Summary
ローダミン 123 ミトコンドリア膜電位 (MMP) を識別し、CLIC4 ノックダウン誘起 HN4 細胞アポトーシスの生体外の研究の適用のための詳しいプロトコルをご紹介します。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変更が記録されました。
Abstract
ミトコンドリア膜電位 (MMP, ΔΨm) の枯渇は、アポトーシスのカスケードの最も早いイベントと見なされます。それは先に核のアポトーシス特性、chromatin の凝縮、DNA の破損なども発生します。一度 MMP 崩壊、細胞のアポトーシスは不可逆的に開始されます。脂溶性のカチオン染料のシリーズ細胞膜を通過し、ミトコンドリアのマトリックス内の集計、や MMP の変化を評価するための蛍光マーカーとして役立ちます。Cl-細胞内チャネル (CLIC) 家族の 6 人のメンバーの 1 つとして CLIC4 はミトコンドリア経路を中心に細胞アポトーシス プロセスに参加します。ローダミン 123 (Rh123) CLIC4 ノックダウンで誘導されるアポトーシスを学ぶ私たちの蛍光変動の監視を通じて MMP を測定する詳細なプロトコルについて述べる。利点および共焦点レーザー走査と詳しくは、通常の蛍光顕微鏡のアプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。
Introduction
Rh123 は、膜電位を指標として機能するカチオン性蛍光色素です。Rh123 は、細胞膜を貫通し、1膜内外の電位差によってミトコンドリアのマトリックスを入力が可能です。アポトーシスは、ミトコンドリア膜の完全性の損傷に します。ミトコンドリア透過性遷移ポア (MPTP) が開き、mmp に関しては、ミトコンドリアの外に Rh123 のリリースで、結果の崩壊に 。最後に、蛍光顕微鏡下で強い緑色蛍光シグナルが検出されます。MMP と昇格した膜の透過性の減少が細胞アポトーシス2の初期の兆候であることをも記載されています。したがって、Rh123 は、MMP の変化の検出と細胞のアポトーシスの発生に適用可能性があります。
世界の第 6 最も一般的な癌、頭頸部癌が人の健康3大幅に劣化します。多くのアプローチは、近年開発された、頭頸部扁平上皮癌 (各種) を患っている患者のための治療の治療成績はまだ理想的ではない4。新しい治療法を探る各種5の処理を改善できます。多数の生物学的プロセスを含むイオン チャネルは、さまざまな癌6の開発に重要な役割を表示します。Cl-チャンネルの一部または全部の参加は高メタアナライシス アクティブな移行、増殖、侵襲性の率が高いなどのさまざまなプロパティに関与しています。この点を踏まえて、CLIC、新規なタンパク質ファミリーを治療標的癌治療6、7のための有望なクラスとして記載されています。最近の研究が明らかにした CLIC1、CLIC4、CLIC5 など CLIC の家族のメンバーを心臓のミトコンドリアにローカライズ、活性酸素種 (ROS) レベルは、CLIC5 で誘導されるミトコンドリアにある Clの機能的役割を示す-アポトーシス応答8チャンネル。CLIC4、CLIC の家族 (として知られている mtCLIC、P64H1、および RS43) の 1 つのメンバーは、がん細胞とヒトのミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体を含む細胞レベル下の場所でアポトーシス制御プロパティの最も広く研究されています。ケラチノ サイト7,9,10。CLIC4 の発現は、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、P53 と外部からの刺激によって規制されていた。過剰発現および CLIC4 のカスケードはカスパーゼの活性化とチトクローム C11,のリリース Bcl 2 家族の不均衡を伴うミトコンドリア経路を中心にアポトーシス反応を誘発します。12,13。 したがって、MMP 測定が CLIC4 関連アポトーシスを探索することが重要で、Rh123 は理想的な蛍光インジケーターとして機能します。
本研究では、HN4 細胞における CLIC4 ノックダウンによるアポトーシス誘導を研究する MMP の検出のための詳しいプロトコルについて説明します。Rh123 は、MMP の変化を観察する蛍光プローブとして使用されます。一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で MMP のリアルタイム変動を解決可能性があります。利点および共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡詳細、アプリケーションの制限について説明し、また他の方法と比較します。このプロトコルは、他のアポトーシス関連の研究にも適用できます。
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Protocol
