Summary

Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos

Published: October 03, 2017
doi:

Summary

Se presenta un protocolo para construir un iluminador penetrante de tejido para ofrecer luz sobre grandes volúmenes con diámetro mínimo.

Abstract

Este protocolo describe un iluminador de gran volumen, que fue desarrollado para la manipulación de optogenetic en el cerebro de primates no humanos. El iluminador es una modificado fibra óptica de plástico con punta de grabado al agua fuerte, tal que la luz que emite la superficie es > 100 x de una fibra convencional. Además de describir la construcción del iluminador de gran volumen, este protocolo detalla la calibración de control de calidad para asegurar la mejor distribución lumínica. Además, este protocolo describe técnicas para insertar y retirar el iluminador de gran volumen. Estructuras superficiales y profundas pueden ser iluminadas. Este iluminador de gran volumen no necesita estar físicamente junto a un electrodo, y porque la luz está hecha de plástico, no de vidrio, simplemente se dobla en circunstancias cuando destruiría fibras ópticas tradicionales. Porque este iluminador ofrece luz sobre volúmenes de tejido conductualmente relevantes (≈ 10 mm3) sin mayor daño de penetración de una fibra óptica convencional, que facilita estudios de comportamiento usando optogenetics en primates no humanos.

Introduction

Optogenetic herramientas, que permiten un control neuronal exacto milisegundo, impulsado por la luz son ampliamente utilizadas para estudiar la fisiología funcional y comportamiento en roedores e invertebrados. Sin embargo, desafíos técnicos limitó el uso de optogenetics en el cerebro de primates no humanos, que tiene un volumen ~ 100 x más grande que el cerebro de roedores 1.

Para facilitar la optogenetics estudios en primates no humanos, un iluminador fue diseñado para abordar dos objetivos concurrentes: iluminación de gran volumen y penetración mínimo daño. Los intentos anteriores para abordar uno de estos problemas vienen en la cara del otro. Paquetes de fibras se iluminan grandes volúmenes pero con mayor diámetro y, por lo tanto, daños2,3. Fibras de vidrio afilado reducen el daño de la penetración, pero estrecho foco luz a superficies de emisión de luz < 100 μm2 4,5. Iluminación externa del cerebro a través de una ventana en la dura elude el reto de daños de penetración y puede permitir la iluminación de gran volumen, pero sólo puede ser utilizado para algunos superficiales cerebro áreas6.

Para crear un iluminador de gran volumen, de pequeño diámetro (Figura 1a), la punta de un plástico óptico de fibra es cónico y el núcleo y el revestimiento son grabadas (Figura 1bc). A diferencia de otras fibras afiladas que enfocar luz en un punto estrecho, el grabado permite que la luz escape uniformemente hacia fuera los lados de la punta, por lo tanto, distribución de luz ampliamente sobre un área grande (figura 1 de). Debido a daños de penetración son proporcional al diámetro de la penetración, este iluminador no tiene más daño de penetración que una fibra convencional, pero tiene > 100 x la luz emitiendo luz superficie de área y ofrece más ampliamente con 1/100 la potencia de luz densidad en un cerebro fantasma (1.75% agarosa) (Figura 1e). Un modelo Monte Carlo (figura 1f) ilustra la diferencia de propagación de luz entre una fibra convencional y el iluminador de gran volumen cuando tienen densidades de energía de luz igual como su superficies de emisión de luz. Cada iluminador es calibrada individualmente usando una esfera integradora (Figura 2a, b) para asegurar la distribución lumínica a lo largo de la punta (figura 2C).

Este iluminador de gran volumen ha sido validado con la manipulación de optogenetic de comportamiento y de disparo neuronal en primates no humanos. La longitud de la punta de la fibra puede ser adaptada a cualquier área del cerebro y al mapa de campo receptivo individual de cada animal. El iluminador puede ser asociado con un electrodo de penetración para grabaciones neuronales que abarcan la longitud de la iluminación. Además, porque la fibra puede llevar cualquier color de la luz visible, puede ser asociado con cualquiera de las moléculas de optogenetic disponible disponibles.

Protocol

Nota: todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con las directrices de los NIH y fueron aprobados por el Instituto de Massachusetts de tecnología Comité de cuidado Animal. 1. iluminador fabricación Use un par de tijeras afiladas para cortar un tramo de 250 μm de diámetro fibra óptica de plástico que por lo menos 10 cm de largo mayor que el deseado iluminador total. Sacar 15-20 cm de chaqueta de polietileno de un extremo de la fibra óptica de plástico c…

Representative Results

La iluminación de los volúmenes grandes del cerebro en primates no humanos permite la manipulación del comportamiento relevante optogenetic. Acker et al. (2016) utiliza este iluminador de gran volumen con la halorodopsina rojo-cambiado de puesto, las mordazas 7 para estudiar la contribución temporal del campo frontal del ojo (FEF) para Movimientos sacádicos memoria-dirigida en dos monos rhesus. Específicamente, las neuronas de la FEF fueron inyectadas con un vector viral que contien…

Discussion

Mientras que optogenetic herramientas son ampliamente utilizados para el estudio de la enfermedad y la fisiología en roedores, el desafío técnico de iluminar los volúmenes grandes del cerebro limitó el uso de optogenetics en primates no humanos. Pionera en estudios en monos utiliza densidades de energía de luz grande (~ 100 mW/m2 a 20 W/mm2) para iluminar pequeños volúmenes, tal vez < 1 mm3y efectos conductuales modestos reportados con opsins excitatorias de la corteza<sup cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LCA reconoce la financiación de una beca de la NDSEG, la GRFP NSF y los amigos del Instituto McGovern. EP reconoce financiación el Harry y Eunice Nohara UROP fondo, la clase del MIT de 1995 UROP fondo y el fondo de la UROP de MIT. ESB reconoce fondos del NIH 03A1 2R44NS070453 el Premio de Harvey del IET y el Premio de Fundación Robertson de células madre de Nueva York. RD reconoce la financiación de los NIH EY017292. Michael Williams ayudó el equipo para organizar y reunir suministros antes de la filmación.

Materials

Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1000°F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

References

  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
  3. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
  4. Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
  5. Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
  6. Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
  7. Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
  8. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
  9. Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
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  11. Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
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Cite This Article
Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

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