نقدم هنا بروتوكول المستندة إلى الفحص المجهري لتصوير عالي الدقة وإعمار الماوس بشكل ثلاثي الأبعاد الوحدة نيوروفاسكولار وحاجز الدم في الدماغ باستخدام أقسام الدماغ التعويم الحر. يسمح هذا الأسلوب للتصور والتحليل، والتقدير الكمي العضيات داخل الخلية في بي بي بي.
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو واجهة متعددة الخلايا حيوية الذي ينظم نقل الجزيئات بين الدورة الدموية والدماغ. وينظم ترانسسيتوسيس عبر BBB إيصال الهرمونات والايض والأجسام المضادة العلاجية إلى حمة الدماغ. نقدم هنا، بروتوكول الذي يجمع بين الفلورة الأقسام التعويم الحر مع الليزر الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليل الصور تصور سوبسيلولار العضيات داخل خلايا بطانية في بي بي بي. الجمع بين مجموعة البيانات هذه مع برمجيات تحليل الصور الثلاثية الأبعاد يسمح بتجزئة شبه الآلية والتحديد الكمي لحجم الشعرية والمساحة السطحية، فضلا عن عدد وكثافة من العضيات داخل الخلية في بي بي بي. يستخدم في الكشف عن الماوس الذاتية الغلوبولين المناعي (IgG) داخل حويصلات داخل الخلايا وكمياً في بي بي بي لتوضيح الأسلوب. يمكن تطبيق هذا البروتوكول يحتمل أن تكون للتحقيق في آليات مراقبة ترانسسيتوسيس BBB من جزيئات مختلفة في فيفو.
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو حاجز خلوية مستمر شكلتها astrocytes، بيريسيتيس، والخلايا العصبية، والخلايا البطانية التي تفصل بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) من دوران الدم1. تنظيم النقل عبر BBB يلعب دوراً حاسما في الحفاظ على التوازن في الدماغ، وهي وساطة من خصائص متخصصة في الدماغ خلايا بطانية (بكس). الحد من وجود الوصلات بين الخلايا ضيق بين بكس وانخفاض معدل القاعدية ترانسسيتوسيس النقل باراسيلولار وترانسسيلولار من الجزيئات المنقولة بالدم، على التوالي2. مؤخرا، قد تم تسخيرها في مسار ترانسسيتوسيس في بكس لتعزيز إيصال العلاجية الجزيئات الكبيرة إلى3،الدماغ4. ومع ذلك، آليات ترانسسيتوسيس عبر بي بي بي لم تتسم تماما5،6.
العمل المكثف الذي أنجز في المختبر فك الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم النقل داخل الخلايا عبر بكس7،،من89،10، 11، ولكن تفشل هذه النظم أن الخص بنية معقدة وفسيولوجيا لوحدة نيوروفاسكولار (NVU). من ناحية أخرى، دراسات في فيفو12،13 تقديم معلومات كمية مفصلة عن معدلات النقل عبر بي بي بي ولكنها لا توفر رؤى في آليات النقل داخل الخلايا. ولذلك، التحقيق في المكونات الخلوية وداخل الخلايا NVU في فيفو و السابقين فيفو تظل صعبة للغاية14. سوى عدد محدود من تقنيات قابلة لتحليل الهياكل سوبسيلولار داخل الخلايا NVU. معظم الدراسات استخدام الميكروسكوب الإلكتروني ولكن هذا الأسلوب محدود بالبروتوكولات المعقدة المطلوبة لإعداد الأنسجة السليمة ومعالجة عينة. ولذلك، قمنا بإنشاء منهجية استناداً إلى الفحص المجهري [كنفوكل] عالية الدقة ييسر تجهيز عينات المخ، والتحليل، والتحديد الكمي لمقصورات سوبسيلولار داخل الخلايا NVU.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي يستخدم الماوس الدماغ المقاطع التعويم الحر القيام بتصوير كمية BBB و NVU على المستويين الخلوي وسوبسيلولار. ونحن اختبار والتحقق من صحة عدد من الأجسام المضادة الصورة، وإعادة بناء NVU في ثلاثة أبعاد. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول التصوير بدقة حيود محدودة البصرية القصوى من العضيات داخل الشعيرات الدموية في الدماغ. جنبا إلى جنب مع تحليل الصورة، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق بنقل الجزيئات داخل الخلايا عبر BBB تحت ظروف تجريبية مختلفة، على سبيل المثال في نماذج المرض الماوس نيوروديجينيريشن.
