Summary
Un protocolo para el uso de neuroprotectores de la presión atmosférica baja dosis tratamiento del plasma sobre las lesiones de SH-SY5Y inducida por la deprivación de glucosa.
Abstract
El chorro de plasma de la presión atmosférica (APPJ) ha atraído la atención de muchos investigadores de múltiples disciplinas en los últimos años debido a sus emisiones incluyen varios tipos de especies reactivas del nitrógeno (RNS) y especies reactivas del oxígeno (ROS). Nuestro estudio anterior ha demostrado el efecto citoprotector de la APPJ contra las lesiones inducidas por el estrés oxidativos. El objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo de tratamiento detallado en vitro con respecto a las aplicaciones de neuroprotective del helio APPJs en lesión inducida por la deprivación de glucosa en células SH-SY5Y. La línea de células neuroblastoma humano SH-SY5Y fue mantenida en Medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal 15%. El medio de cultivo luego fue cambiado a 1640 RPMI sin glucosa antes del tratamiento APPJ. Después de una incubación de 1 h en un incubador celular, viabilidad celular se determinó utilizando la célula contando Kit 8. Los resultados mostraron que, comparado con el grupo de la privación de glucosa, las células tratadas con APPJ exhibieron viabilidad celular aumentó significativamente de forma dosis-dependiente, con 8 s/bien observada como una dosis óptima. Mientras tanto, flujo de helio no tuvo efecto sobre el deterioro de la célula inducida por la deprivación de glucosa. Nuestros resultados indican que APPJ podría ser utilizado potencialmente como un método de tratamiento para las enfermedades en el sistema nervioso central relacionados con la privación de glucosa. Este protocolo podría también usarse como una aplicación de citoprotector para otras células con problemas diferentes, pero las condiciones de tratamiento APPJ y cultivo celular deben reajustarse y la dosis de tratamiento debe ser relativamente baja.
Introduction
El cerebro adulto utiliza casi exclusivamente glucosa como sustrato para el metabolismo de energía bajo condiciones fisiológicas normales. El cerebro humano constituye sólo el 2% del peso corporal, pero consume aproximadamente el 25% de la glucosa total de cuerpo1. Está bien documentado que disfunción del metabolismo de la glucosa es uno de los principales cambios patológicos durante el accidente cerebrovascular isquémico y varias enfermedades de neurodegenerative, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Huntington (EH) y enfermedad de Parkinson (EP) 2,3. La falta de glucosa y la absorción de glucosa o fosforilación oxidativa puede afectar directamente la producción de ATP y además inducir la muerte celular neuronal, que puede aumentar el riesgo de disfunción neuronal, lo que sugiere que mantener viabilidad celular o retrasar la lesión de la célula después de la privación de glucosa podría ser un enfoque razonable para el tratamiento de estas enfermedades. La investigación de efectos neuroprotectores vía modulación de la glucosa, centrándose en moduladores de canal del ion, depuradores de radicales libres, agentes antiinflamatorios, factores neurotróficos, etc. ha sido de interés. Sin embargo, la traducción de estos enfoques neuroprotectores de banco a la práctica clínica no ha sido exitosa4.
Chorros de plasma de la presión atmosférica (APPJs) son un nuevo tipo de tecnología de descarga de gas de baja temperatura atmosférica que ha atraído la atención de muchos investigadores de múltiples disciplinas en los últimos años. APPJs se han utilizado por décadas en diversas aplicaciones biomédicas tales como tratamiento del cáncer de la célula, inactivación bacteriana, coagulación de la sangre, la cicatrización de heridas, medicina oral, etc.5,6, debido a sus emisiones de varios tipos de de especies reactivas del nitrógeno (RNS) y especies reactivas del oxígeno (ROS) (figura 1)7. Anteriores aplicaciones de bio-medicina de plasma se centraron principalmente en el estrés oxidativo o nitrative en las bacterias, las células y los tejidos8. Sin embargo, la APPJ también podría ser una "espada de doble filo" ya que RNS y ROS son importantes moléculas de señalización intracelulares relacionadas con numerosos procesos fisiológicos y patofisiológicos9. El óxido nitroso (NO) controla una amplia gama de procesos biológicos y desempeña un papel dual en el cuerpo humano, especialmente en sistema nervioso central (SNC). Niveles bajos no han demostrado su actividad neuroprotectora ambos en vitro y en vivo a través de múltiples vías de señal10. Nuestro estudio previo informó primero que helio NO producción estuvo implicada en el efecto neuroprotector de APPJ contra lesiones inducidas por el estrés oxidativo11inducida por la APPJ. Sin embargo, no se han divulgado los efectos de APPJs en otras lesiones. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo de tratamiento en vitro con respecto a las aplicaciones de neuroprotectores de helio APPJ en lesión inducida por la deprivación de glucosa en células SH-SY5Y. A diferencia de estudios anteriores, nuestro protocolo utiliza tratamiento plasma de dosis bajas para aplicaciones de neuroprotectores sin las consecuencias de lesiones excesiva inducida por plasma, indicando que el tratamiento de APPJ podría ser utilizado potencialmente como una novela "ningún donante fármaco "para la investigación futura y aún para la traducción clínica. Este protocolo también fue sugerido para ser utilizado como una aplicación de citoprotector para otros tipos de células con diferentes discapacidades, pero deben volver a ajustadas las condiciones de tratamiento APPJ y la dosis de tratamiento debe ser relativamente baja.
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Protocol
1. preparación del dispositivo APPJ
PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan los experimentos, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).
- Elegir un tubo de cuarzo con un diámetro interno de 1 mm y un diámetro externo de 3 mm liso los cortes transversales en ambos extremos mediante una hoja pulidora.
- Utilizar una aguja de acero niquelada con un diámetro de 1,0 mm como el electrodo de alto voltaje. Esmerile la punta a un radio de curvatura de 0,05 mm.
- Envoltura de aluminio (2 mm de ancho) alrededor del tubo de cuarzo de 1 cm del tubo de cuarzo de la boquilla. Fijar la punta de la aguja de acero inoxidable a 1 cm del otro extremo de la lámina de aluminio. Utilice el anillo de papel de aluminio como el electrodo de baja tensión.
2. Adquisición de Jets
- para proporcionar una señal AC, conecte el amplificador de potencia de alto voltaje en el generador de señal de función que sirve como una fuente de alimentación. Para registrar las formas de onda de la tensión aplicada al electrodo de alto voltaje, conecte un extremo de la sonda de alto voltaje en el osciloscopio digital y conecte el otro extremo a la fuente de alimentación. Para proteger el circuito, use un 2 k Ω resistor como una resistencia de protección. Conecte el circuito como se muestra en la figura 2.
PRECAUCIÓN: No toque las líneas de alta tensión. - Continuamente pasar helio (fracción de volumen, 99,999%) sobre el tubo de cuarzo y controlar el flujo de gas en un estable estándar 1.4 litro por minuto (SLM).
Nota: No use un filtro antes de tratamiento de cultivos celulares. La fracción de volumen de helio utilizado en el experimento es 99.999%, y la mayoría de los microorganismos no puede vivir en estas condiciones. - Conecte la alimentación del osciloscopio, generador de señal y amplificador de potencia de alta tensión. Gire la perilla de ajuste de frecuencia de 5 kHz. Aumentar gradualmente el voltaje a un valor de pico a pico de 6 kV.
Nota: El chorro es lo suficientemente larga (aproximadamente 3 cm) cuando el valor de pico a pico de la tensión aplicada en la aguja es aproximadamente 6 kV.
3. Preparación de células SH-SY5Y
- línea de células neuroblastoma humano crece el SH-SY5Y en un matraz de 25 cm 2 en RPMI 1640 suplementado con 15% de suero de ternero fetal (FBS). Mantener las células en una incubadora humidificada con 5% CO 2 y 95% aire a 37 ° C.
- Cuando las células alcanzan el 85% de confluencia, cuidadosamente aspirar el medio de cultivo y añadir tripsina de 0.25% de 1 mL + EDTA 0.1% a las células.
- Después de 15 s incubación a temperatura ambiente, cuidadosamente aspirar la tripsina y añadir 2 mL de RPMI 1640 que contiene 15% FBS para neutralizar a.
- Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo, lava la parte inferior del pozo, hasta desprender completamente la monocapa SH-SY5Y.
- Contar las células mediante el hemocitómetro y ajustar la concentración celular a 2 x 10 5 células/mL mediante la adición de RPMI 1640 medio + 15% FBS y luego transferir 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pozos.
- Permite a las células a conectar por 12 h en un incubador celular antes del tratamiento APPJ.
4. Tratamiento de APPJ de SH-SY5Y
tubo- ajuste la distancia entre la boquilla del cuarzo y la plataforma donde se colocará la placa de 96 pozos a 3 cm. aseguran de que el rayo puede tocar la superficie del medio de cultivo.
Nota: La distancia no se mide desde la parte inferior de la placa. Primero se ajusta a 3 cm entre la boquilla del tubo de cuarzo y la plataforma utilizada para colocar placa de 96 pozos. - Antes del tratamiento APPJ, cambiar el medio de cultivo en cada pocillo, excepto para los pozos de control de RPMI 1640 sin medio glucosa.
- Coloque la placa debajo de la boquilla APPJ y asegurarse de que los jets pueden disparar verticalmente en cada pocillo.
- Tratar células en pozos separados con APPJ para 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s y 12 s.
Nota: APPJ genera ionización helio ( figura 1). Las células lesionadas por la privación de glucosa son tratadas por 4 s y 8 flujo de helio de s para eliminar los efectos del helio en las células. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado.
5. Análisis de viabilidad de la célula
Nota: no cambie el medio en este paso.
- Después del tratamiento de APPJ, incubar las células para 1 h en un incubador celular.
- Añadir 10 μl de solución de célula contando Kit-8 (CCK-8) en cada pocillo de.
- Incubar a las células a 37 ° C por 4 h.
Nota: La línea de células SH-SY5Y es sensible a la privación de glucosa condiciones 12. Viabilidad celular disminuye a casi el 50% después de la deprivación de glucosa 1 h, que es la condición de viabilidad celular óptimo para estudios de farmacodinamia. CCK-8 no tiene ninguna citotoxicidad a las células y las células se incuban con CCK-8 reactivo para otro 4 h en las condiciones de privación de glucosa después de tratamiento APPJ para determinar la viabilidad celular. Después del tratamiento de APPJ y privación de glucosa de 8 h, el efecto protector de APPJ se redujo significativamente debido a la larga duración de la privación de glucosa condujo a severo daño de las células SH-SY5Y. No había evidencia de células vivas después de 24 horas de privación de glucosa 11. - Medir la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
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Representative Results
Datos se expresan como la media ± SD de por lo menos tres experimentos independientes. Grupo resultados se analizaron por varianza usando ANOVA. Todos los análisis se realizaron utilizando software de análisis estadístico prisma y p < 0.05 es el umbral de significación estadística.
Viabilidad celular se midió después de 4 h de incubación de la CCK-8. Como se muestra en la figura 3, la privación de glucosa reduce la viabilidad de las células SH-SY5Y 44,1 ± 2,6% en comparación con el grupo control (células normalmente cultivadas en Medio RPMI 1640 con 15% FBS). El tratamiento APPJ aumentó significativamente la viabilidad de las células de manera dependiente de la dosis a una dosis óptima de 8 s/bien, y la viabilidad celular alcanzó a 62,27 ± 3.1%. Flujo de gas no tuvo efecto sobre el deterioro de la célula inducida por la deprivación de glucosa (tabla 1).
Figura 1: las reacciones típicas de RNS y ROS en emisiones APPJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de la disposición experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efecto protector de APPJ en lesión inducida por la deprivación de glucosa de células SH-SY5Y. Las células fueron tratadas con APPJ y sometidas a la privación de la glucosa por 1 h, después de lo cual se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de CCK-8. Barras de error representan la media ± SD. *** P < 0.001 versus control; #P < 0.05 y ##P < 0.01 versus el grupo de la privación de glucosa (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupos | Viabilidad celular (% control) | |||
| Control | 100 ± 3,7% | |||
| Privación de glucosa | 44.1 ± 2.6% *** | |||
| Tratamiento APPJ + privación de glucosa | 1 s | 49,3 ± 2,8% | ||
| 2 s | 53,0 ± 2.7% | |||
| 4 s | 60,4 ± 2.3%# | |||
| 8 s | 62,3 ± 3.1%# | |||
| 12 s | 51,3 ± 2.7% | |||
| Flujo de + privación de glucosa | 4 s | 45,4 ± 2.4% | ||
| 8 s | 44,1% de 3.1 ± | |||
Tabla 1: datos de viabilidad porcentaje de SH-SY5Y células después de la privación de la glucosa con o sin tratamiento de APPJ. P < 0.001 versus control; #P < 0.05 y ##P < 0.01 versus el grupo de la privación de glucosa (n = 3).
