Summary
وهنا يقدم بروتوكول مفصلة لتطبيق والرودامين 123 للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) تحديد ودراسة CLIC4 المستحثة بضربه قاضية HN4 الخلية المبرمج في المختبر. وسجلت تحت مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار، التغيير في الوقت الحقيقي نظام التمثيل التناسبي المختلط.
Abstract
ويعتبر استنزاف للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (نظام التمثيل التناسبي المختلط، ΔΨm) الحدث تتالي apoptotic بأقرب وقت ممكن. ويحدث ذلك حتى قبل الخصائص apoptotic النووية، بما في ذلك التكثيف الكروماتين والكسر الحمض النووي. متى سيتم بدء انهيار نظام التمثيل التناسبي المختلط، الخلية المبرمج لا رجعة فيه. سلسلة من الأصباغ الموجبة محبتين يمكن تمر عبر غشاء الخلية وتجميع داخل مصفوفة ميتوكندريا، وتكون بمثابة علامة الأسفار لتقييم تغير نظام التمثيل التناسبي المختلط. كواحدة من ستة أعضاء من Cl– الأسرة قناة داخل الخلايا (انقر)، CLIC4 وتشارك في عملية apoptotic الخلية أساسا من خلال المسار المتقدرية. هنا يمكننا وصف بروتوكول مفصلة قياس التمثيل التناسبي المختلط عن طريق رصد تقلبات fluorescence والرودامين 123 (Rh123)، علينا أن ندرس من خلالها المبرمج الناجمة عن ضربة قاضية CLIC4. نحن مناقشة مزايا وقيود التطبيق [كنفوكل] ليزر المسح الضوئي والمجهر الفلورية العادية بالتفصيل، وذلك أيضا مقارنة مع أساليب أخرى.
Introduction
Rh123 هو صبغة fluorescence الأيوني، الذي يخدم كمؤشر لإمكانات transmembrane. Rh123 قادر على اختراق غشاء الخلية وإدخال مصفوفة المتقدرية تبعاً للاختلاف المحتملة من داخل وخارج الغشاء1. [ابوبتوسس] يؤدي إلى الأضرار من سلامة غشاء الميتوكوندريا. وستفتح المسام الانتقال نفاذية ميتوكندريا (MPTP) وتؤدي إلى انهيار نظام التمثيل التناسبي المختلط، الذي يؤدي بدوره في الإفراج عن Rh123 إلى خارج الميتوكوندريا. وأخيراً، سوف يتم الكشف عن أقوى إشارة الفلورية الخضراء تحت مجهر الأسفار. أنها موثقة جيدا أن استنفاد MMP ونفاذيه الغشاء مرتفعة هي العلامات المبكرة للخلايا المبرمج2. ولذلك، قد يكون تطبيق Rh123 الكشف عن تغيير نظام التمثيل التناسبي المختلط، وحدوث استموات الخلايا.
سرطان الأكثر شيوعاً السادسة في العالم، تتدهور سرطان الرأس والرقبة شدة الشخص الصحية3. على الرغم من أن العديد من النهج وضعت في السنوات الأخيرة، هو النتائج السريرية للعلاج للمرضى الذين يعانون من الرأس والعنق الخلايا الحرشفية (HNSCC) لا تزال غير مثالية4. يمكن استكشاف أساليب علاجية جديدة لتحسين علاج هنسكك5. عرض القنوات الأيونية التي تنطوي على العديد من العمليات البيولوجية دوراً هاما في تطوير مختلف أنواع السرطان6. مشاركة الجزئي أو الكلي لقنوات Cl– يشاركون عاليا في الخصائص المختلفة للورم التحول بما في ذلك الهجرة النشطة، وارتفاع معدل انتشار واختزاع. وفي ضوء هذا، أدرجت انقر، عائلة بروتين رواية، كفئة واعدة من الأهداف العلاجية لعلاج السرطان6،7. وقد كشفت الدراسات الأخيرة أن أفراد الأسرة بما في ذلك CLIC1، CLIC4، و CLIC5، انقر ترجمة للقلب mitochondrial والأكسجين التفاعلية ومستوى الأنواع (روس) هو upregulated من CLIC5، مما يشير إلى دور وظيفي المتقدرية يقع Cl -- القنوات في الاستجابة أبوبتوتيك8. CLIC4، أحد أفراد الأسرة انقر (يعرف أيضا باسم متكليك و P64H1 و RS43)، درست أكثر استفاضة لخصائصه التنظيم أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية وموقع سوبسيلولار بما في ذلك غولجي وهيولي ميتوكندريا في الإنسان الكيراتينيه7،،من910. صورة CLIC4 التعبير يخضع لعامل نخر الورم-α (تنف-α)، P53، والتحفيز الخارجي. أوفيريكسبريشن ودوونريجوليشن من CLIC4 تؤدي إلى استجابة apoptotic أساسا من خلال المسار المتقدرية مصحوبة باختلال التوازن Bcl-2 أفراد الأسرة، تفعيل caspase تتالي، وإطلاق سراح السيتوكروم ج11، 12 , 13-ولذلك، قياس التمثيل التناسبي المختلط أمر حاسم لاستكشاف المبرمج المتصلة CLIC4، و Rh123 بمثابة مؤشر fluorescence مثالية.
تصف هذه الدراسة بروتوكولا مفصلة للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط لدراسة CLIC4 المستحثة بضربه قاضية المبرمج في الخلايا HN4. Rh123 كتحقيق الأسفار لمراقبة التغيير نظام التمثيل التناسبي المختلط. تحت مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار، التقلب في الوقت الحقيقي نظام التمثيل التناسبي المختلط قد يكون حلها. نحن مناقشة مزايا وقيود تطبيق [كنفوكل] ليزر المسح مجهر الأسفار بالتفصيل، وكذلك مقارنتها مع أساليب أخرى. يمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا إلى الدراسات الأخرى ذات الصلة بالمبرمج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الخلية الثقافة وتعداء
-
خلية ثقافة
ملاحظة: HN4، على خط خلية هنسكك، مستمدة من المرضى الذين يعانون من هنسكك14.- الثقافة HN4 الخلايا في دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم، الجلوكوز 4.5 غرام/لتر) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والمضادات الحيوية (البنسلين يو/مليلتر 100 و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين). احتضان خلايا في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
-
تعداء الخلايا
- يوم واحد قبل تعداء، لوحة 5 × 105 خلايا في 2 مل/جيدا من الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية في لوحات 6-جيدا.
- تمييع 100 siRNA pmol CLIC4 أو SiRNA سارعت في 250 ميليلتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام، بلطف. تمييع 5 ميليلتر الحويصلية الكاشف في 250 ميليلتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام واحتضانها لأدنى 5 الجمع siRNA المخفف مع الكاشف الحويصلية المخفف وتخلط بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة المخلوط لكل منها التي تحتوي على الخلايا والمتوسطة. المزيج بلطف هزاز لوحة ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO عن 24 ساعة قبل الشروع في عملية وضع العلامات التالية Rh123. استبدال المتوسط مع متوسط النمو الطبيعي ح 4 بعد تعداء.
2-Rh123 وسم
ملاحظة: استخدمت Rh123 لقياس نظام التمثيل التناسبي المختلط في الخلايا HN41.
- بعد العلاج siRNA CLIC4 (القسم 1)، استخدام الخلايا HN4 في لوحات 6-جيدا للمعالجة التالية. كذلك كمية الخلايا HN4 في كل ما يكفي لتكرار التجربة 10 مرات على كوفيرسليبس.
- استخدام الملقط لوضع كوفيرسليبس التعميم على الجزء السفلي من لوحات 12-بئر جديدة. تم تعيين عدد اللوحات وفقا للتصميم التجريبي (الشكل 1أ).
- وضع 150 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل بوليليسيني في منتصف كل ساترة داخل لوحات 12-جيدا وانتظر دقيقة 2 إيلاء الاهتمام لعدم وضع بوليليسيني خارج كوفيرسليبس. قم بإزالة بوليليسيني من بيبيتور جيدا (الشكل 1ب).
- إزالة مستنبت خلايا HN4 داخل الطبق وإضافة 1 مل 0.25% التربسين لفصل الخلايا. بعد 6 دقائق، إضافة 2 مل الثقافة المتوسطة لتحييد التربسين. المزيج بلطف الخلايا HN4 من بيبيتور 5 مرات والبذور 2-6 х 104 خلايا في كوفيرسليبس دائرية. وضع في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 (الشكل 1ج).
- وبعد تفريخ ح 8، احتضان خلايا HN4 مع 2 µmol/L Rh123 لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المزيج بلطف متوسطة صعودا ونزولاً عدة مرات لضمان توزيع Rh123 حتى في الأجل المتوسط (الشكل 1د).
- إعداد كافية حل المحلول الملحي الفسيولوجي الطبيعي (NPSS)؛ جعل NPSS (في mmol/L): 140 كلوريد الصوديوم، بوكل، 1 MgCl2، 1 كاكل2والجلوكوز 10 وحبيس 5، 5 درجة الحموضة 7.4). يسخن إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- استخدام الملقط لإزالة كوفيرسليبس وتغسل المتبقية السائل عن طريق وضع في كوفيرسليبس بإيجاز إلى المخزن المؤقت نببس مسخن (الشكل 1ﻫ).
- وضع في كوفيرسليبس على الجزء السفلي من الدائرة الفولاذ المقاوم للصدأ 500 ميليلتر (انظر الجدول للمواد) مع قاع ساترة زجاجية قابلة لاستبدال 25 مم مختومة في المكان قبل الدائري. إصلاحه بتشديد غطاء الدائرة (الشكل 1ﻫ).
- إضافة ميليلتر 450 يسخن NPSS المخزن المؤقت إلى الدائرة المجمعة ووضع الحمام ضمن حقل visual مجهر الأسفار أو [كنفوكل] ليزر المسح مجهر الأسفار (الشكل 1ﻫ).
3-الكشف نظام التمثيل التناسبي المختلط
-
مجهر الأسفار الشائعة
- قم بتشغيل المجهر fluorescence اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تم إنجاز مجهر الأسفار المشتركة مع الزئبق مصباح اليافي مصدر ضوء، عامل تصفية فيتك Rh123 (تصفية الإثارة 480/40 ومرآة مزدوج اللون ليرة لبنانية 505 وتصفية الانبعاثات 535/40) في درجة حرارة الغرفة. واستخدمت 20 X الهدف لإجراء تصوير خلية يعيش. - فتح برامج نظام التصوير وحدد الزر "جديد" من شريط الأوامر لبدء تجربة جديدة (الشكل 2أ).
- ضبط المجال البصري والتركيز العثور على موقع للخلايا في الضوء الأبيض.
- إطفاء الضوء وتضغط على الزر لإغلاق الضوء الأبيض. انقر فوق الزر "Focus" من شريط الأوامر وحدد "بدء التركيز" للتبديل على الأسفار. ابحث عن موقع الخلايا مرة أخرى عن طريق المجهر مع إثارة نانومتر 507 والانبعاثات تمريره طويلة نانومتر 529 الطول الموجي (مجموعة قبل التجربة). ضبط المجال البصري والتركيز مرة أخرى إذا لزم الأمر (الشكل 2ب).
- حدد حقل البصرية تحتوي على خلايا HN4 المنفصلين فقط 20 إلى 30. سوف يتم تسجيل تغيير إشارة الأسفار داخل الخلايا لكل خلية بدقة.
- حالما يتحقق حقل visual واضحة، انقر فوق "تركز وثيقة" من شريط التركيز. انقر فوق "Acq واحد" من شريط الأوامر للحصول على مجموعة واحدة من الصور. انقر فوق "المناطق" من شريط الأوامر ثم انقر فوق الزر "موافق" لتحرير مناطق القياس.
ملاحظة: من شريط "تحرير المنطقة"، يمكن استخدام أشكال مختلفة من المنطقة تبعاً للدراسة. - لصالح للأشكال المختلفة من الخلايا الفردية، حدد الأداة "تتبع المنطقة" ودائرة منطقة خلية واحدة واحدة وانقر نقراً مزدوجاً عند الانتهاء. كرر الإجراء حتى يتم كافة الخلايا دائري (الشكل 2-ج). انقر فوق "تم" وحدد "حفظ الصور" للعثور على مكان حفظه.