ويصف البروتوكول المشار إليها أعلاه إعداد الدماغ التعويم الحر المقاطع وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، والحصول على الصور والمعلمات التحليل المجهري عالية الاستبانة من بي بي بي. وقد استخدمت هذا الأسلوب مؤخرا للتحقيق في إضفاء الطابع المحلي على جسم تسليم منصات3، نقل مفتش الذاتية عبر ال بي بي بي17، وعدم تجانس BBB عند بيريسيتي خسارة18. يمكن تعديل خطوات مختلفة في البروتوكول أن تتكيف مع الهدف المحدد لهذه التجربة. أولاً، يسهل استخدام سميكة (100 ميكرومتر) الأقسام تعاملها خلال الإجراءات إيمونوستينينج والتركيب. كما أنه يسمح للتعمير 3D الشبكة الشعرية، ووحدة نيوروفاسكولار، وتوليد الشعرية والمقاطع العرضية NVU. ومع ذلك، اختراق الأجسام المضادة داخل أقسام الأنسجة قد تختلف وبعض تلطيخ جسم يمكن أن يقتصر على الطبقة السطحية من الأنسجة القريبة من ساترة. يمكن تعديل البروتوكول عن طريق زيادة تركيز المنظفات أثناء الخطوة permeabilization و/أو طول الخطوة permeabilization لتحسين دخول جسم إلى الأنسجة. وثانيا، يمكن أن يتعرض جودة الصورة عند محاولة الحصول على صور أكثر عمقاً داخل الأنسجة (عادة ما بين 20 إلى 30 ميكرومتر تحت السطح) بسبب تشتت الضوء، فضلا عن الانحرافات البصرية من عدم تطابق الانكسار. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن الجمع بين أساليب جديدة لإزالة الأنسجة و اختراق جسم نشط20 مع هذا البروتوكول بصورة أكبر كميات من الأنسجة. ثالثا، يتم deconvolution بعد الحصول على الصور تحسين دقة الصورة المحورية. اختيار deconvolution أعمى الخوارزمية المستخدمة في هذا البروتوكول يستند إلى (ط) سهولة الاستخدام، كما مطلوب، لا قبل حساب الدالة نقطة الانتشار (الثاني) قوة لتحسين نوعية الصورة21، واﻻفتقار إلى (ثالثا) المصنوعات اليدوية في ميج هياكل داخل الخلايا بعد التنفيذ. اعتماداً على الهياكل داخل الخلايا التي تصور في العينة، قد يؤدي deconvolution خوارزميات أخرى أعلى جودة الصورة. 21،المراجع التالية22 تقديم مناقشة مستفيضة عن مزايا وقيود خوارزميات إضافية لصورة deconvolution. وأخيراً، يسمح باستخدام حزمة برامج تحليل الصورة تجزئة هياكل داخل الخلايا والشعيرات الدموية في ثلاثة أبعاد. من الواضح أن تحليل الصور لا تقتصر على البرامج المنصوص عليها في البروتوكول وحزم البديلة، على سبيل المثال تلك التي نوقشت في مرجع23، يمكن استخدامه للصور الجزء. وينبغي التحقق من مدى ملاءمة البرامج المختلفة لتحليل الهياكل داخل الخلايا عبر BBB تجريبيا بتقييم دقة تجزئة الصورة.
إذ يستند هذا الأسلوب على عينات ثابتة، فإنه لا يوفر معلومات مباشرة حول الديناميات من ترانسسيتوسيس عبر بي بي بي. بيد أنه يمكن دمجها مع24من التجارب المرة بالطبع، على سبيل المثال جزيء اهتمام بالحقن عن طريق الوريد وقياس تراكمه داخل بكس في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن، إعادة إعمار حركية النقل داخل الخلايا. وميزة هذا النهج هو أنه يتيح لتحليل مناطق الدماغ العميق، كما هو مبين في18، التي يتعذر الوصول إليها حاليا للنهج التصوير لايف إينترافيتال. هو خطوة حاسمة خلال البروتوكول الرصد الدقيق لتثبيت الأنسجة. التثبيت مع 4% يقلل PFA هائلة الاستمناع العضيات داخل الخلية والمناعية الذاتية أو محيطيا تدار17 (الشكل 1B). حد من هذا البروتوكول هو متطلباتها أجسام عالية الجودة (أي، تلطيخ غير محددة منخفض، منخفض ه) مناسبة الفلورة. شريطة أن تتوفر هذه الكواشف، يمكن تطبيق الأسلوب للتحقيق في توطين أي البروتين من الاهتمام داخل الخلايا. على سبيل المثال، استخدمت في البروتوكول لتحديد ليسوسوميس في الدماغ خلايا بطانية17. ينبغي القول أيضا أن يستند هذا البروتوكول [كنفوكل] مجهرية، تحد حيود القرار الأفقي ويتعذر حل هياكل أصغر من حوالي 175 إلى 250 نيوتن متر (الشكل 2).
الدراسات السابقة بإجراء تحليل مفصل لتكوين وحدة نيوروفاسكولار باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]25،26الخلوية. ومع ذلك، تحقق النقل داخل الخلايا في بي بي بي يعتمد معظمها على استخدام الإرسال الميكروسكوب الإلكتروني19،،من2728. بينما يقدم هذا الأسلوب أعلى دقة أفقية من هياكل داخل الخلايا، يبقى الميكروسكوب الإلكتروني تقنية صعبة مع انخفاض الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، عدد أهداف جزيئية مختلفة التي يمكن تصور قبل م محدودة للغاية. هذا البروتوكول يوفر بديلاً موجوداً للتحقيق في النقل داخل الخلايا في بي بي بي. كاملة، من جمع الدماغ لتحليل الصور، يمكن إجراء في 5 إلى 6 أيام. إذا كانت تتوفر الأجسام المضادة المناسبة، الفلورة يسمح الكشف المتزامن لخلية متعددة الأنواع/الجزيئات داخل نفس العينة. وعلاوة على ذلك يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع تقنيات الفحص المجهري القرار فائقة للتغلب على القيود الواردة في القرار المكانية29. عموما، يمكن البروتوكول المذكورة أعلاه التحديد الكمي للتغييرات في التعريب داخل الخلايا من البروتينات ذات الاهتمام داخل وحدة نيوروفاسكولار. تطبيقه للاضطرابات الوراثية أو صيدلانية مختلفة سيسمح التحقيق مهام الهيكل والنقل داخل الخلايا من بي بي بي في فيفو.
The authors have nothing to disclose.
وأيد زيانغيانغهونغ عمل “زمالة ما بعد الدكتوراه روش” (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |