बड़ी मात्रा, व्यवहार-गैर मानव रहनुमाओं में Optogenetics के लिए प्रासंगिक रोशनी
Summary
एक प्रोटोकॉल ंयूनतम व्यास के साथ बड़ी मात्रा में प्रकाश देने के लिए एक ऊतक मर्मज्ञ प्रकाशक का निर्माण करने के लिए प्रस्तुत किया है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक बड़ी मात्रा प्रकाशक, जो गैर में optogenetic जोड़तोड़ के लिए विकसित किया गया था मानव रहनुमा मस्तिष्क । प्रकाशक एक संशोधित प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर के साथ धंसा टिप, कि प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्र है & #62; 100x कि एक पारंपरिक फाइबर की. बड़ी मात्रा में प्रकाशक के निर्माण का वर्णन करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल विवरण गुणवत्ता नियंत्रण अंशांकन भी प्रकाश वितरण सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा प्रकाशक को संमिलित करने और निकालने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है । सतही और गहरी दोनों संरचनाओं को रोशन किया जा सकता है । यह बड़ी मात्रा प्रकाशक शारीरिक रूप से एक इलेक्ट्रोड करने के लिए युग्मित होने की जरूरत नहीं है, और क्योंकि प्रकाशक प्लास्टिक से बना है, कांच नहीं, यह बस परिस्थितियों में झुकना होगा जब पारंपरिक ऑप्टिकल फाइबर टूट जाएगा. क्योंकि इस प्रकाशक के व्यवहार पर प्रकाश उद्धार-प्रासंगिक ऊतक संस्करणों (≈ 10 mm3) एक पारंपरिक ऑप्टिकल फाइबर की तुलना में कोई बड़ा प्रवेश क्षति के साथ, यह व्यवहार गैर मानव रहनुमाओं में optogenetics का उपयोग कर अध्ययन की सुविधा ।
Introduction
Optogenetic उपकरण, जो मिलीसेकंड के लिए अनुमति देते हैं-सटीक, प्रकाश चालित न्यूरॉन्स नियंत्रण व्यापक रूप से कुतर और अकशेरूकीय में कार्यात्मक फिजियोलॉजी और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, तकनीकी चुनौतियों गैर मानव रहनुमा मस्तिष्क में optogenetics का उपयोग सीमित है, जो एक मात्रा ~ 100x कुतर मस्तिष्क से बड़ा है 1।
गैर-मानव रहनुमाओं में optogenetics अध्ययन की सुविधा के लिए, एक प्रकाशक को दो प्रतिस्पर्धी लक्ष्यों को पता करने के लिए डिज़ाइन किया गया था: बड़ी मात्रा में रोशनी और न्यूनतम प्रवेश क्षति । पिछले एक इन चिंताओं का पता करने का प्रयास दूसरे के महंगे पर आ गए हैं । फाइबर के बंडलों बड़ी मात्रा में प्रबुद्ध लेकिन वृद्धि व्यास के साथ, और, इस प्रकार, नुकसान2,3. पतला ग्लास फाइबर प्रवेश क्षति को कम, लेकिन संकीर्ण रूप से प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्रों के लिए प्रकाश फोकस & #60; १०० µm2 4,5. बाडी में एक खिड़की के माध्यम से बाह्य मस्तिष्क रोशनी प्रवेश क्षति की चुनौती को दरकिनार और बड़ी मात्रा रोशनी के लिए अनुमति दे सकते हैं, लेकिन यह केवल कुछ सतही मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है6।
एक बड़ी मात्रा, छोटे व्यास प्रकाशक (चित्र 1a) बनाने के लिए, एक प्लास्टिक ऑप्टिकल फाइबर की नोक गर्मी पतला है और कोर और cladding (चित्रा 1b, सी) धंसा रहे हैं । अंय पतला फाइबर कि एक संकीर्ण बिंदु पर प्रकाश ध्यान केंद्रित के विपरीत, नक़्क़ाशी प्रकाश समान रूप से बाहर टिप के पक्षों से बचने के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार, प्रकाश वितरण मोटे तौर पर एक बड़े क्षेत्र पर (चित्र 1 d, e) । क्योंकि प्रवेश नुकसान प्रवेश व्यास के लिए आनुपातिक है, इस प्रकाशक एक पारंपरिक फाइबर की तुलना में अधिक पैठ नुकसान नहीं है, अभी तक यह & #62 है; 100x प्रकाश उत्सर्जक सतह क्षेत्र और प्रकाश बचाता है और अधिक मोटे तौर पर 1/ एक मस्तिष्क प्रेत (१.७५% agarose) (चित्रा 1e) में घनत्व । एक मोंटे कार्लो मॉडल (चित्रा 1f) एक पारंपरिक फाइबर और बड़ी मात्रा प्रकाशक के बीच प्रकाश प्रसार में अंतर दिखाता है जब वे अपने हल्के उत्सर्जन सतहों के रूप में बराबर प्रकाश शक्ति घनत्व है । प्रत्येक प्रकाशक व्यक्तिगत रूप से (चित्रा 2c) टिप के साथ भी प्रकाश वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक एकीकृत क्षेत्र (चित्रा 2a, बी) का उपयोग करने पर तुले हुए है ।
इस बड़े वॉल्यूम प्रकाशक दोनों व्यवहार और गैर-मानव रहनुमाओं में न्यूरॉन फायरिंग के optogenetic हेरफेर के साथ मान्य किया गया है । फाइबर टिप लंबाई किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र के लिए और प्रत्येक जानवर के व्यक्तिगत ग्रहणशील क्षेत्र के नक्शे के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रकाशक है कि रोशनी की लंबाई अवधि के लिए एक मर्मज्ञ इलेक्ट्रोड के साथ जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, क्योंकि फाइबर दृश्य प्रकाश के किसी भी रंग ले जा सकते हैं, यह उपलब्ध optogenetic अणुओं में से किसी के साथ जोड़ा जा सकता है उपलब्ध है ।
Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं को NIH दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी कमेटी द्वारा पशु देखभाल पर अनुमोदित किए गए थे ।
1. प्रकाशक निर्माण तेज कत?…
Representative Results
Discussion
जबकि optogenetic उपकरण व्यापक रूप से कुतर में रोग और फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, बड़े मस्तिष्क की मात्रा रोशन की तकनीकी चुनौती गैर मानव रहनुमाओं में optogenetics का उपयोग सीमित है । बंदरों में …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एलसीए एक NDSEG फैलोशिप, NSF GRFP, और McGovern संस्थान के दोस्तों से धन स्वीकार करता है । EP हैरी और Eunice Nohara उरोप कोष, १९९५ उरोप कोष के एमआईटी वर्ग, और एमआईटी उरोप कोष के धन को स्वीकार करता है । ESB NIH 2R44NS070453-03A1, चलो हार्वे पुरस्कार, और ंयूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन-Robertson पुरस्कार से धन स्वीकार करता है । आरडी NIH EY017292 से धन स्वीकार करता है । माइकल विलियंस टीम को संगठित और आपूर्ति इकट्ठा करने से पहले फिल्माने में मदद की ।
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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