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Discussion
Las células SH-SY5Y son una línea de células neuroblastoma humano y son ampliamente utilizadas como un modelo adecuado de la célula en vitro estudios de neurotoxicidad o neuroprotección12. La línea de células SH-SY5Y era sensible a las condiciones de privación de glucosa. Viabilidad celular disminuyó a casi el 50% después de la deprivación de glucosa 1 h, que es la condición de viabilidad celular óptimo para estudios de farmacodinamia. Además, CCK-8 reactivo no tiene ninguna citotoxicidad a las células y las células se incubaron con el CCK-8 reactivo para otro 4 h en las condiciones de privación de glucosa después de tratamiento APPJ para determinar la viabilidad celular. En el estudio actual proporciona un protocolo de tratamiento detallado en vitro con respecto a las aplicaciones de neuroprotectores de APPJ la lesión inducida por la deprivación de glucosa de células SH-SY5Y.
Modificaciones y la resolución de problemas
El tiempo de incubación de la CCK-8 podría ser más corto si bien significativamente cambiado el color de cada uno. Pero si la densidad celular SH-SY5Y está por debajo de 1 x 104 células por pozo, las células serán muertos después de la privación de glucosa y tratamiento APPJ. También se recomienda para reducir el caudal de gas, asegurando que el rayo de plasma puede tocar la superficie del medio de cultivo. APPJ también podría ser utilizado como un agente citoprotector para otras líneas de células neuronales relacionados (HT-22, neuro-2A o incluso primarias neuronas) con diferentes discapacidades (hipoxia, estrés oxidativo, etc.), pero las condiciones de tratamiento APPJ y cultivo celular deben ser reajustado, y la dosis de tratamiento debe ser relativamente baja. Hemos tratado de reducir la distancia en este parámetro de generación de APPJ, y encontramos que el jet de plasma podría afectar directamente a la fijación de células SH-SY5Y que podría resultar en lesiones de la célula (células SH-SY5Y fácilmente fueron separadas de su estado adherente). Creemos que la distancia de tratamiento debe basarse en las características de la célula y la tolerancia al tratamiento de chorro de plasma.
Limitaciones de la técnica
El protocolo actual sólo se centró en el en vitro efecto neuroprotector de APPJ en células de SH-SY5Y lesionados por la privación de glucosa. Investigaciones anteriores han demostrado que la inhalación de plasma podría mejorar las funciones cardíacas en un infarto de miocardio de rata modelo13. Todavía es necesario seguir trabajando para investigar el método de tratamiento en vivo para la protección del cerebro.
Importancia con respecto a los métodos existentes
Investigaciones anteriores sobre la medicina de plasma pagaron más atención a la capacidad de inactivación de bacterias, células cancerosas y los tejidos debido al estrés oxidativo y nitrative inducido por la APPJ tratamiento14. Nuestro protocolo utiliza tratamiento de dosis bajas de plasma para aplicaciones de neuroprotectores sin las consecuencias de lesiones excesiva inducida por plasma, indicando que el tratamiento de APPJ podría ser utilizado potencialmente como una novela "Ningún medicamento de donantes" para la investigación futura y que incluso para la traducción clínica.
Pasos críticos en el protocolo
El paso más crítico en este protocolo es para asegurarse de que la dosis de tratamiento APPJ es relativamente baja, puesto que durante el tratamiento con APPJ se agravar lesiones celulares e inducir directamente muerte celular. Otro paso fundamental es controlar la duración de la privación de glucosa o las células se mueren y se reducirá significativamente el efecto citoprotector de APPJ. Se utilizó helio puro, en lugar de helio mezclado con una pequeña cantidad de aire, o O2 . Cuando se utiliza el helio mezclado con una pequeña cantidad de aire o O2 , se incrementará la cantidad de ROS en el plasma. Es muy difícil hacer un diagnóstico cuando se producen reacciones químicas complicadas plasma.
Futuras aplicaciones
También vale la pena tener en cuenta que el tratamiento de APPJ se aplicó después de la inducción de la privación de la glucosa en células SH-SY5Y, indicando que APPJ podría ser utilizado potencialmente como un método de tratamiento para enfermedades relacionadas con la privación de glucosa en el sistema nervioso central, accidente cerebrovascular isquémico sobre todo. Por lo tanto, es necesario para futuros estudios evaluar las condiciones de tratamiento del efecto neuroprotector de APPJ tanto solos como en combinación con otros agentes neuroprotectores en diferentes períodos después de privación de la glucosa.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses declarados en relación con este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el fondo de innovación del Instituto neuroquirúrgico Beijing (2014-11), Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (núms. 11475019 y 81271286) y la Fundación de Ciencias naturales de Beijing (núm. 7152027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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