Groot Volume, gedragsgestoorde relevante verlichting voor Optogenetics in niet-menselijke primaten
Summary
Een protocol bij het bouwen van een weefsel doordringende illuminator voor het leveren van licht via grote volumes met minimale diameter wordt gepresenteerd.
Abstract
Dit protocol beschrijft een groot volume illuminator, die werd ontwikkeld voor optogenetic manipulaties in de hersenen niet-menselijke primaten. De illuminator is een gemodificeerde kunststof optische vezel met geëtste tip, zodanig dat het oplichtende oppervlak > 100 x die van een conventionele vezel. Naast het beschrijven van de bouw van een groot volume hulplicht, detailleert dit protocol de kalibratie van de kwaliteitscontrole gebruikt om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling. Dit protocol wordt verder beschreven technieken voor het invoegen en verwijderen van het hulplicht groot volume. Zowel de oppervlakkige en de diepe structuren kunnen worden verlicht. Dit hulplicht groot volume hoeft niet te worden fysiek gekoppeld aan een elektrode, en omdat de illuminator is gemaakt van kunststof, niet het glas, het gewoon zal buigen in omstandigheden als traditionele optische vezels zou versplinteren. Omdat dit hulplicht licht boven gedragsgestoorde relevante weefsel volumes (≈ 10 mm3) zonder meer schade van de penetratie dan een conventionele optische vezel levert, vergemakkelijkt het behavioral studies met optogenetics in niet-menselijke primaten.
Introduction
Optogenetic instrumenten, die voor milliseconde-nauwkeurige, licht gestuurde neuronale controle zorgen worden veel gebruikt om te studeren functionele fysiologie en gedrag in knaagdieren en ongewervelde dieren. Technische uitdagingen hebben echter slechts beperkt het gebruik van optogenetics in de hersenen van de niet-menselijke primaten, die een volume van ~ 100 x groter dan de knaagdier hersenen 1 heeft.
Om te vergemakkelijken optogenetics studies in niet-menselijke primaten, een hulplicht is ontworpen om twee concurrerende doelstellingen adres: groot volume verlichting en minimale penetratie schade. Eerdere pogingen om een van deze problemen te komen op de duur van de andere. Bundels van vezels verlichten grotere volumes, maar met grotere diameter, en daarmee schade2,3. Taps toelopende glasvezels beschadiging, penetratie, maar ternauwernood focus licht aan oplichtende oppervlak < 100 µm2 – 4,5. Externe hersenen verlichting door een raam in de dura omzeilt de uitdaging van de penetratie schade en kan voor grote volume verlichting, maar het kan alleen worden gebruikt voor enkele oppervlakkige hersenen gebieden6.
Als u wilt maken een groot volume, kleine diameter illuminator (Figuur 1a), het puntje van een plastic optische vezel is warmte tapered en de kern en de bekleding zijn geëtst (Figuur 1bc). In tegenstelling tot andere taps toelopende vezels die licht naar een smal punt concentreren, kunt de etsen licht gelijkmatig ontsnappen uit de zijkanten van de stortplaats, dus licht in grote lijnen over een groot gebied (Figuur 1 de) te verdelen. Omdat de penetratie schade is evenredig aan de diameter van de penetratie, dit hulplicht heeft geen meer schade van de penetratie dan een conventionele vezel, maar het heeft > 100 x het oplichtende oppervlak gebied en levert licht meer in het algemeen met 1/100ste de lichte macht dichtheid in een hersenen phantom (1,75% agarose) (Figuur 1e). Een Monte Carlo-model (Figuur 1f) illustreert het verschil in licht verspreiden tussen een conventionele vezel en het grote volume hulplicht wanneer zij gelijke lichte macht dichtheden hebben als hun lichtdoorlatende oppervlakken. Elke illuminator is individueel gekalibreerd met behulp van een bolfotometer (Figuur 2a, b) om ervoor te zorgen zelfs lichtverdeling langs de tip (Figuur 2 c).
Dit groot volume illuminator is gevalideerd met optogenetic manipulatie van zowel gedrag en neuronale afvuren in niet-menselijke primaten. De lengte van de tip vezel kan worden aangepast naar elk willekeurig deel van de hersenen en voor elk dier individuele receptieve veld kaart. Het hulplicht kan gekoppeld worden aan een doordringende elektrode voor neuronale opnames die zich uitstrekken over de lengte van de verlichting. Verder, omdat de vezel elke kleur van zichtbaar licht kunnen, kunnen worden gekoppeld met een van de beschikbare optogenetic moleculen beschikbaar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel optogenetic tools veel gebruikt worden om te studeren ziekten, en fysiologie bij knaagdieren, heeft de technische uitdaging van verhelderend grote hersenen volumes beperkt het gebruik van optogenetics in niet-menselijke primaten. Baanbrekende studies in apen grote lichte macht dichtheden (~ 100 mW/mm2 tot 20 W/mm2) gebruikt voor het verlichten van kleine volumes, misschien < 1 mm3en gerapporteerde bescheiden gedrags effecten met excitatory opsins in de cortex4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA erkent financiering van een NDSEG-beurs, de NSF-GRFP en de vrienden van het McGovern Institute. EP erkent financiering de Harry en Eunice Nohara UROP Fonds, de MIT-klasse van 1995 UROP Fonds en het Fonds MIT UROP. ESB erkent financiering van NIH 2R44NS070453-03A1, de prijs van IET Harvey, en de New York stamcel Foundation-Robertson Award. RD erkent financiering van NIH EY017292. Michael Williams hielp het team te organiseren en leveringen vóór het filmen te verzamelen.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