1. 細胞培養とトランスフェクション
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細胞培養
注: HN4、各種細胞株、各種14患者から派生しました。- ダルベッコ HN4 細胞 10% 牛胎児血清と抗生物質 (100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ) イーグル培 (DMEM、4.5 G/L グルコース) に変更。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
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細胞のトランスフェクション
- トランスフェクション、前日プレート 5 x 10 の5セル 2 mL/培地 6 ウェル プレートで抗生物質がないのです。
- 軽く 100 pmol CLIC4 siRNA または低下した血清中メディアの 250 μ L でスクランブル SiRNA を希釈します。低下した血清中メディアの 250 μ L で 5 μ L リポソーム試薬を希釈しインキュベートする 5 分結合試薬の希釈したリポソームと希釈した siRNA、優しく、ミックス、室温で 20 分間インキュベートします。
- よく細胞と培地を含む各混合物を追加します。ロッキング プレートを行ったり来たりで優しく混ぜます。次の Rh123 ラベル付けの手順に進む前に 24 h のための CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。トランスフェクション後、正常な成長媒体 4 h で媒体を置き換えます。
2. Rh123 ラベル
注: Rh123 は HN4 セル1で MMP を測定するために利用されました。
- CLIC4 siRNA の治療 (セクション 1) 後、次の治療のため 6 ウェル プレートで HN4 セルを使用します。HN4 細胞それぞれの量も 10 倍 coverslips に実験を繰り返して十分であります。
- 新しい 12 ウェル プレートの下部に円形 coverslips するのにピンセットを使用します。プレートの番号は、実験的なデザイン (図 1A) に従って設定されます。
- 12 ウェル プレート内すべての coverslip の途中 100 μ g/mL ポリリジンの 150 μ L を入れ、2 分、coverslips 外ポリリジンをかけないように注意を払うを待ちます。Pipettor、ポリリジンを徹底的に削除 (図 1B)。
- 料理中 HN4 細胞の培養液を削除し、セルをデタッチする 1 mL 0.25% トリプシンを追加します。6 分後、トリプシンを中和するために培地 2 mL を追加します。優しく円形 coverslips 上の 10 の4セル 5 回とシード 2 6 х pipettor による HN4 細胞を混ぜます。5% CO2 (図 1C) 37 ° C の定温器に配置します。
- 8 時間培養後 2 µmol/l Rh123 37 ° C で 40 分間 HN4 細胞を孵化させなさい。培地 (図 1D) で Rh123 の均一な配分を確保するため中上下数回を優しく混ぜます。
- 準備十分な通常の生理食塩液 (高);ように (でモル/L) 高: 140 塩化ナトリウム、5 5 HEPES、10 グルコース 1 CaCl21 MgCl2KCl pH 7.4)。水お風呂で 37 ° C に予熱します。
- ピンセットを使用して、coverslips を削除し、残りを洗う液体を介して簡単に、coverslips を予熱した NPBS バッファー (図 1E) に配置します。
- 500 μ L のステンレス製チャンバーの下部に、coverslips に配置 (材料の表を参照してください) 交換可能な 25 mm ガラス coverslip 底の o リングを用いる場所で密封します。商工会議所 (図 1E) の蓋を締めで解決します。
- 450 μ L 組み立て室高バッファーを予熱し、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 (図 1E) の視野下でお風呂を入れて追加します。
3. MMP の検出
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一般的な蛍光顕微鏡
- 製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を入れます。
注: 一般的な蛍光顕微鏡で水銀ランプ光ファイバー光源、FITC フィルター Rh123 のセット完了しました (480/40 励起フィルター、505 の LP ダイクロイック ミラー、535/40 排出フィルター) 室温で。20 × 対物は、住セルイメージ投射を行うためだった。 - イメージング システム ソフトウェアを開き、新しい実験 (図 2A) を開始するコマンド バーから「新規」ボタンを選択します。
- 視野と白色のセルの場所を見つけるにフォーカスを調整します。
- ライトの電源を切り、白色光を閉じるボタンをプッシュします。コマンド バーから「フォーカス」ボタンをクリックし、「開始焦点」の蛍光に切り替えるを選択します。507 nm 励起と 529 nm ロングパス発光顕微鏡を介して再び細胞の場所を見つける波長 (実験前にセット)。(図 2B) を必要に応じて視野と焦点を再度調整します。
- 視野だけ 20 に 30 で区切られた HN4 セルを含むを選択します。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。
- 明確な視野が達成されれば、フォーカス バーから「近い焦点」をクリックします。イメージの 1 つのセットを取得するコマンド バーから「Acq 1」をクリックしてします。コマンド バーから「地域」、測定領域を編集するのには「OK」ボタンをクリックしますします。
注意: リージョンの編集バーから別の地域の図形は研究によって使用できます。 - 個々 のセルのさまざまな形状に合わせて、「トレース地域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。までのすべてのセルの手順丸 (図 2C) を繰り返します。"Done"をクリックし、保存されている場所を検索する「画像を保存」を選択します。
- クリックして"Zeroclock"とすぐに蛍光強度の変化を監視を開始する f4 キーを押して。リアルタイム記録を一度すべて 5 蛍光強度の変更 5 分 (図 2D) s。
- ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールド (図 2E) を削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。
注: 20 分について蛍光画像を記録して、実験を手動操作で終了することができます。時間が 20 分間全体を観察するために日常的に決済される蛍光変化。しかし、プロセス全体の所要 20 分未満、曲線の安定性に影響を及ぼす予期せぬ要因、キャプチャを停止して手動操作が適用されます。
- 製造元の指示に従って蛍光顕微鏡を入れます。
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共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
- 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の製造元の指示に従ってを有効にし、バンドルされたソフトウェアを開きます。
注: ここでは、Rh123 は、488 に設定アルゴン レーザーによる興奮をしていた nm、出力される信号は、TD488/543/633 フィルターのアプリケーションを介して 545-700 nm の範囲にわたって記録されました。 - 63 X を選択するには、「取得」メニューの下で「客観的」をクリックして/1.4 オイル対物レンズ。標本を観察し、光のフィールドの下で明確な視野を見つけます。
- 蛍光モードに切り替え、顕微鏡を介して暗闇の下のセルの場所を見つけるために正しい蛍光フィルターを選択する「TL/IL」ボタンを押します。観測が終わったら、供試体を保護するために「シャッター」を押してください。
- 「取得」メニューの下適切な PMT チャンネルを調整し、「達成」(図 3A) 解決された光パスをアクティブにするをクリックします。「設定」メニューをクリックしてし、必要なレーザー種類を決定する「レーザー」を選択します。このプロトコル (図 3B) には「アルゴン」をお勧めします。
- "Live"のリアルタイム画像を取得し、視覚的なフィールドにのみ 20 に 30 で区切られた HN4 セルが含まれているかどうかを確認するをクリックします。各セルの細胞内の蛍光信号の変化が正確に記録されます。
- アクイジション ・ モードで「獲得」メニュー (図 3C) の下で「取得」サブメニューで「xyt」を選択します。それぞれ、時間間隔と期間、5 s と 20 分を設定してください。「適用」をクリックして"すべてのパラメーターが決済されます。
- 「数量」メニューの下には、サークルの各セルの記録領域に「ポリラインを描画」ツールを使用します。「行プロフィール」を選択し、観測を実施する「開始」を選択します。5 分 (図 3D ~ E) の蛍光強度のリアルタイムの変更を記録します。
- ベースラインが安定になると、追加の 50 μ L 高 100 ミリ モル/l ATP pipettor 経由で室に 0.5 μ L で混合します。視覚的なフィールドの削除を避けるために商工会議所を触れないように覚えています。
注: 20 分について蛍光画像を記録する実験が完了し.
