En enkelt-molekylet magnetiske pinsett plattform å manipulere G-quadruplexes er rapportert, gir mulighet for studiet av G4 stabilitet og regulering av ulike proteiner.
Ikke-kanoniske nukleinsyre sekundære struktur G-quadruplexes (G4) er involvert i ulike cellulære prosesser, som DNA-replikasjon, transkripsjon, RNA behandling og telomere forlengelse. Under disse prosessene, ulike proteiner binde og løse G4 strukturer for å utføre sin funksjon. Som funksjonen til G4 ofte avhenger stabiliteten i foldet strukturen, er det viktig å undersøke hvordan G4 bindende proteiner regulere stabiliteten på G4. Dette arbeidet gir en metode for å manipulere enkelt G4 molekyler ved hjelp av magnetiske pinsett, som gjør studier av regulering av G4 bindende proteiner på et enkelt G4 molekyl i sanntid. Generelt passer denne metoden for et stort spekter av programmer i studier for proteiner/ligander interaksjoner og forskrift om ulike DNA eller RNA sekundære strukturer.
Fire-strandet DNA eller RNA G4 strukturer spille viktige roller i mange viktige biologiske prosesser1. Mange proteiner er involvert i G4 bindende og regulering, inkludert telomere bindende proteiner (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transkripsjonsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA behandling proteiner (hnRNP A1 hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, ADV, Dna2, Pif1)5og utryddelse relaterte proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Protein kan stabilisere eller destabilisere G4 strukturer; Dermed regulerer de påfølgende biologiske funksjonene. Stabiliteten på G4 ble målt ved termisk smelter bruker ultrafiolett (UV) eller sirkulær dichroism (CD) metoder7. Slike forhold er imidlertid ikke fysiologiske relevante og er vanskelig å bruke å studere virkningene av bindende proteiner7.
Den raske utviklingen i enkelt-molekylet manipulasjon teknologi har aktivert studier av folding og utfolder seg i en biomolecule, for eksempel en DNA eller en protein, på en enkelt-molekylet nivå med nanometer oppløsning i sanntid8. Atomic force mikroskopi (AFM) og optiske pinsett magnetiske pinsett er mest brukte single-molekylet manipulasjon metoder. I forhold til AFM og optisk pinsett9, tillater magnetiske pinsett stabil målinger av folding-utspiller seg dynamikken i et eneste molekyl dager ved hjelp av en anti-drift teknikk10,11.
Her er en enkelt-molekylet manipulasjon plattform ved hjelp av magnetiske pinsett for å studere regulering av G4 stabilitet ved å binde proteiner rapporterte12,13. Dette verket beskriver de grunnleggende tilnærmingene, inkludert eksempler og flyt kanal forberedelse, oppsettet av magnetiske pinsett og force kalibreringen. Styrke kontrollen og anti-drift protokollene som beskrevet i trinn 3 tillater lang tid målene under ulike force kontroller som konstant (force klemme) og konstant lasting rate (force-rampen), og styrke-hopp måling. Force kalibrering protokoll beskrevet i trinn 4 kan styrke kalibrering av < 1 µm kort festeseler over en bred styrke rekkevidde opptil 100 pN, med en relativ feil innen 10%. Et eksempel på regulering av stabiliteten av RNA Helicase knyttet til AU-rik element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) som spiller viktige roller i å løse RNA G4 brukes til å vise programmer denne plattformen13.
Som beskrevet ovenfor, en plattform for studerer mekanisk stabilitet av G4 DNA og interaksjoner protein G4 bruker rapporteres single-molekylet magnetiske pinsett. Medfølgende plattformen, er høyeffektive protokoller for å finne G4 DNA tether og måling av folding-utspiller seg dynamikken og stabilitet av G4 strukturen med nanometer spesielle oppløsning utviklet. Fokalplanet låsing gjør svært stabile anti-drift kontroll, som er viktig for å oppdage en liten struktur overgang som G4 (trinn størrelse ~ 7 nm) og int…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Meng Pan for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet er støttet av Singapore departementet for utdanning akademisk forskning fondet Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) til J.Y.; National Research Foundation gjennom Mechanobiology Institute Singapore til J.Y.; National Research Foundation, Statsministerens kontor, Singapore, under sitt NRF Investigatorship program (NRF Investigatorship Award nr. NRF-NRFI2016-03 til J.Y.; Grunnforskning fondet for sentral universitetene (2017KFYXJJ153) til H. Y.
DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |