Summary
Ein Protokoll, ein Gewebe eindringende Hilfslicht für die Bereitstellung von Licht über große Mengen mit minimalem Durchmesser bauen wird vorgestellt.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine großvolumige Illuminator, die für optogenetische Manipulationen im Gehirn von Primaten entwickelt wurde. Der Illuminator ist eine modifizierte Kunststoff-Lichtwellenleiter mit geätzten Spitze so, dass die lichtemittierenden Fläche > 100 x, die einer herkömmlichen Faser. Neben der Beschreibung des Bau der großvolumigen Illuminator, beschreibt dieses Protokoll die Qualitätskontrolle Kalibrierung verwendet, um gleichmäßige Lichtverteilung zu gewährleisten. Dieses Protokoll beschreibt weiter, Techniken für das einsetzen und Herausnehmen der großvolumigen Illuminator. Oberflächliche und tiefe Strukturen können beleuchtet werden. Diese großvolumigen Beleuchtung muss nicht physisch an einer Elektrode gekoppelt werden und weil die Beleuchtung aus Kunststoff, nicht Glas besteht, es einfach beugt sich unter Umständen beim traditionellen Lichtleitfasern zerbrechen würde. Weil dieser Strahler Licht über verhaltensorientierte relevanten Gewebe Volumen (≈ 10 mm3) ohne größere Marktdurchdringung Schaden als eine herkömmliche optische Faser liefert, erleichtert es Verhaltensstudien mit Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten.
Introduction
Optogenetische-Tools, die für eine Millisekunde-präzise, lichtgetriebenen neuronale Steuerung ermöglichen werden häufig verwendet, um funktionelle Physiologie und das Verhalten in Nagetieren und Wirbellosen zu studieren. Technische Herausforderungen haben jedoch die Verwendung der Optogenetik im Gehirn von Primaten, begrenzt, die ein Volumen ~ 100 x größer als das Nagetier Gehirn 1hat.
Zur Erleichterung der Optogenetik Studien in nicht-menschlichen Primaten ein Illuminator wurde entwickelt, um zwei konkurrierende Ziele: großvolumige Beleuchtung und minimale Penetration Schaden. Frühere Versuche, Adresse eines dieser Anliegen sind bei den teuren des anderen! Bündel von Fasern Leuchten größere Mengen aber mit größerem Durchmesser und damit Schaden2,3. Konische Glasfasern eindringen Schaden, sondern nur knapp Licht emittierende Flächen reduziert < 100 µm2 4,5. Externe Gehirn Beleuchtung durch ein Fenster in die Dura umgeht die Herausforderung der Durchdringung Schaden und kann für großvolumige Beleuchtung ermöglichen, aber es kann nur für ein paar oberflächliche Gehirn Bereiche6verwendet werden.
Erstellen Sie eine großvolumige, kleine Durchmesser Strahler (Abbildung 1a), geätzt die Spitze eines Kunststoffs optische Faser ist Hitze verjüngt und Kern und Mantel sind (Abbildung 1 bC). Im Gegensatz zu anderen konischen Fasern, das Licht zu einem schmalen Punkt konzentrieren, ermöglicht die Radierung Licht gleichmäßig aus den Seiten der Spitze, also Verteilung von Licht im großen und ganzen über eine große Fläche (Abbildung 1 de) zu entkommen. Weil eindringen Schäden proportional zum Durchmesser Eindringen ist, diese Beleuchtung keine mehr eindringen Schaden als eine herkömmliche Faser hat, aber es hat > 100 x die Licht emittierende Oberfläche und Licht im weiteren Sinne mit 1/100stel der Lichtleistung Dichte in einem Gehirn phantom (1,75 % Agarose) (Abbildung 1e). Eine Monte Carlo-Modell (Abb. 1f) veranschaulicht den Unterschied bei leichten Ausbreitung zwischen einer herkömmlichen Faser und der großvolumige Beleuchtung bei gleicher Lichtleistung dichten als ihr Licht emittierende Flächen haben. Jeder Strahler ist individuell kalibriert mit einer Ulbricht-Kugel (Abb. 2a, b), um gleichmäßige Lichtverteilung entlang der Spitze (Abbildung 2 c) zu gewährleisten.
