Summary

Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten

Published: October 03, 2017
doi:

Summary

Ein Protokoll, ein Gewebe eindringende Hilfslicht für die Bereitstellung von Licht über große Mengen mit minimalem Durchmesser bauen wird vorgestellt.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine großvolumige Illuminator, die für optogenetische Manipulationen im Gehirn von Primaten entwickelt wurde. Der Illuminator ist eine modifizierte Kunststoff-Lichtwellenleiter mit geätzten Spitze so, dass die lichtemittierenden Fläche > 100 x, die einer herkömmlichen Faser. Neben der Beschreibung des Bau der großvolumigen Illuminator, beschreibt dieses Protokoll die Qualitätskontrolle Kalibrierung verwendet, um gleichmäßige Lichtverteilung zu gewährleisten. Dieses Protokoll beschreibt weiter, Techniken für das einsetzen und Herausnehmen der großvolumigen Illuminator. Oberflächliche und tiefe Strukturen können beleuchtet werden. Diese großvolumigen Beleuchtung muss nicht physisch an einer Elektrode gekoppelt werden und weil die Beleuchtung aus Kunststoff, nicht Glas besteht, es einfach beugt sich unter Umständen beim traditionellen Lichtleitfasern zerbrechen würde. Weil dieser Strahler Licht über verhaltensorientierte relevanten Gewebe Volumen (≈ 10 mm3) ohne größere Marktdurchdringung Schaden als eine herkömmliche optische Faser liefert, erleichtert es Verhaltensstudien mit Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten.

Introduction

Optogenetische-Tools, die für eine Millisekunde-präzise, lichtgetriebenen neuronale Steuerung ermöglichen werden häufig verwendet, um funktionelle Physiologie und das Verhalten in Nagetieren und Wirbellosen zu studieren. Technische Herausforderungen haben jedoch die Verwendung der Optogenetik im Gehirn von Primaten, begrenzt, die ein Volumen ~ 100 x größer als das Nagetier Gehirn 1hat.

Zur Erleichterung der Optogenetik Studien in nicht-menschlichen Primaten ein Illuminator wurde entwickelt, um zwei konkurrierende Ziele: großvolumige Beleuchtung und minimale Penetration Schaden. Frühere Versuche, Adresse eines dieser Anliegen sind bei den teuren des anderen! Bündel von Fasern Leuchten größere Mengen aber mit größerem Durchmesser und damit Schaden2,3. Konische Glasfasern eindringen Schaden, sondern nur knapp Licht emittierende Flächen reduziert < 100 µm2 4,5. Externe Gehirn Beleuchtung durch ein Fenster in die Dura umgeht die Herausforderung der Durchdringung Schaden und kann für großvolumige Beleuchtung ermöglichen, aber es kann nur für ein paar oberflächliche Gehirn Bereiche6verwendet werden.

Erstellen Sie eine großvolumige, kleine Durchmesser Strahler (Abbildung 1a), geätzt die Spitze eines Kunststoffs optische Faser ist Hitze verjüngt und Kern und Mantel sind (Abbildung 1 bC). Im Gegensatz zu anderen konischen Fasern, das Licht zu einem schmalen Punkt konzentrieren, ermöglicht die Radierung Licht gleichmäßig aus den Seiten der Spitze, also Verteilung von Licht im großen und ganzen über eine große Fläche (Abbildung 1 de) zu entkommen. Weil eindringen Schäden proportional zum Durchmesser Eindringen ist, diese Beleuchtung keine mehr eindringen Schaden als eine herkömmliche Faser hat, aber es hat > 100 x die Licht emittierende Oberfläche und Licht im weiteren Sinne mit 1/100stel der Lichtleistung Dichte in einem Gehirn phantom (1,75 % Agarose) (Abbildung 1e). Eine Monte Carlo-Modell (Abb. 1f) veranschaulicht den Unterschied bei leichten Ausbreitung zwischen einer herkömmlichen Faser und der großvolumige Beleuchtung bei gleicher Lichtleistung dichten als ihr Licht emittierende Flächen haben. Jeder Strahler ist individuell kalibriert mit einer Ulbricht-Kugel (Abb. 2a, b), um gleichmäßige Lichtverteilung entlang der Spitze (Abbildung 2 c) zu gewährleisten.

Diese großvolumige Illuminator ist mit optogenetische Manipulation von Verhalten und neuronale feuern bei nichtmenschlichen Primaten validiert worden. Die Faserlänge Tipp kann jeder Bereich des Gehirns und jedes Tier individuelle rezeptiven Feld Karte angepasst werden. Die Beleuchtung kann mit einem durchdringenden Elektrode für neuronale Aufnahmen gekoppelt werden, die die Länge der Beleuchtung umfassen. Weiter, weil die Faser jede Farbe des sichtbaren Lichts tragen kann, kann es mit einer der verfügbaren optogenetische Moleküle zur Verfügung gekoppelt werden.

Protocol

Hinweis: alle tierische Verfahren gemäß den Richtlinien des NIH und wurden genehmigt durch Massachusetts Institute des Technology Committee on Animal Care. 1. Illuminator Herstellung ein paar der scharfen Schere verwenden, um einen Schnitt von 250 µm Durchmesser Kunststoff-Lichtwellenleiter, die mindestens 10 cm länger als die gewünschte Summe Illuminator ist. 15-20 cm von Polyethylen Jacke zu entfernen, von einem Ende der Kunststoff-Lichtwellenleiter mit einem 22 Ga…

Representative Results

Die Beleuchtung des großen Gehirn Volumen bei nichtmenschlichen Primaten ermöglicht die verhaltensrelevanten relevanten optogenetische Manipulation. Acker Et al. (2016) verwendet diese großvolumigen Strahler mit der rot-verschoben Halorhodopsin, Jaws 7 , den zeitlichen Beitrag des Feldes frontalen Auge (FEF), Speicher-geführte Sakkaden in zwei Rhesus-Affen zu studieren. Insbesondere wurden FEF Neuronen mit viralen Vektoren mit Jaws injiziert und dann beleuchtet mit Rotlicht mit den gr…

Discussion

Während optogenetische Werkzeuge weit verbreitet sind, Krankheit und Physiologie bei Nagetieren zu studieren, hat die technische Herausforderung der leuchtenden großes Gehirn Volumen der Nutzung der Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten beschränkt. Bahnbrechende Studien an Affen große leichte Leistungsdichten (~ 100 mW/mm2 bis 20 W/mm2) verwendet, um kleine Mengen, vielleicht beleuchten < 1 mm3und gemeldeten bescheidene Auswirkungen auf das Verhalten mit erregenden Opsins im …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LCA nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von einer NDSEG Gemeinschaft, die NSF GRFP und die Freunde des Instituts McGovern. EP nimmt zur Kenntnis, Finanzierung, die Harry und Eunice Nohara UROP Fund, der MIT Klasse von 1995 UROP Fonds, und die MIT UROP Fund. ESB nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von NIH 2R44NS070453-03A1, die IET-Harvey-Preis und den New York Stem Cell Foundation-Robertson Award. RD erkennt Finanzierung von NIH EY017292. Michael Williams half dem Team zu organisieren und Vorräte vor Dreharbeiten.

Materials

Plastic optical fiber Industrial fiber optics SK-10 250 micron diameter, Super Eska line
Wire stripper Klein Tools 11047 22 gauge
Vise Clamp Wilton 11104 Generic table mount vice clamp
Dual temperature heat gun Milwaukee 8975-6 570 / 1000°F
Lab marker VWR 52877
Dissection microscope VistaVision 82027-156 Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR
Lab tape VWR 89097-972 4 pack of violet color; however, tape color does not matter
Silicon carbide lapping sheet ThorLabs LF5P 5 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping sheet ThorLabs LF3P 3 micron grit, 10 pack
Aluminum oxide lapping  sheet ThorLabs LF1P 1 micron grit, 10 pack
Calcined alumina lapping sheet ThorLabs LF03P 0.3 micron grit, 10 pack
Hot knife Industrial fiber optics IF370012 60 Watt, heavy duty
Fiber inspection scope ThorLabs FS201 optional
Stainless Steel Ferrule Precision fiber optics MM-FER2003SS-265 265 micron inner diameter
1 mL syringe BD 14-823-30 Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed
Plastic epoxy Industrial fiber optics 40 0005
18 gauge blunt needle BD 305180 1.5 inch length
Lint-free wipe (KimWipe) ThorLabs KW32 available from many vendors
Light absorbing foil ThorLabs BKF12
Electrical tape 3M Temflex 1700 Optional, may substitute other brands / models
26 gauge sharp needle  BD 305111 0.5 inch length
Micromanipulator Siskiyou 70750000E may substitute other brands/models
Steretactic arm Kopf 1460 may substitute other brands/models
Laser safety goggles KenTeK KCM-6012 must be selected based on the color of laser used, example given here
Laser or other light source vortran Stradus 473-50 example of blue laser
Integrating sphere ThorLabs S142C Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D
Ultem recording chamber Crist instrument company 6-ICO-J0 Customized with alignment notch
Tower microdrive with clamps NAN DRTBL-CMS
Guide tube Custom N/A Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing
NAN driver system NAN NANDrive
Custom grid design custom custom plans available upon request
Blunt forceps FischerScientific 08-875-8A generic stainless steel blunt forceps
Digital calipers Neiko 01407A available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements.
Patch cable ThorLabs FG200LCC-custom This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application.
Clear plastic dust caps ThorLabs CAPF Package of 25
ceramic split mating sleeve Precision Fiber Products, Inc. SM-CS1140S

References

  1. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
  2. Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
  3. Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
  4. Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
  5. Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
  6. Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
  7. Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
  8. Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
  9. Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
  10. Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
  11. Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
  12. Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).

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Cite This Article
Acker, L. C., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates. J. Vis. Exp. (128), e56330, doi:10.3791/56330 (2017).

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