- انقر فوق "زيروكلوك"، ودفع بسرعة F4 لبدء رصد تغير كثافة الأسفار. تغيير سجل في الوقت الحقيقي من كثافة fluorescence مرة واحدة كل 5 ثانية لمدة 5 دقائق (الشكل 2د).
- عندما يصبح الأساس مستقرة، إضافة 50 ميليلتر NPSS مختلطة مع 0.5 ميليلتر من 100 ميللي مول/لتر ATP إلى الدائرة عن طريق بيبيتور. تذكر أن لا تلمس قاعة لتجنب إزالة المجال البصري (الشكل 2ه).
ملاحظة: سيتم تسجيل الصورة الفلورية لمدة 20 دقيقة وثم يمكن إنهاء هذه التجربة عن طريق التشغيل اليدوي. الفترة الزمنية بشكل روتيني تمت تسوية لمدة 20 دقيقة من أجل مراقبة الكامل تغير الأسفار. ومع ذلك، يتم تطبيق عملية يدوية لإيقاف الالتقاط عندما تؤثر عوامل غير متوقعة في استقرار المنحنى، أو عندما يأخذ أقل من 20 دقيقة من العملية برمتها.
- قم بتشغيل المجهر fluorescence اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
-
مجهر الأسفار المسح الضوئي ليزر [كنفوكل]
- قم بتشغيل الليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار اتباع إرشادات الشركة المصنعة، وفتح البرامج المجمعة.
ملاحظة: هنا، Rh123 كان ولع ليزر أرجون في 488 نانومتر والإشارات المنبعثة تم تسجيلها على مدى نطاق 545-700 شمال البحر الأبيض المتوسط عن طريق تطبيق عامل التصفية TD488/543/633. - انقر فوق "الهدف" ضمن القائمة "اكتساب" لتحديد 63 X/1.4 N.A. النفط الهدف العدسة. مراقبة العينة والعثور على حقل visual واضحة ضمن الحقل الخفيفة.
- اضغط على زر "TL/إيل" التبديل إلى وضع الأسفار وحدد عوامل التصفية fluorescence الصحيحة للعثور على موقع الخلية تحت الظلام عن طريق المجهر. دفع "مصراع" لحماية العينة عند الانتهاء من المراقبة.
- ضمن القائمة "اكتساب"، ضبط مناسبة PMT القناة وانقر فوق "تحقيق" لتنشيط المسار البصري استقر (الشكل 3أ). انقر فوق القائمة "تكوين" واختر "الليزر" لتحديد نوع الليزر اللازمة. ويوصي "الأرجون" لهذا البروتوكول (الشكل 3ب).
- انقر فوق "حية" الحصول على الصور في الوقت الحقيقي، وتأكد من أن الحقل visual يحتوي على خلايا HN4 المنفصلين فقط 20 إلى 30. سوف يتم تسجيل تغيير إشارة الأسفار داخل الخلايا لكل خلية بدقة.
- حدد "زيت" في "اكتساب وضع" في القائمة الفرعية "حيازة" ضمن القائمة "اكتساب" (الشكل 3ج). تعيين 5 s و 20 دقيقة للفاصل الزمني للوقت والمدة، على التوالي. انقر فوق "تطبيق" عندما تتم تسوية كافة المعلمات.
- ضمن القائمة "كوانتيفي"، استخدم الأداة "رسم الخطوط" لدائرة منطقة التسجيل لكل خلية. حدد "خط الشخصية" واختر "ابدأ" القيام بالمراقبة. سجل التغيير في الوقت الحقيقي من شدة الأسفار لمدة 5 دقائق (الشكل 3د-ه).
- عندما يصبح الأساس مستقرة، إضافة 50 ميليلتر NPSS مختلطة مع 0.5 ميليلتر من 100 ميللي مول/لتر ATP إلى الدائرة عن طريق بيبيتور. تذكر أن لا تلمس قاعة لتجنب إزالة المجال البصري.
ملاحظة: سيتم تسجيل الصورة الفلورية لمدة 20 دقيقة وثم الانتهاء من التجربة.
- قم بتشغيل الليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار اتباع إرشادات الشركة المصنعة، وفتح البرامج المجمعة.