Diese großvolumige Illuminator ist mit optogenetische Manipulation von Verhalten und neuronale feuern bei nichtmenschlichen Primaten validiert worden. Die Faserlänge Tipp kann jeder Bereich des Gehirns und jedes Tier individuelle rezeptiven Feld Karte angepasst werden. Die Beleuchtung kann mit einem durchdringenden Elektrode für neuronale Aufnahmen gekoppelt werden, die die Länge der Beleuchtung umfassen. Weiter, weil die Faser jede Farbe des sichtbaren Lichts tragen kann, kann es mit einer der verfügbaren optogenetische Moleküle zur Verfügung gekoppelt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: alle tierische Verfahren gemäß den Richtlinien des NIH und wurden genehmigt durch Massachusetts Institute des Technology Committee on Animal Care.
1. Illuminator Herstellung
- ein paar der scharfen Schere verwenden, um einen Schnitt von 250 µm Durchmesser Kunststoff-Lichtwellenleiter, die mindestens 10 cm länger als die gewünschte Summe Illuminator ist.
- 15-20 cm von Polyethylen Jacke zu entfernen, von einem Ende der Kunststoff-Lichtwellenleiter mit einem 22 Gauge Abisolierzange.
- Sichern die meisten 3-5 cm das abisolierte Ende der Faser in einem Schraubstock Tischklemme distal.
- Halten die doppelwandige Ende der Faser straff in der Hand mit einem konstanten stetigen Zug. Die Faser sollte parallel zum Boden, senkrecht zu den Schraubstock. Pflegen Sie diese konstanten Spannung auf der Faser in der gesamten Heizung und Kühlung (Schritte 1,5 und 1,6 unten), so dass die Faser bleibt gerade und straff wie es lichtet.
- Mit der niedrigsten Einstellung von einer doppelten Temperatur Heißluftpistole (570/1.000 ° F), die abgespeckten Abschnitt der Faser erhitzen, bis es auf einen Durchmesser von 60-100 μm oder über den Durchmesser eines menschlichen Haares ausgedünnt ist.
- Pflegen die konstante Spannung auf der Faser beim erlauben der Faser zu kühlen. Fehlerhafte Wartung Spannung verursachen die Faser zu kräuseln.
- Bestätigen die Durchmesser der ausgedünnten Spitze unter dem sezierenden Mikroskop. Alternativ kann man Bremssättel stattdessen verwenden.
- Die Faser nicht dünn genug ist, wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6 je nach Bedarf die gewünschte Spitzendurchmesser zu erreichen.
- Optional wenn neu ziehen, legen eine kleine Markierung am schmalsten Teil der Faser wenn es wieder erhitzt wird, so dass das Zentrum der Heißluftpistole zielt auf den schmalsten Teil der Faser.
- Wenn die Faser zu dünn ist, von vorne beginnen.
- Sobald die Faser vollständig abgekühlt hat und der gewünschte Durchmesser erreicht wurde, drücken Sie die Faser 3 cm an der schmalsten Stelle auf beiden Seiten. Mit einer schnellen, scharfen ziehen entlang der Achse der Faser, trennen Sie die Seiten um eine kegelförmige Spitze zu erstellen.
- Untersuchen die kegelförmige Spitze unter einem low-Power (z.B. 4 X) auf Dissektion Mikroskop. Wenn die Spitze gegabelt oder ( Abb. 1f gewellt), entsorgen Sie die Faser.
- Vorbereiten, die kegelförmige Spitze Ätzen, indem man ein Stück Klebeband Labor nahe dem Ende der Spitze, so dass die letzte 5 mm ausgesetzt. Das Band schützt die Faser Radierung über die gewünschte Länge der Lichtemission. Diese Spitzenlänge wurde ausgewählt anhand der Dicke der Primas Kortex in der Zielregion. Eine längere oder kürzere Länge könnte abhängig von der gewünschten Länge der Beleuchtung ausgesetzt werden. Wenn ein anderes Etch Spitzenlänge gewünscht wird, der Rand des Bandes Lab kann immer näher gerückt sein, oder weiter entfernt von die kegelförmige Spitze.
- Ein klein (~ 1 Zoll x 2 Zoll) Quadrat von 5 μm Siliciumcarbid Läppen Blatt Umklappen zwischen Daumen und Zeigefinger. Setzen Sie die Spitze der Verbindungslinie zwischen den beiden Seiten des Blattes Läppen und sanft etch die Faser mit kleinen kreisenden Bewegungen, als ob eine BB zwischen Daumen und Zeigefinger zu Rollen. Häufig drehen Sie die Faser, so dass allen Seiten gleichmäßig geätzt werden. Die Faserspitze erscheint “ aufgerauht ” mit dem bloßen Auge in Bereichen, die geätzt worden, während un-geätzte Flächen in der Regel glatt erscheinen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.11 mit einer 3 μm Aluminiumoxid Läppen Blatt.
- Befestigen Sie einen Stecker am Ende des Erleuchters gegenüber der geätzten Spitze. Dies ermöglicht der Illuminator Anschluss an ein optisches Kabel oder Laser.
Hinweis: Diese Methode unterscheidet sich die bevorzugte Methode für die Festsetzung von Glas / Kieselsäure Glasfasern in Aderendhülsen. Weil Metall zwinge härter als die Kunststoff-Lichtwellenleiter ist, Polieren der Faser und zwinge als Einheit nach Verklebung beschädigen kann die Kunststoff-Lichtwellenleiter als winzige Scherben aus Metall produziert während des Schleifens kann sich in der Wohnung gespalten Faser einbetten.- Entfernen der Polyethylen-Jacke von der Gegenseite den Strahler mit einem 22 Gauge Abisolierzange ca. 5 mm.
- Schneiden Sie das gegenüberliegende Ende flach mit einem heißen Messer um die Oberfläche zu glätten.
- Der Gegenseite flach mit sukzessive feiner Läppen Polieren Blätter: 3 µm, 1 µm, 5 µm und 0,3 µm.
- Legen Sie die Wohnung gegenüber Ende in eine 260 µm Innendurchmesser Edelstahl zwinge bis er bündig mit dem Ende der Zwinge ist.
- Visuell bestätigen, dass der Gegenseite mit einem Faser-Mikroskop glatt und gleichmäßig poliert wird.
- Entfernen Sie die Faser aus der Zwinge und kleben die Endhülse vertikal am Rande einer Tabelle mit der Faser, die nach unten zeigenden.
- Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit Kunststoff Epoxidharz und befestigen Sie eine stumpfe 18-Gauge-Nadel der Spritze.
- Benutzen Sie die Nadel Epoxy hinunter in die Zwinge anwenden. Füllen Sie die Zwinge komplett mit Epoxy.
- Legen Sie die Faser in der Ferrule.
- Wischen jede überschüssige Epoxidharz aus polierten Oberfläche der Faser mit einer feuchten fusselfreien Tuch vor dem Trocknen, wenn nötig. Andernfalls kann überschüssige Epoxidharz nach 12-24 Uhr entfernt werden
- Die Faser vorsichtig bis zur Kalibrierung lagern und legen Sie eine Staubkappe über die Endhülse.
2. Beleuchtung-Kalibrierung und Qualitätskontrolle
Hinweis: dieser Methoden für die Kalibrierung zu bewerten, für nicht-Linearität in unterschiedlichen Abständen von der Spitze der Faser Lichtleistung. Ungleichmäßige Lichtverteilung in der Regel ergibt sich aus einem “ holprigen ” oder “ wellig ” taper.