- 共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の製造元の指示に従ってを有効にし、バンドルされたソフトウェアを開きます。
4. 統計解析
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一般的な蛍光顕微鏡
- 日常的に次のオペレーターのマニュアル蛍光顕微鏡を入れます。イメージング システム ソフトウェアを開き、保存されている実験を開くにコマンド バーから「開く」ボタンを選択します。「コマンド バー」から「地域」、測定領域編集するには「OK」ボタンをクリックします。
- 「トレース領域」ツールを選択して円の 1 つのセルの領域としたらダブルクリックします。手順を繰り返して、すべてのセルが囲まれています。「完了」をクリックし、選択、"F4: 前方"蛍光強度を示すトレースを取得します。
- 完了すると、グラフの右下隅にある下矢印ボタン、「グラフ データの表示」(図 2F) をクリックします。[OK] を 2 回クリックし、データ処理ソフトウェアのインターフェイスを開くには、「ログ データ」ボタンを選択します。「ログ データ」をもう一度クリックし、スプレッドシートに表示される蛍光強度のリアルタイム変動の記録を見つけます。
注: 各セルの MMP の変更された蛍光 ATP または TG (F1/F0) のアプリケーションの前に強度基準の比率として表示されます。各蛍光強度データ 20-30 セルの平均であった。Rh123 のデータは、平均 ± SE 2 グループから結果でテストした独立の両側t検定とP値として表示 < 0.05 は、統計的有意性として考慮されました。統計解析ソフトウェアは、この実験の統計分析に適用されました。
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共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡
- 共焦点レーザー顕微鏡をオンにし、製造元の指示に従って、バンドルされたソフトウェアにログインします。
- 記録された実験を開くには「火」を選択します。
- 「数量」メニューの下の「プロファイル スタック」ツールを選択し、「チャンネル ・ ロワによって並べ替えグラフ」から「オールインワン」を選択
- 観察のため円のセル領域に「多角形描画」ツールを使用します。
- 「グラフ」メニューを選択して、マウス右ボタンをクリックしてし"excel にエクスポート"を選択蛍光強度の値をスプレッドシートに追加します。以下の分析は、通常の蛍光顕微鏡 (図 3F) と一致。
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Representative Results
本研究では、Rh123 は MMP を検出に適用されました。当初、HN4 細胞以下の蛍光染色実験培養。6 ウェル プレート (図 1A) の下部にピンセット使用された円形 coverslips。Coverslips が 5 分ポリリジンでコーティングした、pipettor (図 1B) 経由でのポリリジンの削除されます。その後、HN4 細胞トリプシン, 6 ウェル プレートの底に置かれた coverslips にシード.次に、Rh123 の適切な量を追加され、混合よく (図 1C D)。予熱した高洗浄後、coverslip の視聴室に組み立てられました。高の適切な量は、以下の実験 (図 1E) を追加されました。
Rh123 染色の手順の後共通の蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡の両方は、異なる手順とソフトウェア リアルタイム Rh123 蛍光を記録する使用されました。一般的な蛍光顕微鏡イメージング ソフトウェアがオンに新しいテストを作成します。シャッターの蛍光グリーンの光のショーが開かれて、フォーカスと場所適切な視野を得るために調整されました。携帯画像を服用後形状のトレース ツールはあらゆる単一のセルの領域を描画し、蛍光の変化を記録する使用されました。ベースラインが安定した後、ATP はミトコンドリア膜の脱分極をトリガーする商工会議所に追加されました。共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡の実験では、バンドルされたソフトウェアが開かれ、適切な光パスが設定されました。アルゴン光源を選択した後、我々 はフォーカスと画面上のセル形状の明確な視覚を達成するために商工会議所の位置を調整しました。「Xyt」スキャン モードを選択した、「多角形描画」ツールすべての単一細胞内蛍光の変化を記録するセル領域サークルに適用されました。生データを解析する F0 ATP アプリケーションの前に蛍光強度の値、F1 ATP アプリケーション後の蛍光強度の最大値はだった。F1/F0 は、(図 2および図 3) ミトコンドリア膜の脱分極を評価するために使用されました。図 4B 図 5Bから蛍光強度のレベルが上昇約 10 分図 4C後ベースラインに ATP と減少の治療と図 5CRh123 の蛍光強度のピークより高かったこと CLIC4 siRNA 治療群対照群に明確に示します。図 4Aと図 5Aを各ステージの蛍光変化の代表的なイメージ。一般的な蛍光顕微鏡と比較して、共焦点顕微鏡は、細胞核やミトコンドリアを示す画像の高品質を得られます。ただし、2 つのメソッドからのデータを比較すると、有意差が見つかりませんでした。蛍光と共焦点顕微鏡からの結果は、HN4 細胞 (図 4および図 5) CLIC4 強化されたミトコンドリア膜の ATP 誘起分極の打撃を示した。