4. تحليل إحصائي
-
مجهر الأسفار الشائعة
- قم بتشغيل المجهر الأسفار بشكل روتيني عقب دليل المشغل. فتح برامج نظام التصوير وحدد الزر "فتح" من شريط الأوامر لفتح تجربة محفوظة. انقر فوق "المناطق" من شريط 'الأوامر' والنقر فوق الزر "موافق" لتحرير مناطق القياس.
- حدد أداة "تتبع المنطقة" ودائرة منطقة خلية واحدة واحدة وانقر نقراً مزدوجاً عند الانتهاء. كرر الإجراء حتى تم تدوير كافة الخلايا. انقر فوق "تم"، وحدد "F4: إلى الأمام" الزر للحصول على تتبع عرض كثافة الأسفار.
- عند الانتهاء انقر زر السهم لأسفل الموجود في الزاوية اليمنى السفلي من الرسم البياني، وانقر فوق "إظهار الرسم البياني البيانات" (الشكل 2و). انقر فوق "موافق" مرتين ثم اختر الزر "سجل بيانات" فتح واجهة برامج معالجة البيانات. انقر فوق "تسجيل البيانات" مرة أخرى والبحث عن السجلات التي تقلب أسعار الوقت الحقيقي من شدة الأسفار تظهر في جدول البيانات.
ملاحظة: لكل خلية، تم عرض التغييرات في نظام التمثيل التناسبي المختلط كالنسبة الأسفار بالنسبة إلى الكثافة قبل تطبيق ATP أو تيراغرام (F1/F0). وكانت كل البيانات كثافة fluorescence متوسط الخلايا 20-30. وترد بيانات عن Rh123 يعني ± SE. النتائج من المجموعات 2 خضعت لاختبار ثنائي الطرف المستقل t وقيمة P < 0.05 يعتبر دلالة إحصائية. وكان تطبيق برمجيات التحليل الإحصائي لإجراء التحليلات الإحصائية في هذه التجربة.
-
مجهر الأسفار المسح الضوئي ليزر [كنفوكل]
- قم بتشغيل المجهر الليزر [كنفوكل] وتسجيل الدخول إلى البرامج المجمعة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- حدد "النار" لفتح تجربة مسجل.
- حدد أداة "المكدس الشخصية" ضمن القائمة "كوانتيفي"، اختر "الكل في واحد" من "مخططات فرز القنوات ورويس".
- استخدام الأداة "رسم مضلع" إلى دائرة المناطق خلية للمراقبة.
- حدد من القائمة "رسم" انقر بزر الماوس الأيمن واختر "تصدير إلى excel" لإضافة قيم كثافة الفلورية إلى جدول بيانات. التحليل التالي يتسق مع مجاهر fluorescence العادي (الشكل 3و).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، تم تطبيق Rh123 للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط. في البداية، كان مثقف الخلايا HN4 للأسفار التالية تلطيخ التجارب. واستخدمت ملاقط لوضع كوفيرسليبس التعميم على الجزء السفلي من البئر 6 لوحات (الشكل 1أ). كوفيرسليبس كانت مغطاة بطبقة بوليليسيني لمدة 5 دقائق ومن ثم إزالتها بوليليسيني عن طريق بيبيتور (الشكل 1ب). ثم الخلايا HN4 تريبسينيزيد وتبذر في كوفيرسليبس توضع في الجزء السفلي من لوحات 6-جيدا. بعد ذلك، أضيف المقدار المناسب من Rh123 ومختلطة جيدا (الشكل 1ج-د). بعد الغسيل مع NPSS مسخن، تم تجميعها ساترة في قاعة العرض. تم إضافة المقدار المناسب من NPSS للتجربة التالية (الشكل 1ﻫ).
بعد هذا الإجراء لتلطيخ Rh123، استخدمت كل مشترك fluorescence مجهر ومجهر [كنفوكل] لتسجيل الأسفار Rh123 في الوقت الحقيقي مع مختلف الخطوات والبرامج. مجهر الأسفار الشائعة، تم تشغيل برامج التصوير لإنشاء تجربة جديدة. فتح المصراع لإظهار الضوء الفلورية الخضراء وعدلت بالتركيز ومكان الحصول على حقل البصرية مناسبة. بعد أخذ صورة خلية، استخدمت أدوات تتبع الشكل لرسم المنطقة لكل خلية واحدة وثم سجل التغيير الأسفار. مرة واحدة الأساس أصبحت مستقرة، تمت إضافة ATP في الدائرة لتحريك depolarization غشاء الميتوكوندريا. في التجربة [كنفوكل] ليزر المسح مجهر الأسفار، افتتح البرامج المجمعة وتم تعيين مسار بصري مناسب. بعد أن تم اختيار مصدر الضوء الأرجون، علينا تعديل التركيز وموقف الدائرة لتحقيق البصرية واضحة للأشكال خلية على الشاشة. تم تحديد وضع المسح الضوئي "إكسيت" وتم تطبيق الأداة "رسم مضلع" إلى دائرة المنطقة خلية لتسجيل التغيير الأسفار داخل كل خلية مفردة. لتحليل البيانات الأولية، F0 قيمة كثافة الأسفار قبل تطبيق ATP و F1 كان الحد الأقصى لقيمة كثافة الأسفار بعد تطبيق ATP. تم استخدام F1/F0 لتقييم depolarization غشاء الميتوكوندريا (الشكل 2 و الشكل 3). من الشكل 4ب و الشكل 5ب، كانت مرتفعة مستويات شدة الفلورسنت بعد العلاج ATP وانخفض مرة أخرى إلى خط الأساس بعد حوالي 10 دقيقة الشكل 4ج و الرقم 5ج تبين بوضوح أن ذروة كثافة الأسفار من Rh123 كان أعلى في المجموعة تحت العلاج siRNA CLIC4 في مجموعة المراقبة. الشكل 4 و الرقم 5 إظهار صور الممثل التغيير الفلورية في كل مرحلة. بالمقارنة مع مجهر الأسفار الشائعة، المجهر [كنفوكل] الحصول على أعلى جودة الصورة، تظهر نواة الخلية والميتوكوندريا. ومع ذلك، عند مقارنة البيانات من هاتين الطريقتين، تم العثور على لا اختلافات كبيرة. وأظهرت النتائج من الأسفار ومجهر [كنفوكل] أن ضربة قاضية ل CLIC4 المحسن depolarization المستحثة ATP غشاء الميتوكوندريا في الخلايا HN4 (الشكل 4 و الشكل 5).
الشكل 1 . وسم Rh123. استخدمت ملاقط (A) لوضع كوفيرسليبس التعميم على الجزء السفلي من لوحات 6-جيدا. (ب) كوفيرسليبس طلاء مع بوليليسيني عن طريق بيبيتور لمدة 5 دقائق وشفط أخيرا بالعودة إلى بيبيتور لإزالة بوليليسيني. (ج) HN4 الخلايا كانت تبذر في كوفيرسليبس في الجزء السفلي من لوحات 6-جيدا. (د) إضافة كمية مناسبة من Rh123 وخلط جيدا. (ﻫ) الغسيل كوفيرسليبس مع الكهرنووية مسخن وتجميع الدائرة مع كمية مناسبة من NPSS للتجربة التالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . خطوات لرصد التقلبات في الوقت الحقيقي من الأسفار Rh123 مجهر الأسفار الشائعة. المفتوحة (أ) تجربة جديدة. (ب) بدء التركيز واختيار حقل visual مناسبة تحت الأسفار. (ج) استخدام "المناطق" أداة من شريط الأوامر لتحرير مناطق المراقبة. (د) انقر فوق "ساعة الصفر"، ودفع بسرعة F4 لبدء رصد تغير كثافة الأسفار. (ﻫ) إضافة ATP (100 µmol/L) لتحريك غشاء الميتوكوندريا depolarization بعد الأساس تصبح مستقرة. (و) بمجرد الانتهاء من هذه التجربة، انقر فوق السهم لأسفل الموجود في الزاوية اليمنى السفلي من الرسم البياني لتصدير البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . خطوات لرصد التقلبات في الوقت الحقيقي من الأسفار Rh123 بالليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار. (أ) تحديد القناة PMT ومجموعة مجموعة مناسبة للطول موجي تحت قائمة "الحصول". (ب) حدد نوع الليزر الصحيحة من "الليزر المتاحة حاليا" وقوتها. (ج) اختر "زيت" مراقبة الوضع