- Erstellen, die eine leichte Abschirmung Membran für den oberen Teil der integrierenden Kugel mit Licht absorbierenden Folie ( Abbildung 2).
Hinweis: Tragen Sie Handschuhe, wenn Umgang mit Licht absorbierenden Folie, um die Haut zu verhindern, dass Öle aus Licht reflektierende Flecken zu schaffen.- Falte 2 ” durch 4 ” Stück Licht absorbierenden Folie über auf sich selbst zu bilden eine 2 ” 2 ” Quadrat. eine alternative Methode besteht darin, schneiden Sie einen 2 ” 2 ” Platz mit einem lichtabsorbierenden Seite und einem Licht reflektierenden Seite (d. h. eine Seite von standard Alu-Folie); jedoch die Falte-Over-Methode ist sicherer, weil es eine stumpfe Kante bietet für den Umgang mit der Membran in die nächste Schritt.
- Falten Lab Klebeband oder Isolierband an den Rändern des Platzes, die Kanten nicht gefaltet zu binden. Dies hält die Seiten zusammen und schützt vor Schnittverletzungen durch scharfe Kanten.
- Ein Loch in der Mitte des Platzes mit einem 26 Gauge-Nadel durchstechen.
- Entfernen Sie die große Schraube Kappe aus der Ulbricht-Kugel und deckt die Öffnung mit der Membran. Platzieren Sie das Loch in der Mitte. Wenn die Membran mit einem Licht absorbierenden und einem Licht reflektierenden Seite erstellt wurde, legen Sie die lichtabsorbierende Seite oben und das Licht reflektierende Seite nach unten, mit Blick auf das Innere der Ulbricht-Kugel.
Hinweis: Zu verhindern, dass Staub und Schmutz in der Ulbricht-Kugel und das Loch zentriert zu halten, sichern die Membran nach außen von der Ulbricht-Kugel mit Lab Klebeband.
- Maßnahme hellen Ausgang entlang der Spitze in Schritten von 500 µm mit einem Mikromanipulator oder stereotaktischen Arm und einer Ulbricht-Kugel.
Hinweis: Schutzbrille der entsprechenden Wellenlänge sollte getragen werden, wenn der Laser eingeschaltet ist.- Verbinden Sie entgegengesetzte Ende der Faser mit einem Laser oder Licht Quelle, sondern lösen keine Licht noch Ausgang.
- Sichern den Strahler an einer stereotaktischen Halter (BAUCRably mit Lab-Band) mit der Spitze 7-10 mm unterhalb der Unterseite des Halters.
- Schraube der stereotaktischen Halter in der stereotaktischen bestückt
- Richten Sie die Spitze des Erleuchters mit dem Loch in der Mitte der Membran. Der Mikromanipulator Null, wenn die Spitze auf dem exakt gleichen Niveau wie das Zwerchfell ist.
- Schalten Sie die Raumbeleuchtung ausschalten und Null die Ulbrichtkugel.
- Auslösen des Lasers (oder andere Lichtquelle) und Messen Sie die Ausgabe der Ulbricht-Kugel mit Licht Gesamtleistung.
Hinweis: Verwenden Sie die niedrigste Lichtausbeute möglich zu Testzwecken Kalibrierung. - Senken die Faser 500 µm in der Integration von Kugel und wiederholen Sie Schritt 2.2.6.
- Weiter Absenken der Faser in der Ulbricht-Kugel und die Messung insgesamt Lichtleistung in Schritten von 500 µm bis die gesamte Lichtleistung Ebenen off
Vorsicht: Sobald die gesamte Spitze im Bereich ist, sollte insgesamt Lichtleistung einpendeln. Senken Sie die Faser nicht weiter mehr als 1-2 mm über der geätzten Tipp Länge. Wenn die Spitze die Unterseite der Ulbricht-Kugel berührt, es kann schmelzen und/oder ruinieren die Ulbrichtkugel.