図 1.Rh123 ラベルします。(A) ピンセットを用いて 6 ウェル プレートの下部に円形 coverslips を置きます。(B) 5 分、最後に吸引バック、ポリリジンを削除する pipettor に pipettor を介してポリリジンとコーティング coverslips。(C) HN4 6 ウェル プレートの底面に coverslips に細胞を播種します。(D) Rh123 の適切な量を追加し、よく混合します。(E) と予熱した NPP coverslips を洗浄し、チャンバー内に次の実験のための高の適切な量を組み立てます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.一般的な蛍光顕微鏡による Rh123 蛍光のリアルタイム変動を監視するための手順。(A) 開く新しい実験。(B) 中心を起動し、蛍光の下で適切な視野を選択。(C) 使用「地域」は、観測地域を編集するコマンド バーからツールです。(D) は、「ゼロの時計」をクリックし、、すぐに蛍光強度の変化監視を開始する f4 キーを押していますします。(E) 追加する ATP (100 µmol/L) ベースラインが安定になった後、ミトコンドリア膜脱分極をトリガーします。(F) 実験が完了すると、データをエクスポートするのにはグラフの右下隅にある下矢印をクリックします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による Rh123 蛍光のリアルタイム変動を監視するための手順を実行します。(A) 選択 PMT チャンネルとセット「獲得」メニューの下の適切な波長範囲。(B) は、「現在使用可能なレーザー」から適切なレーザー種類を選択し、、その力を設定します。(C)「xyt」モードを観察して一連のパラメーターを記録します。(D)「チャンネル ・ ロワによって並べ替え海図」から「スタック概要"および"すべての 1 つ"ツールを選択(E) リアルタイム データに円セル領域に「描画ポリゴン」というツールを使用します。(F) データ処理ソフトウェアに蛍光強度の値をエクスポートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.HN4 細胞における一般的な蛍光顕微鏡によるミトコンドリア膜の ATP 誘起脱分極に及ぼす CLIC4 ノックダウン解決します。(A) 蛍光揺らぎ Rh123。 代表的なトレース (B) と (C) の ATP を示す集計データの代表的なイメージ (100 µmol/L)-HN4 セル MMP に変化。前に、と ATP の適用後、膜電位の変化は蛍光強度の比で示されていた。比率の増加は、膜電位の脱分極を表します。HN4 細胞は CLIC4siRNA を導入させた (CLIC4 siRNA) またはスクランブル siRNA (コン siRNA)。値は、平均 ± SEM. n として表示されます 5 を =。P < コントロール (コン siRNA) グループ対 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.CLIC4 ノックダウン議決した共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 HN4 細胞ミトコンドリア膜の ATP 誘起脱分極におよぼす影響.(A) 蛍光揺らぎ Rh123。 代表的なトレース (B) と (C) の ATP を示す集計データの代表的なイメージ (100 µmol/L)-HN4 セル MMP に変化。膜電位の変化は前に、と ATP の適用後の蛍光密度の比で示されていた。比率の増加は、膜電位の脱分極を表します。HN4 細胞 CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) を導入させたまたはスクランブル siRNA (コン siRNA)。値は、平均 ± SEM. n として表示されます 5 を =。P < コントロール (コン siRNA) グループ対 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Cl−チャネルの内部環境の止血に欠かせない細胞増殖およびアポトーシス15,16で重要な役割を果たすとされています。