ووضعت مجموعة من معلمات التسجيل. (د) اختيار الأدوات "المكدس الشخصية" و "كل واحد" من "مخططات فرز القنوات ورويس". (ﻫ) استخدام أداة "المضلع رسم" إلى دائرة منطقة الخلية للبيانات في الوقت الحقيقي. (و) تصدير قيم كثافة الفلورية إلى برامج معالجة البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . حل أثر ضربة قاضية CLIC4 على ديبولاريزيشن التي يسببها ATP غشاء الميتوكوندريا مجهر الأسفار الشائعة في الخلايا HN4- (أ) صور الممثل تقلب الأسفار Rh123-آثار الممثل (ب) والبيانات الملخصة (ج) عرض ATP (100 µmol/L)-الناجمة عن التغييرات في الخلية HN4 نظام التمثيل التناسبي المختلط. وذكر التغيير في غشاء المحتملة بنسبة كثافة الأسفار قبل وبعد تطبيق ATP. وتمثل الزيادة نسبة depolarization المحتملة الغشاء. تم transfected الخلايا HN4 مع CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) أو siRNA المجمعة (Con siRNA). يتم عرض القيم كنون يعني ± sem. = 5. ف < 0.05 مقابل مجموعة عنصر التحكم (Con siRNA). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . أثر ضربة قاضية CLIC4 على غشاء الميتوكوندريا التي يسببها ATP depolarization حلها بالليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار في الخلايا HN4. الصور التمثيلية (A) تقلب الأسفار Rh123-آثار الممثل (ب) والبيانات الملخصة (ج) عرض ATP (100 µmol/L)-الناجمة عن التغييرات في الخلية HN4 نظام التمثيل التناسبي المختلط. وذكر التغيير في غشاء المحتملة بنسبة كثافة الأسفار قبل وبعد تطبيق ATP. وتمثل الزيادة نسبة depolarization المحتملة الغشاء. الخلايا HN4 تم transfected مع siRNA CLIC4 (CLIC4 siRNA) أو سارعت siRNA (Con siRNA). يتم عرض القيم كنون يعني ± sem. = 5. ف < 0.05 مقابل مجموعة عنصر التحكم (Con siRNA). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنها موثقة جيدا أن Cl− قنوات أساسية للحفاظ على الأرقاء البيئة الداخلية وتلعب أدواراً هامة في تكاثر الخلايا والمبرمج15،16. ولذلك، فهم العلاقة بين التدخل المستهدفة لقناة أيون والمبرمج حاجة كبيرة وأهمية إيجاد نهج علاجية أفضل لمختلف أنواع السرطان17. الميتوكوندريا الحفاظ على حالة خلية بيولوجية طبيعية ووظيفتها تتعلق بدرجة عالية على نفاذية الأغشية وإمكانات transmembrane. وبصرف النظر عن السرطان، وتراكم التحقيقات لاثيل وثقت أن يسهم شذوذ المتقدرية عضلي وأمراض القلب والأوعية الدموية، وأعراض عصبية منها الصمم الحسي وترنح الدماغ والخرف ، والصرع،من1819. كل هذه قد حفزت الأبحاث في الميتوكوندريا التي تستهدف التدخل لتحسين العلاج السريري. Rh123، صبغة fluorescence ميتوكندريا المستهدفة، يمكن اختراق غشاء الخلية، ويخدم الأسفار عالمية تحقيقا للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط. في أوائل دولة الخلية المبرمج، افتتاح MPTP يرفع نفاذية غشاء الميتوكوندريا مما يسمح Rh123 أن يفرج عنها خارج الميتوكوندريا، وأخيراً قد يتم الكشف عن أقوى إشارة الفلورية الخضراء. في ظل هذا الوضع، توزيع بحرية الأيونات الثنائية وتؤدي إلى الانخفاض السريع لنظام التمثيل التناسبي المختلط مما تسبب في فصل سلسلة نقل الإلكترون وانخفض إنتاج ATP، مما يؤثر بشدة على إمدادات الطاقة الطبيعية للخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي افتتاح MPTP التدفق الخارجي للمركبات الحيوية النشطة أبوبتوتيك برو--بما في ذلك سيت ج، المبرمج الذي يحفز عامل، وعامل حوزتي تفعيل أبوبتوتيك-1، وروس، وأخيراً يؤدي إلى المبرمج لا رجعة فيه20،21 .