- Bestätigen eine gleichmäßig geätzte Faser durch Plotten insgesamt leichte Leistung wie eine Funktion wie weit der Faser in der Ulbricht-Kugel ist, zur Bestätigung der Linearität gesenkt worden.
3. in-Vivo-Beleuchtung
Hinweis: hier werden diese Methoden mit ein Plastikmodell anstatt eines nicht-menschlichen Primaten gezeigt.
- Implantat eine 25 mm Durchmesser Aufnahme Kammer über den Bereich des Gehirns von Interesse vor Experimenten implantiert wurde.
- Führen Sie anatomische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) vor dem experimentieren. Platzieren Sie eine benutzerdefinierte Aufnahme-Raster in der Kammer und füllen Sie ihn mit sterilen chirurgischen Schmiermittel für Raster-Visualisierung und Bestimmung des Niveaus der Dura und Ziel Hirnstrukturen ermöglichen.
- Bereiten ein Turm Mikro-Laufwerk vor einzelnen Testphasen.
- Affix klemmt eine 25 Gauge Führungsrohr mit abgeschrägten Spitze in der Mitte und unten auf dem Laufwerk. Zwei Klammern werden verwendet, um sicherzustellen, dass das Führungsrohr gerade bleibt. Beide diese Klemmen können manuell verschoben werden, falls gewünscht.
Hinweis: Das Führungsrohr kann geklebt oder gelötet an den Klemmen. - Sichern den großvolumigen Strahler in die obere Klammer auf dem gleichen Laufwerk. Diese Klemme mit dem Antriebsmotor verbunden ist.
- Gewinde die großvolumigen Beleuchtung durch das Führungsrohr vollständig und bestätigen, dass die Spitze der Illuminator vorbei an die Spitze des Führungsrohres erstreckt sich.
Hinweis: Die Länge des Erleuchters, die Vergangenheit erstreckt sich die Spitze des Führungsrohres den Abstand zwischen der Dura am unteren Rand des Gehirns Zielregion, als entspricht bestimmt durch MRI. - Antiseptischen Lösung (z. B. Chlorohexidine) zu sterilisieren das Führungsrohr und Illuminator einziehen.
- Affix klemmt eine 25 Gauge Führungsrohr mit abgeschrägten Spitze in der Mitte und unten auf dem Laufwerk. Zwei Klammern werden verwendet, um sicherzustellen, dass das Führungsrohr gerade bleibt. Beide diese Klemmen können manuell verschoben werden, falls gewünscht.
- Legen Sie ein benutzerdefiniertes sterilisierte Raster innerhalb des sauberen Raumes und auf eine vorgegebene Ausrichtung mit einer Schraube an der Seite der Kammer befestigen. Das hier gezeigte Gitter hat 1 mm Abstand; jedoch kann der Abstand je nach Bedarf angepasst werden.
Hinweis: Dies sollte identisch mit dem Raster und Orientierung in der anatomischen MRT verwendet. - Sichern die stereotaktische Mikro-Laufwerkshalterung auf der Aufnahme Kammer in einer vorher festgelegten Ausrichtung.
- Einfahren durch Ziehen der Illuminator mit sterilen, stumpfen Pinzette den sterilisierten Strahler aus dem Führungsrohr. Die Spitze der Beleuchtung sollte 5-10 mm über der Spitze des Führungsrohres.
Hinweis: Die Beleuchtung wird zwischen dem Führungsrohr und der Klemme nach außen beugen. Dies schädigt nicht die flexible Beleuchtung. - Befestigen Sie das Mikro-Laufwerk an den Halter und das Führungsrohr in Ziel Raster Loch.
- Mikro-Antriebsstufe absenken, bis das Führungsrohr nur durch die Ebene der Dura ist.
Hinweis: Falls gewünscht, kann ein zweites Mikro-Laufwerk mit einer Elektrode auf der Bühne platziert und in ein anderes Netz Loch versenkt. Das lokale Feld auf diese Elektrode zeigt eine Distanz-abhängige leichte Artefakt, derer Illuminator Platzierung bestätigen. - Versuchen der untere Beleuchtung manuell mit der sterilen Pinzette.
