, 以找到在黑暗中的细胞的位置, 通过显微镜。当观察完成时, 按 "快门" 来保护标本。
- 在 "获取" 菜单中, 调整合适的 PMT 通道并单击 "实现" 以激活已结算的光路径 (图 3A)。点击 "配置" 菜单, 选择 "激光" 来确定所需的激光类型。本协议建议使用 "氩气" (图 3B)。
- 单击 "实时" 以获取实时图像, 并确保可视字段仅包含20到30个分离的 HN4 单元格。每个细胞的细胞内荧光信号的变化将被准确记录。
- 在 "获取" 菜单 (图 3C) 下的 "获取" 子菜单项中, 选择 "xyt"。分别设置 5 s 和20分钟的时间间隔和工期。当所有参数都解决时, 单击 "应用"。
- 在 "量化" 菜单下, 使用 "绘制折线" 工具环绕每个单元格的记录区域。选择 "线条轮廓", 然后选择 "开始" 进行观察。记录荧光强度的实时变化为5分钟 (图 3D E)。
- 当基线趋于稳定时, 将50µL NPSS 与0.5 µL 100 毫摩尔/升 ATP 混合在一起, 通过 pipettor。切记不要触摸房间, 以免移除视野。
注: 荧光图像将记录20分钟, 然后完成实验。
- 根据制造商的说明打开共焦激光扫描荧光显微镜, 并开启捆绑的软件。
4. 统计分析
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普通荧光显微镜
- 按照操作员的手册, 定期打开荧光显微镜。打开成像系统软件, 然后从命令栏中选择 "打开" 按钮以打开保存的实验。单击 "命令栏" 中的 "区域", 然后单击 "确定" 按钮编辑度量区域。
- 选择 "跟踪区域" 工具, 然后在单个单元格区域中循环, 完成后双击。重复该过程, 直到所有单元格都已被圆圈。单击 "完成" 并选择 "F4: 向前" 按钮以获得显示荧光强度的痕迹。
- 完成后, 单击位于图表右下角的向下箭头按钮, 然后单击 "显示图形数据" (图 2F)。单击 "确定" 两次, 然后选择 "日志数据" 按钮打开数据处理软件的接口。再次点击 "记录数据", 发现电子表格上出现荧光强度实时波动的记录。
注: 对于每个细胞, 在应用 ATP 或 TG (F1/F0) 之前, 基质的变化显示为荧光相对于强度的比值。每个荧光强度数据平均为 20-30 细胞。Rh123 的数据显示为平均值. 2 组的结果由双尾独立t检验和P值 < 0.05 被认为是统计学意义。采用统计分析软件进行统计分析。
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共焦激光扫描荧光显微镜
- 打开共焦激光显微镜, 并按照制造商的说明登录到捆绑的软件。
- 选择 "开火" 打开录制的实验。
- 选择 "量化" 菜单下的 "堆栈配置文件" 工具, 选择 "全部在一个" 从 "按通道和 ROIs 排序图表"。
- 使用 "绘制多边形" 工具来圆细胞区域进行观察。
- 选择 "图形" 菜单, 然后单击鼠标右键, 然后选择 "导出到 excel", 将荧光强度值添加到电子表格中。下面的分析与正常的荧光显微镜 (图 3F) 是一致的。
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Representative Results
在本研究中, Rh123 用于检测基质金属蛋白酶。最初, HN4 细胞被培养为以下荧光染色实验。用镊子将圆形盖玻片放在6井板的底部 (图 1A)。盖玻片涂上多聚赖氨酸5分钟, 然后通过 pipettor 去除多聚赖氨酸 (图 1B)。然后, HN4 细胞被 trypsinized, 并在被放置在6井板底部的盖玻片上播种。接下来, 添加适量的 Rh123, 混合井 (图 1C D)。用预热后的 NPSS 洗涤后, 盖玻片被装配进了观景室。为以下实验添加了适当的 NPSS 量 (图 1E)。