قد حمل ATP depolarization غشاء الميتوكوندريا كما يتبين من الأسفار مرتفعة من Rh123. وبمقارنة depolarization غشاء الميتوكوندريا التي يسببها ATP للخلايا تحت العلاجات المختلفة، فمن الممكن فك الوظيفة البيولوجية للتغير في الميتوكوندريا ودرجة والدولة من [ابوبتوسس]22. مجهر الأسفار الشائعة والليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار يمكن تحقيق الرصد في الوقت الحقيقي لنظام التمثيل التناسبي المختلط عن طريق تسجيل تقلب كثافة الأسفار من Rh123، ولكن مزايا وعيوب كلا الأسلوبين بحاجة إلى أن تكون نظرت. مقارنة مع مجهر الأسفار الشائعة، الصور التي تم التقاطها بالليزر [كنفوكل] المسح مجهر الأسفار يكون أعلى من القرار ونوعية. ولذلك، يمكن تصور مزيد من التفاصيل سوبسيلولار. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يقلل الآثار المترتبة ضوء عبر الحديث على عند استخدام الأصباغ الفلورية متعددة. ومن ثم، المجهر [كنفوكل] دقة تسجيل تقلب Rh123 fluorescence في الوقت الحقيقي وتعكس بيواكتيفيتي الخلوية الحقيقي. ومع ذلك، لدينا أساليب لرصد نظام التمثيل التناسبي المختلط بحاجة إلى التسجيل بشكل مستمر لفترة طويلة نسبيا ويمكن إنتاج سلسلة من سيتوتوكسينس، بما في ذلك واحدة من الأكسجين وروس، تحت إشعاع الليزر مما يؤدي إلى تلف خلية23. وعلاوة على ذلك، عادة ما يتسبب الليزر عالية الكثافة يتلاشى أصباغ الفلورية أثناء المسح المستمر24. على النقيض من ذلك، مجهر الأسفار المشتركة لا يمكن التقاط صور ذات جودة عالية مثل المجهر [كنفوكل]، ولكنه لم يقم بالآثار الضارة المذكورة آنفا ومما يجعل تسجيل وقت طويل ممكن. بمقارنة البيانات المتوفرة لدينا من مجهر الأسفار الشائعة ومجهر [كنفوكل]، لا يوجد فرق واضح يمكن العثور على، الذي يشير إلى أن المجهر fluorescence المشتركة المختصة ما يكفي لرصد تقلبات نظام التمثيل التناسبي المختلط، فضلا تحليل البيانات فعالة من حيث التكلفة وأكثر ملاءمة. كان المصنف الخلايا HN4 على كوفيرسليبس قبل التجربة. على الرغم من أن يتم تطبيق بوليليسيني على تعزيز مرفق الهاتف الخلوي، جزء صغير من خلايا لا تزال بعيدة عن كوفيرسليبس والعملية الخام يؤدي إلى الأضرار بسلامة الخلية. إلى جانب ذلك، إضافة Rh123 أو ATP في الدائرة، يجب الحرص على عدم لمس الدائرة وكوفيرسليبس.
وإلى جانب Rh123، DioC6 وجيمي كارتر-1 ورباعي ميثيل إستر الميثيل والرودامين (تمرم) هي الأصباغ الفلورية التي يمكن استخدامها للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط. بدلاً من التسجيل في الوقت الحقيقي عن طريق المجهر، التدفق الخلوي كما يمكن القيام بهذه المهمة. تسجيل التغيير في الوقت الحقيقي من شدة الأسفار مع المجهر غير مناسبة أكثر لاكتشاف بيواكتيفيتي الخلوي وتوليد الصور إينتويتيونيستيك، وإعطاء نتائج أكثر موثوقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يرجى ونشكر السيد شاو فانغ لزراعة الخلايا. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية" (المنحة رقم 81570403، 81371284)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة آنهوي (رقم المنحة 1408085MH158)؛ محقق شاب المعلقة من جامعة آنهوي الطبية؛ دعم البرنامج لمواهب شابه ممتازة في الجامعات لمقاطعة آنهوي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