- Gibt es keinen Widerstand, Einfahren der Illuminator 5 - 10 mm, warten Sie 10 Minuten um das Gewebe zu begleichen und wiederholen den Vorgang zu ermöglichen.
- Wenn es noch Widerstand beim zweiten Versuch immer, einfahren die Illuminator Spitze in das Führungsrohr, untere der Guide Rohr 0,25 mm, und versuchen Sie es erneut.
- Wiederholen, bis die Beleuchtung Folien durch das Führungsrohr ohne Widerstand.
- Die Beleuchtung zu senken, bis es straff ist.
Vorsicht: Drücken Sie den Strahler mit Nachdruck gegen Widerstand nicht. In diesen Fällen hat das Führungsrohr in der Regel nicht die Dura vollständig durchdrungen. Die Faser mit Nachdruck drängen wird dazu führen, dass sich biegen verhindert die Faser vom Betreten des Gehirns und möglicherweise zerstören die Spitze ( Abbildung 1 g).
- Verbinden die Zwinge am anderen Ende von der Beleuchtung mit dem größeren Optik einrichten oder Laser.
- Stellen Sie sicher, dass kein Licht für die nicht-menschlichen Primaten sichtbar ist.
- Verwenden, Black-out-Abschirmung oder Licht absorbierenden Folie vollständig umfassen die Aufnahme Türme.
- Alle optischen Verbindungen in abgeschirmten Umschläge Licht absorbierenden Folie platzieren.
- Schild alle Patchkabel mit entweder Licht absorbierenden Folie oder schwarzes Isolierband.
- Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, legen Sie eine Lockvogel Light Emitting Diode (LED) Bank der gleichen Farbe in das Experiment hinter der nichtmenschlichen Primaten verwendet und blinken die LEDs kontinuierlich bei 2,5 Hz. Dadurch wird verhindert, dass die Augen vollständig an die Dunkelheit anpassen. Gäbe es unbeabsichtigte Lichtverlust, dieses Blinklicht würde helfen, um zu verhindern, dass das Leck dienen als Verhaltensstörungen Trigger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Beleuchtung des großen Gehirn Volumen bei nichtmenschlichen Primaten ermöglicht die verhaltensrelevanten relevanten optogenetische Manipulation. Acker Et al. (2016) verwendet diese großvolumigen Strahler mit der rot-verschoben Halorhodopsin, Jaws 7 , den zeitlichen Beitrag des Feldes frontalen Auge (FEF), Speicher-geführte Sakkaden in zwei Rhesus-Affen zu studieren. Insbesondere wurden FEF Neuronen mit viralen Vektoren mit Jaws injiziert und dann beleuchtet mit Rotlicht mit den großvolumigen Strahler während der Zielpräsentation, Verzögerung oder motor Vorbereitungszeit einer Speicher-geführte Saccade Aufgabe 8. Abbildung 3 zeigt die Experiment-Bedingungen. Fehlerquoten (z.B. Fehler, Speicher-geführte Sakkaden an den richtigen Zielort auszuführen) deutlich erhöht mit Beleuchtung für Ziele in der injizierten rezeptiven Feld, aber nicht für Ziele gegenüber dem Gelände der Inaktivierung / Beleuchtung (Abb. 4a).
Zusätzlich zu den Verhaltensänderungen durch Optogenetik induziert, der großvolumigen Illuminator erlaubt für die Inaktivierung von Neuronen über die volle 2,5 mm Spannweite des Kortex (Abb. 4 c) und Lichtleitung über 4,5 mm (Abbildung 4 b), ausweislich der optisch induzierte lokales Feld möglicher Artefakt 8.
Abbildung 1 . Großvolumige Illuminator breit verteilt Licht
ein) Glasfaser/Paarung Hülse/Illuminator Schnittstelle. b) geätzte Kern und Mantel verbreiten Licht im großen und ganzen. c) -Leuchtdioden 5 mm langen geätzt Tipp. d) Vergleich der Tipp für eine herkömmliche Faser und ein großes Volumen-Beleuchtung prägt. e) Beleuchter und konventionelle optische Faser mit insgesamt Eingang Licht gleichberechtigt in 1" kubische Gehirn phantom (1,75 % Agar). f) Monte-Carlo Modelle von der mittleren Querschnitt eine großvolumige Strahler mit 3 mm Spitzenlänge (links) und eine Konvention flach gespalten Faser von gleichem Durchmesser mit gleicher Lichtleistung dichten auf ihr Licht emittierende Flächen. Finden Sie ergänzende Methoden der Acker Et Al., 2016 für die Details dieses Modells. g) defekt großvolumige Strahler mit gewellten Spitze. h) beschädigte großvolumige Illuminator Tipp aus Führungsrohr. Diese Zahl wurde geändert und teilweise vom Acker Et Al., 2016 8abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Großvolumige Illuminator Kalibrierung
Diese Zahl ist aus Acker Et Al., 2016 mit geringfügigen Änderungen abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Speicher-geführte Saccade Aufgabe mit Beleuchtung oder Sham zu unterschiedlichen Zeiten.
Diese Zahl ist aus Acker Et Al., 2016 8abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Verhaltens- und elektrophysiologische Auswirkungen der optogenetische Hemmung mit großvolumigen Beleuchtung
ein) Fehlerquoten deutlich erhöht mit Beleuchtung. b) Raster Plots, Hemmung von Neuronen, die über die 2,5 mm Dicke der Rinde zu zeigen. c) lokales Feld Potenzial zeigen eine leichte Artefakt von 4,5 mm. Für b) und c), Kontakte sind Abstand 0,5 mm Abstand über die Tiefe des Kortex, n = 426 Studien. Diese Zahl ist angepasst und vom Acker Et Al., 20168abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Während optogenetische Werkzeuge weit verbreitet sind, Krankheit und Physiologie bei Nagetieren zu studieren, hat die technische Herausforderung der leuchtenden großes Gehirn Volumen der Nutzung der Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten beschränkt. Bahnbrechende Studien an Affen große leichte Leistungsdichten (~ 100 mW/mm2 bis 20 W/mm2) verwendet, um kleine Mengen, vielleicht beleuchten < 1 mm3und gemeldeten bescheidene Auswirkungen auf das Verhalten mit erregenden Opsins im Kortex4, 9,10,11 und eine hemmende Opsin in der superior Colliculus12.
Daher wurde eine großvolumige Beleuchtung entwickelt, um Lichtleitung große Gewebe Volumes zu ermöglichen. Mit dieser Beleuchtung und die rot-verschoben Halorhodopsin, Kiefer, robust, Optogenetically-Laufwerk Verhalten in nicht-menschlichen Primaten8beobachtet.
Das hier beschriebene Protokoll kann je nach dem Zweck des Versuchs und Geometrie der Zielregion Gewebe verändert werden. Beispielsweise kann die geätzte Spitze der Faser verlängert oder verkürzt, je nach Größe der zu beleuchtenden Fläche. Die Spitze kann mit einer dickeren Spitze als beschrieben gezogen werden oder eine größere Durchmesser Faser könnte verwendet werden, um eine robustere Beleuchtung zu schaffen. Während dieses Protokoll eine geätzte Faserspitze beschreibt, ist es möglich, die Faser an der Spitze und an einem mehr distalen Segment für nicht zusammenhängende Beleuchtung zu ätzen.
Qualitätskontrollen sind ein wichtiger Bestandteil dieses Protokolls. Die Spitze des einen großvolumigen Illuminator kann gegabelt oder gewellt (Abbildung 1 g), besonders wenn es mechanisch beschädigt ist oder wenn es anfangs zu dünn gezogen wird. Um die Faser mit der richtigen Menge an Kraft konsequent ziehen, brauchen die meisten Experimentatoren ein paar Stunden Praxis. Angesichts der niedrigen Kosten der Herstellung von Fasern (empfehlen Kunststoff-Lichtwellenleiter kostet weniger als $0,03 pro Meter), viele Experimentatoren nur Fasern mit perfekten Tipps, Beschläge anbringen und daher um mindestens 30 % der Fasern für kleinere Spitze Unvollkommenheiten zu verwerfen. Ungleichmäßige Lichtverteilung entdeckt während der Kalibrierung kann durch neu Polieren der Faserspitze und neu kalibrieren der Faser korrigiert werden.
Darüber hinaus sollte die Spitze der Illuminator nach jedem Experiment überprüft werden. Wenn der Experimentator die Beleuchtung durch das Führungsrohr, Kräfte bevor das Führungsrohr die Dura vorgedrungen ist, der Illuminator krümmt sich auf sich selbst und wird es nicht geben, das Gehirn. In der Regel wird die Strahler-Spitze in diesen Fällen (Abbildung 1 h) zerstört. Abgesehen von den Widerstand zur Beleuchtung einsetzen dient das lokale Feld möglicher als Kontrolle für die richtige Beleuchtung Platzierung im Experiment. Wenn der Illuminator bis oberhalb der Dura gebogen ist, zeigt das lokale Feld möglicher nicht das charakteristische leichte Artefakt dient als einen Scheck für die richtige Beleuchtung Platzierung während des Experiments.
Während der großvolumigen Illuminator Lieferung Licht mehrere kortikale Schichten gleichzeitig ausgelegt ist, ist es nicht gut geeignet, beleuchten die oberflächlichsten kortikalen Schichten unter Schonung der tiefere Schichten oder beleuchten eine einlagige Kortex individuell. Wenn sehr räumlich bestimmten Beleuchtung gewünscht wird, kann traditionelle Fasern das Licht etwas enger zu konzentrieren oder oberflächliche Beleuchtung durch Fenster in die Dura 6 besser geeignet sein. Darüber hinaus ist die Flexibilität des großvolumigen Strahler ein Vorteil und eine Einschränkung. Im Gegensatz zu optischen Glasfasern dieser Strahler kann nicht zerbrechen im Gehirngewebe, jedoch diese Flexibilität macht es auch schwierig, den Strahler über große kortikale Distanz (z.B., 10 mm oder mehr) zu gelangen. Daher müsste ein Führungsrohr auf einer sehr tiefen Gehirnstruktur (z.B. Pulvinar), vorbei an der Dura und ins Hirngewebe bieten zusätzliche mechanische Verstärkung eingestellt werden.
Insgesamt bietet diese Methode einen wesentlichen Vorteil gegenüber vorherigen Methoden, weil es Beleuchtung der verhaltensrelevanten relevanten Gehirn Volumen bei nichtmenschlichen Primaten, ein Schlüssel zur Anpassung der Optogenetik nichtmenschlichen Primaten Studien ermöglicht. Während diese Methode in der FEF Rhesusaffen nachgewiesen wurde, funktionierte es in vielen anderen Bereichen des Gehirns und sogar in andere ähnlich große Gehirn-Arten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine
Acknowledgments
LCA nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von einer NDSEG Gemeinschaft, die NSF GRFP und die Freunde des Instituts McGovern. EP nimmt zur Kenntnis, Finanzierung, die Harry und Eunice Nohara UROP Fund, der MIT Klasse von 1995 UROP Fonds, und die MIT UROP Fund. ESB nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von NIH 2R44NS070453-03A1, die IET-Harvey-Preis und den New York Stem Cell Foundation-Robertson Award. RD erkennt Finanzierung von NIH EY017292. Michael Williams half dem Team zu organisieren und Vorräte vor Dreharbeiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1,000 °F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2X/4X magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