在 Rh123 染色的过程中, 采用共用荧光显微镜和共聚焦显微镜, 用不同的步骤和软件记录实时 Rh123 荧光。对于普通荧光显微镜, 成像软件被打开, 以创建一个新的实验。打开快门, 以显示绿色荧光光, 并调整焦点和位置, 以获得适当的视觉领域。在拍摄细胞图像后, 用形状跟踪工具绘制每个细胞的区域, 然后记录荧光变化。一旦基线变得稳定, ATP 被添加到腔内, 以触发线粒体膜的退极化。在共焦激光扫描荧光显微镜实验中, 打开捆绑软件, 设置合适的光路。在选择氩光源后, 我们调整了腔室的焦点和位置, 以实现屏幕上的细胞形状的清晰视觉。选择了 "xyt" 扫描模式, 应用 "绘制多边形" 工具对细胞区域进行循环, 记录每一个细胞内的荧光变化。为了分析原始数据, F0 是 atp 应用前荧光强度的值, F1 是 atp 应用后荧光强度的最大值。F1/F0 用于评估线粒体膜的退极化 (图 2和图 3)。从图 4b和图 5b, 荧光强度的水平在 ATP 治疗后升高, 并在大约10分钟后减少回基线.图 4c和图 5c明显表明, CLIC4 siRNA 治疗组 Rh123 荧光强度峰值高于对照组。图 4a和图 5显示了每个阶段荧光变化的代表性图像。与普通荧光显微镜相比, 共焦显微镜获得了较高的图像质量, 显示细胞核和线粒体。但是, 在比较两种方法的数据时, 没有发现显著的差异。荧光和共焦显微镜的结果表明, CLIC4 增强 ATP 诱导的线粒体膜在 HN4 细胞中的退极化 (图 4和图 5)。
图 1.Rh123 标签.(A) 用镊子将圆形盖玻片放在6井板的底部。(B) 涂盖玻片与多聚赖氨酸通过 pipettor 5 分钟, 最后吸回 pipettor, 以消除多聚赖氨酸。(C) HN4 细胞在6井板底部的盖玻片上播种。(D) 增加适量的 Rh123 和混合井。(E) 用预热过的核电站洗涤盖玻片, 并为以下实验装配适当数量的 NPSS 室。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.用普通荧光显微镜监测 Rh123 荧光实时波动的步骤。(A) 打开一个新的实验。(B) 开始聚焦, 并选择一个合适的视野下的荧光。(C) 使用命令栏中的 "区域" 工具编辑观察区域。(D) 点击 "零时钟", 快速推 F4 开始监测荧光强度的变化。(E) 增加 ATP (100 µmol/升), 在基线稳定后引发线粒体膜退极化。(F) 实验完成后, 单击图右下角的向下箭头以导出数据。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.用共焦激光扫描荧光显微镜监测 Rh123 荧光实时波动的步骤.(A) 选择 PMT 通道, 并在 "获取" 菜单下设置合适的波长范围。(B) 从 "现有激光" 中选择正确的激光类型并设置其功率。(C) 选择 "xyt" 观察模式, 并设置一系列记录参数。(D) 选择工具 "堆栈配置文件" 和 "全部在一个" 从 "按渠道和 ROIs 排序图表"。(E) 使用 "绘制多边形" 工具为实时数据循环单元区域。(F) 将荧光强度的值导出到数据处理软件中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.CLIC4 对 ATP 诱导的线粒体膜退极化的影响 HN4 细胞中常用荧光显微镜解决.(A) Rh123 的荧光涨落的代表性图像. 代表性痕迹 (B) 和总结数据 (C) 显示 ATP (100 µmol/升) 诱导的 HN4 细胞基质金属蛋白酶的变化。在 ATP 应用前后, 荧光强度的比值表明膜电位的变化。比例增加代表膜电位去极化。HN4 细胞转染 CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) 或炒 siRNA (siRNA)。值显示为 "平均" 电子扫描电镜. n = 5。*P < 0.05 vs 控制 (siRNA) 组。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.CLIC4 对 ATP 诱导的线粒体膜退极化的影响 HN4 细胞共聚焦激光扫描荧光显微镜解决。(A) Rh123 的荧光涨落的代表性图像. 代表性痕迹 (B) 和总结数据 (C) 显示 ATP (100 µmol/升) 诱导的 HN4 细胞基质金属蛋白酶的变化。在 ATP 应用前后, 荧光密度的比值表明膜电位的变化。比例增加代表膜电位去极化。HN4 细胞转染 CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) 或炒 siRNA (siRNA)。值显示为 "平均" 电子扫描电镜. n = 5。*P < 0.05 vs 控制 (siRNA) 组。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
有充分的文献表明, Cl−通道是必不可少的保持止血的内部环境, 并发挥重要作用, 细胞增殖和凋亡15,16。因此, 了解离子通道靶向干预与细胞凋亡之间的关系, 对于寻找一种更好的治疗方法对17种癌症有很大的必要性和意义。线粒体维持细胞正常的生物状态, 其功能与细胞膜通透性和跨膜电位密切相关。除了癌症, 积累病理调查记录, 线粒体异常导致肌病, 心血管疾病, 神经症状, 包括感音性耳聋, 小脑共济失调, 痴呆, 癫痫18,19。所有这些都刺激了线粒体靶向干预的研究, 以改善临床治疗。Rh123 是一种线粒体靶向荧光染料, 可以穿透细胞膜, 作为一种通用荧光探针检测基质金属蛋白酶。在细胞凋亡的早期状态下, MPTP 的开放增强了线粒体膜通透性, 允许 Rh123 在线粒体外释放, 最终可以检测出更强的绿色荧光信号。在这种情况下, 双侧离子自由分布, 导致基质的快速下降, 导致电子输运链的解耦, 降低 ATP 的产量, 严重影响了细胞的正常能量供给。此外, MPTP 的开放还会引发促凋亡生物活性化合物的流出, 包括 Cyt C、凋亡诱导因子、凋亡蛋白酶活化 factor-1 和 ROS, 最终导致不可逆转的凋亡20,21.
ATP 可诱导线粒体膜退极化, Rh123 的高荧光显示。通过比较 ATP 诱导的细胞在不同处理下的线粒体膜去极化, 可以破译线粒体变化的生物学功能和细胞凋亡22的程度和状态。普通荧光显微镜和共焦激光扫描荧光显微镜都能通过记录 Rh123 荧光强度的波动来实现对基质金属蛋白酶的实时监测, 但这两种方法的优缺点都需要考虑。与普通荧光显微镜相比, 共焦激光扫描荧光显微镜采集的图像具有较高的分辨率和质量。因此, 更多的亚细胞细节可以被可视化。另外, 在使用多种荧光染料的同时, 也减少了光交叉说话的影响。因此, 共焦显微镜可以准确记录 Rh123 的实时荧光涨落, 反映出真实的细胞生物活性。然而, 我们的监测方法需要连续记录一段相对长的时间和一系列的细胞毒素, 包括单氧和 ROS, 可能会产生在激光辐射下导致细胞损伤23。此外, 高激光强度通常会导致荧光染料在连续扫描24时褪色。相比之下, 普通荧光显微镜不能像共焦显微镜那样采用高质量的图像, 但它没有上述的不良影响, 从而使长时间记录成为可能。通过对常用荧光显微镜和共聚焦显微镜的数据进行比较, 没有明显的差异, 这表明普通荧光显微镜具有足够的能力监测基质的波动, 以及成本效益更方便的数据分析。实验前, HN4 细胞在盖玻片上播种。虽然多聚赖氨酸被应用于增强细胞的附着, 但一小部分细胞仍然脱离盖玻片和粗糙的操作导致细胞活力受损。此外, 加入 Rh123 或 ATP 进入会议厅, 应注意不要接触室和盖玻片。
除 Rh123 外, DioC6、JC-1 和四甲基罗丹明甲酯 (TMRM) 均为荧光染料, 可用于检测基质金属蛋白酶。流式细胞术不仅可以通过显微镜实时记录, 还能完成这项任务。然而, 用显微镜记录荧光强度的实时变化更适合于发现细胞生物活性, 产生直观图像, 给出更可靠的结果。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢赵先生的细胞培养。这项工作得到了中国自然科学基金的资助 (81570403、81371284号赠款);安徽省自然科学基金 (批准号: 1408085MH158);安徽医科大学优秀青年研究员;安徽省高校优秀青年人才支持方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
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