したがって、さまざまな癌17より治療的なアプローチを見つけるための大きい必要性と意義はイオン チャネル標的介入とアポトーシスの関係を理解すること。ミトコンドリアは、セルの通常の生物学的状態を維持し、その機能は高度の膜透過性と膜電位に関連します。ミトコンドリア異常を感音性難聴、小脳失調症、認知症を含む神経学的症状、心血管疾患、ミオパチーに貢献する癌から離れて蓄積 neuropathological 調査に記載しています。、およびてんかん18,19。これらはすべてミトコンドリア絞った介入する臨床治療を改善するために研究に拍車をかけた。Rh123、ミトコンドリアをターゲットとした蛍光色素は、MMP を検出する普遍的な蛍光色素をプローブとして細胞膜およびサーブを浸透することができます。細胞のアポトーシスの初期状態で MPTP の開口部昇格をミトコンドリア外発売 Rh123 を許可するミトコンドリア膜透過性と最後に強い緑色蛍光シグナルを検出可能性があります。この状況下で二国間のイオンは自由に配布、電子輸送鎖の分離を引き起こす MMP の急速な低下につながるし、細胞の通常のエネルギー供給に深刻な影響を与える ATP 生産が減少します。また、MPTP の開くトリガー Cyt C、アポトーシス誘導率、アポトーシス プロテアーゼ活性化因子-1、および ROS と最後に不可逆的なアポトーシス20,21 にリードを含むプロアポトーシス生理活性化合物の流出.
Rh123 の高い蛍光によって示されるように、ATP はミトコンドリア膜の脱分極を引き起こす可能性があります。異なる処置中で細胞のミトコンドリア膜の ATP 誘起脱分極を比較すると、ミトコンドリアと程度とアポトーシス22の状態の変更の生物学的機能を解読することが可能です。一般的な蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡 Rh123 の蛍光強度のゆらぎを記録を介して MMP のリアルタイム監視を実現することができますが、利点と欠点の両方の方法をする必要があります。見なされます。一般的な蛍光顕微鏡と比較して、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡で撮影した画像は、高解像度・高品質があります。したがって、細胞内詳細を視覚化できます。さらに、複数の蛍光染料を使用してときに光のクロストークの影響を減少します。したがって、共焦点顕微鏡することができます正確に Rh123 のリアルタイム蛍光変動を記録し、本物の携帯電話の活性を反映します。MMP を監視する私たちのメソッド必要が相対的な長時間継続的に記録し、細胞損傷23につながるレーザー照射下での単一の酸素と ROS を含む、cytotoxins のシリーズが生じることがあります。また、高いレーザー強度は通常24連続スキャン中に蛍光染料のフェージングを発生します。対照的に、一般的な蛍光顕微鏡共焦点顕微鏡のような高品質の画像を取ることができない、それは前述の副作用はありません、可能な長時間録音になります。一般的な蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡から我々 のデータを比較すると、明らかな違いがありませんでした、一般的な蛍光顕微鏡が、MMP の変動を監視するために十分な能力を示すと同様コスト効率の高いより便利なデータ分析。実験前に coverslips HN4 細胞播種。ポリリジンは、細胞の付着を高めるために適用は、まだ coverslips と大まかな操作から切り離された細胞のごく一部はセル実行可能性の障害につながります。その上、商工会議所に Rh123 または ATP の追加、注意が必要室と coverslips を触れないように。
Rh123、DioC6、JC-1 テトラメチル ローダミン メチル エステル (TMRM) ほか MMP を検出するために使用可能性があります蛍光染料であります。顕微鏡でリアルタイム録音ではなくフローサイトメトリーは、また、このタスクを実行できます。しかし、顕微鏡で蛍光強度のリアルタイム変更を記録、細胞活性を発見しより信頼性の高い結果を与える直観主義のイメージを生成する適しています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
細胞培養のため氏チャオ牙に感謝致します。この作品は中国の自然科学財団 (81371284 許可第 81570403 号); からの補助金によって支えられました。安徽省の自然科学基金 (許可番号 1408085MH158)。安徽省医科大学の優秀な若手研究者安徽省の大学の優秀な若い才能を支援するプログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
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